2025, Vol. 49
文章信息
- 郑小宇, 徐雨, 徐奎栋, 类彦立, 詹子锋. 2025.
- ZHENG Xiaoyu, XU Yu, XU Kuidong, LEI Yanli, ZHAN Zifeng. 2025.
- 基于环境DNA与影像技术的卡罗琳海山八放珊瑚多样性研究
- Integrating environmental DNA and imaging techniques to study octocoral diversity on the Caroline Seamount
- 海洋科学, 49(8): 63-70
- Marine Sciences, 49(8): 63-70.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250305002
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文章历史
- 收稿日期：2025-03-05
- 修回日期：2025-04-28
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
八放珊瑚隶属于刺胞动物门、珊瑚亚门、八放珊瑚纲, 目前已知有超3 500种[1]。八放珊瑚是深海脆弱生态系统的核心代表类群之一, 其构建的“珊瑚林”为众多大型底栖动物提供重要的栖息场所和营养来源[1-2]。然而, 近年来渔业拖网、采矿等人类活动和气候变化对深海环境造成巨大影响[3-4]。由于八放珊瑚生长缓慢和寿命长的特点, 一旦造成破坏可能导致生态系统难以恢复[1, 5]。因此, 获取现有八放珊瑚群落的多样性、分布和丰度的基础数据, 是深海生态系统有效管理和保护的关键。
海山通常指海平面下高度超过1 000 m的海底隆起[6], 特殊的地理和水文条件造就其独特的生物群落结构, 是研究大型生物多样性的天然实验室[7]。海山在全球大洋中广泛分布, 特别是热带西太平洋地区数量众多, 但相关研究较少[8]。卡罗琳海山是西太平洋的一座代表性海山, 其生物多样性研究主要集中在浮游生物和微生物[9–11], 而对大型动物的基线信息严重缺乏, 尤其对八放珊瑚多样性的研究几乎空白。目前, 八放珊瑚调查主要依靠潜水器的原位影像观测, 但这种调查手段成本高昂, 费时耗力, 且常受限于水下潜水器的视野和工作深度范围, 而且物种鉴定只能依靠外部形态学观察[12-13]。同时, 珊瑚表型变异、生长性状的可塑性以及趋同进化现象的存在[14-15], 为基于影像观测的物种鉴定带来了诸多挑战。
近年来, 环境DNA宏条形码(eDNA metabarcoding)技术作为一种新兴的技术, 可以有效弥补传统调查方法短板。该技术通过捕获自然环境中许多物种基因组遗留下的DNA, 利用高通量测序技术快速高效地调查自然群落物种组成, 对环境干扰小[16-17]。这种方法使得全面分析深海海山八放珊瑚多样性格局成为可能。为提高调查效率和探索新的技术途径, 本研究结合DNA宏条形码技术和影像技术, 对卡罗琳海山的八放珊瑚进行多样性调查, 旨在深入探讨eDNA metabarcoding技术在海山调查中的可行性, 为海山珊瑚多样性的检测和保护提供了新的见解和方法。
1 材料和方法 1.1 环境DNA收集2019年6月, 科学号(R/V KeXue, Science)在热带西太平洋开展综合科考期间, 利用“发现”号水下缆控潜器(Remotely Operated Vehicle, ROV)从卡罗琳海山(140°10′16″E, 10°30′50″N)采集了40份海水样本(图 1, 表 1), 深度范围813~2 245 m。采样时, ROV潜至指定站位, 利用搭载的电控采水器采集2瓶水样品, 每瓶5 L水, 每站位总取水10 L。ROV回收后, 水样通过孔径0.22 µm白色MF-Millipore®滤膜过滤, 过滤完成后置于−80 ℃超低温冰箱保存, 直至DNA提取。
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| 图 1 西太平洋卡罗琳海山站位图 Fig. 1 Sampling locations on the Caroline Seamount in the Western Pacific |
| 站点 | 日期 | 经纬度 | 深度/m |
| D209-4 | 2019/5/27 | 140°12′11″E, 10°04′41″N | 970 |
| D218-1 | 2019/6/6 | 140°14′25″E, 10°07′15″N | 817 |
| D219 | 2019/6/7 | 140°14′34″E, 10°06′10″N | 1 160 |
| D222-1 | 2019/6/10 | 140°09′24″E, 10°04′44″N | 1 878 |
| D226-1 | 2019/6/14 | 140°04′04″E, 10°38′14″N | 1 912 |
| D226-2 | 2019/6/14 | 140°04′17″E, 10°37′59″N | 1 611 |
使用All-Prep DNA/RNA Mini Kit(Qiagen, Germany)提取滤膜上的DNA, 操作按照说明书进行。PCR扩增的目的片段为八放珊瑚线粒体错配修复蛋白编码基因(mtMutS), 引物序列为Octo_eDNA_Mut2F (5’-GCTTA TCCAGATTGGTAAGTTCTATGAA-3’)和Octo_eDNA_ Mut2R (5’-ACAGTCCTCTAAATTACAACTAGGAGAAT A-3’)[16]。为了提高扩增效率和最小化PCR偏好性, 使用高保真性聚合酶KOD One PCR Master Mix/KOD One TM PCR Master Mix-Blue。PCR反应条件如下: 3 min 94 ℃预变性, 94 ℃变性10 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 35个循环, 72 ℃延伸5 min。文库构建使用TruSeqc®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit, 按说明操作。构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量检测, 文库合格后, 使用NovaSeq 6000产生250 bp成对末端读段, 使用Illumina NovaSeq平台进行双端(paired-end)测序。文库构建和测序均由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
1.3 注释数据库构建为了将测序结果最大限度鉴定到最低分类学水平和减少搜索比对时间, 我们构建一个mtMutS参考数据库。具体步骤如下: 1)使用Biopython包[18]检索和下载带有关键词Octocorallia、mtMutS、MutS和msh1的所有序列; 2)使用Usearch命令[19]提取八放珊瑚特异性引物匹配长度600 ~ 1 000 bp的序列片段; 3)依据WoRMS网站提供最新的八放珊瑚分类系统[20]进行注释; 4)针对多个相近种目标片段序列相同的情况, 仅保留1条序列, 将对应的物种信息合并(种名间用“/”分隔)。
1.4 数据分析根据条形码序列从下机数据中拆分出各样本数据。为了获得高质量的扩增子序列变体(Amplicon sequence variant, ASV), 我们使用DADA2 v1.28.0流程[21], 具体步骤参考DADA2官方网站(https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html)。首先, 通过Fastp软件[22]移除原始读段(raw reads)的条形码和引物序列生成干净读段(clean reads)。随后, 使用DADA2流程中filterAndTrim、derepFastq、mergePairs、makeSequenceTable和removeBimeraDenovo函数对clean reads进行低质量序列和模糊碱基过滤、推断ASVs、合并双端序列、构建特征表和去除嵌合体。使用Blastn软件将生成的ASVs与构建好的mtMutS数据库进行比对, 完成分类注释(表 2)。在种水平的分类中, 要求对ASVs的分类注释具有100%的查询覆盖率和100%的相似度; 属水平的分类要求至少具有98%的相似度; 其余的ASVs则归类为科或科水平以上。这些严格的标准确保了ASVs分类学注释结果的准确性和可靠性。基于特征表和分类信息分析八放珊瑚多样性组成。
| 站位 | 总读数 | 过滤后的读数 | 去噪的正向读数 | 去噪的反向读数 | 组装后的重叠数 | 非嵌合体数 | ASV |
| D209-4 | 88 933 | 79 553 | 79 521 | 79 521 | 79 384 | 77 934 | 7 |
| D218-1 | 87 909 | 77 863 | 77 856 | 77 859 | 77 837 | 77 812 | 23 |
| D219 | 93 776 | 83 849 | 83 817 | 83 820 | 83 705 | 83 588 | 17 |
| D222-1 | 90 331 | 79 912 | 79 907 | 79 908 | 79 897 | 79 871 | 9 |
| D226-1 | 90 442 | 79 152 | 79 144 | 79 145 | 79 111 | 79 111 | 13 |
| D226-2 | 100 927 | 91 170 | 91 076 | 91 165 | 90 996 | 90 972 | 21 |
每个潜次ROV均从较低深度向山顶方向爬坡行进, 记录样本采集现场及其周边环境的高清视频(图 1)。考虑到eDNA水中扩散能力, 本研究以每个采水点为中心, 上下共50 m深度范围作内的视频为该站点的分析范围。在不知晓eDNA分析结果的前提下, 本研究八放珊瑚的多样性和丰度估计由分类学专家基于高清视频完成, 主要依据以下形态学特征, 包括珊瑚轴结构组成、整体生长形式和珊瑚虫形态与分布排列[23-25]。由于仅获取到少数珊瑚标本进行超微结构观察和比较, 视频中大部分珊瑚个体仅能鉴定到属或更高阶元水平, 仅有少数形态物种能够鉴定到物种水平。
2 结果 2.1 注释数据库概述本研究构建的注释参考数据库包含2 618条mtMutS序列, 涵盖2目80科271属2 309种八放珊瑚, 其中690条为合并注释序列。在目级分类单元中, 柔软珊瑚目(Malacalcyonacea)和硬软珊瑚目(Scleralcyonacea)分别包含1 327条序列和1 275条序列, 占总序列量的99.4%。科级分类单元下, 丑柳珊瑚科(Primnoidae)以296条序列位居首位, 其次为金柳珊瑚科(Chrysogorgiidae, 236条), 棘柳珊瑚科(Acanthogorgiidae, 195条), 角柳珊瑚科(Keratoisididae, 181条), 丛柳珊瑚科(Plexauridae, 168条), 红珊瑚科(Coralliidae, 157条), 指软珊瑚科(Sinulariidae, 150条), 肉芝软珊瑚科(Sarcophytidae, 143条), 柳珊瑚科(Gorgoniidae, 113条)和羽珊瑚科(Xeniidae, 97条), 以上为数据库中序列数量最多的前10科。
2.2 基于eDNA分析的八放珊瑚多样性在卡罗琳海山不同水深收集的40份水样中, 仅有6个站位水样(D209-4、D218-1、D219、D222-1、D226-1、D226-2成功地完成mtMutS的扩增和测序。基于Illumina测序平台, 八放珊瑚eDNA数据集包含552 318个读段, 每份样本的平均读段数为92 053。样本中平均有96.57%的读段质量得分较高(≥30, 表 2)。稀释曲线趋向于饱和, 表明6个样本测序充分(图 2)。原始读段数据经DADA2处理后得到了65个ASVs, 每个站位的ASVs在7~23个之间, 平均为15个。这些ASVs隶属于2目11科19属, 其中金柳珊瑚科的多样性最高, 有16个ASVs(25%), 其次是棘柳珊瑚科(15个ASVs, 占23%)、角柳珊瑚科(13个ASVs, 20%), 其他类群的ASVs占32%(图 3a)。不同站位八放珊瑚科组成差异很大, 相对丰度最高的科依次是角柳珊瑚科(35%)、金柳珊瑚科(19%)、棘柳珊瑚科(18%)和水晶珊瑚科(Aquaumbridae), 占15.7%(图 4)。卡罗琳海山α多样性见表 3, Shannon指数为0.04~1.74, Simpson指数为0.01~0.68, 两者趋势基本一致。
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| 图 2 基于序列reads数的eDNA样本稀释曲线 Fig. 2 Rarefaction curves plotted based on the sequence read counts of the eDNA samples 注: 实线和虚线分别表示内插数据和外推数据 |
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| 图 3 根据eDNA和影像调查得出的卡罗琳海山八放珊瑚的分类组成 Fig. 3 eDNA and visual survey-based taxonomic composition of the octocorals collected from the Caroline Seamount 注: (a) 基于eDNA调查的八放珊瑚ASV丰富度, 矩形大小表示ASV数量; (b) 基于影像技术调查的八放珊瑚形态种丰富度 |
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| 图 4 基于eDNA和影像调查数据卡罗琳海山八放珊瑚在科水平上的优势物种相对丰度 Fig. 4 eDNA and image survey-based family-level relative abundances of the dominant octocoral species obtained from the Caroline Seamount |
| 站位 | 环境DNA | 影像分析 | |||
| 香农指数 | 辛普森指数 | 香农指数 | 辛普森指数 | ||
| D209-4 | 0.20 | 0.07 | 2.07 | 0.83 | |
| D218-1 | 0.36 | 0.12 | 1.39 | 0.75 | |
| D219 | 0.33 | 0.12 | 1.89 | 0.81 | |
| D222-1 | 0.59 | 0.28 | 1.83 | 0.82 | |
| D226-1 | 0.04 | 0.01 | 1.48 | 0.66 | |
| D226-2 | 1.74 | 0.68 | 2.21 | 0.86 | |
对6个eDNA站位的视频影像进行分析, 共鉴定出29个形态种, 隶属于2目6科11属, 其中金柳珊瑚科的多样性最高, 有12种(41%), 其次是丑柳珊瑚科(8种, 占27.5%)、角柳珊瑚科(4种, 13.8%), 其他科占17.7% (图 3b)。相对丰度最高的科依次是金柳珊瑚科(34.4%)、丑柳珊瑚科(29.4%)、红柳珊瑚科(19%)和角柳珊瑚科, 占15.4%(图 4)。八放珊瑚的Shannon指数为1.39~2.21, Simpson指数0.66~0.86, 两者趋势基本一致(表 3)。各站位观察到的形态种数量为4~16个。为保证与eDNA结果在空间尺度上的一致性, 本研究以每个采样点为中心、上下共50 m范围内的视频影像区域为单位, 视频覆盖宽度约6.9 m的带状区域为单位(面积约为50 m× 6.9 m=345 m²), 统计该范围内观察到的八放珊瑚个体数与种类数。在此尺度下, D226-2采样区域附近观察到较高丰度和多样性的八放珊瑚群落(16种, 181个), 而其他采样区域则观察到零星分布的八放珊瑚个体(图 1)。D218-1的多样性(4种)和丰度(4个)最低。
2.4 两种方法的结果比较环境DNA和影像数据共检测到2目13科21属。其中, 4个科(金柳珊瑚科、角柳珊瑚科、丑柳珊瑚科和棘柳珊瑚科)被2种方法均检测到。仅通过eDNA检获的7个科为花羽海鳃科(Anthoptilidae)、水晶珊瑚科(Aquaumbridae)、波罗海鳃科(Balticinidae)、棒花软珊瑚科(Clavulariidae)、伪竹柳珊瑚科(Isidoidae)、丛柳珊瑚科(Plexauridae)和紫柳珊瑚科(Victorgorgiidae)。影像技术识别出eDNA没有检测到的红珊瑚科(Coralliidae)和原羽海鳃科(Protoptilidae)(图 5a)。在所有站位中, 2种调查方法检测出的优势科组成不一致(图 4)。除D209-4外, 其余站位通过eDNA检测到的物种数量均多于影像资料调查结果(图 5b)。基于eDNA分析的Shannon指数和Simpson指数均小于影像资料获取的结果(表 3)。
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| 图 5 基于eDNA与影像技术的八放珊瑚科级多样性比较 Fig. 5 Comparative analysis of octocoral diversity at the family level using eDNA and imaging techniques |
本研究通过环境DNA宏条形码技术和影像分析对卡罗琳海山的八放珊瑚多样性进行了综合分析。两种方法均成功检测到热带西太平洋深海常见的八放珊瑚类群, 如金柳珊瑚科(Chrysogorgiidae)、角柳珊瑚科(Keratoisididae)、丑柳珊瑚科(Primnoidae)和棘柳珊瑚科(Acanthogorgiidae), 表明这些类群在该区域具有重要的生态地位。然而, 两种方法在多样性检测和群落结构分析上存在明显差异, 反映各自方法的优势与局限。
影像分析作为深海大型生物多样性调查的主要手段, 能够直接获取珊瑚的珊瑚群落结构特征和空间分布信息, 尤其适用于形态特征明显的类群。例如, 在D218-1和D219站位, 影像技术清晰揭示金柳珊瑚科、角柳珊瑚科等各类群的丰度特征, 而eDNA分析仅显示水晶珊瑚科和棘柳珊瑚科为最主要类群, 其他类群的相对丰度较小或未被检出(图 4)。然而, 影像技术也面临一些挑战, 如对透明或微小珊瑚的检测能力有限, 且高度依赖分类专家的形态学鉴定, 导致时间和经济成本随调查范围的扩大而显著增加[12-13]。与之相比, eDNA技术在深海生物多样性监测中展现出较高的灵敏度和覆盖能力。近年来, 该技术已应用于深海鱼类、无脊椎动物等群落的调查[16, 26-27], 尤其在传统方法难以触及或观察条件受限的区域(如海山、大陆架), 弥补了视觉调查探测率低的不足。通过对水体中生物遗传物质的检测, eDNA可用于快速识别环境中的隐匿类群, 已成为深海生态系统研究的重要补充手段。
环境DNA宏条形码技术在八放珊瑚多样性检测中的灵敏度和覆盖范围明显优于影像技术。本研究中, eDNA方法检测到的八放珊瑚科和属的数量显著高于影像技术, 共发现65个分子种, 涵盖11科19属, 而影像技术仅识别出29个形态种, 涉及6科9属。此外, eDNA技术能够检测到影像技术难以观测的隐匿物种[17], 如水晶珊瑚科(Aquaumbridae), 这可能与其透明或半透明的特征有关[20, 28], 从而在影像调查中被遗漏。这也反映eDNA技术在揭示深海珊瑚多样性方面具有独特优势。
然而, eDNA技术在应用过程中也具有局限性。首先, 八放珊瑚的eDNA扩增效率较低, 本研究中仅有6份水样成功完成扩增和测序, 这可能与海山周围复杂的洋流导致的eDNA分布不均有关。此外, 不同珊瑚类群释放eDNA的能力存在差异, 某些物种(如红珊瑚科)可能因释放的eDNA量较少而难以被检测到[16, 27, 29]。较低的eDNA扩增成功率限制了对卡罗琳海山群落结构的全面评估, 凸显了单一方法在珊瑚多样性研究的不足。其次, eDNA技术在物种定量方面存在局限性, 难以精确反映物种的实际丰度。例如, 在D218-1和D219站位, eDNA分析显示仅有金柳珊瑚和棘柳珊瑚的相对丰度较高, 但影像技术揭示其它丰度较高类群的存在, 表明eDNA分析可能掩盖部分物种的真实丰度特征。此外, eDNA技术还面临数据库准确性和完整性的限制[30]。当前mtMutS参考数据库仍不完善, 尤其西太平洋区域的八放珊瑚的条形码信息仍显不足, 进而影响珊瑚注释的准确性, 本文的eDNA注释大部分局限于属或科水平, 仅有少量ASVs注释到种级水平。
综上所述, 环境DNA宏条形码技术和影像分析在深海八放珊瑚多样性研究中具有互补性。影像技术能够直观反映珊瑚的丰度特征和空间分布, 而eDNA技术则在检测隐匿物种和稀有类群方面表现出更高的灵敏度。本研究表明, 二者结合能够更全面地揭示深海珊瑚群落的特征, 有效弥补各自方法的局限性, 从而构建更全面、准确的多样性评估体系。未来研究应继续优化eDNA样本的提取与扩增流程, 提高其在复杂深海环境中的适应性与重复性。同时, 推动eDNA和影像技术的深度结合, 有助于更深入地理解深海珊瑚生态系统的多样性和动态变化。
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