2025, Vol. 49
文章信息
- 申春琴, 刘松, 代娆, 邢荣娥, 陈晓琳, 王铠露. 2025.
- SHEN Chunqin, LIU Song, DAI Rao, XING Ronge, CHEN Xiaolin, WANG Kailu. 2025.
- 不同脱乙酰度壳寡糖β-氨基丁酸衍生物的制备及其抗盐活性研究
- Preparation of chitosan oligosaccharide β-aminobutyric acid derivatives with different degrees of deacetylation and their salt tolerance activity
- 海洋科学, 49(8): 71-83
- Marine Sciences, 49(8): 71-83.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20250410001
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文章历史
- 收稿日期：2025-04-10
- 修回日期：2025-05-23
2. 青岛海洋科技中心 海洋药物与生物制品功能实验室, 山东 青岛 266237;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Functional Laboratory of Marine Drugs and Bioproducts, Qingdao Marine Science and Technology Center, Qingdao 266237, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
土壤盐渍化已成为全球农业可持续发展的主要限制因素之一。根据FAO《全球盐渍土现状》报告, 全球盐渍土总面积为13.81亿公顷, 约占全球陆地面积的10.7%, 其中盐渍化耕地面积超过8.33亿公顷[1]。经济日报报道显示, 我国盐渍土面积约1亿公顷, 其中3 000多万公顷具有开发利用潜力。小麦是全球重要的粮食作物, 可作为盐碱地主栽品种, 其生长和产量对盐胁迫极为敏感。土壤含盐量大于0.4%即显著抑制小麦种子萌发、根系发育及生物量积累, 导致小麦严重减产[2-3]。因此, 开发高效抗盐技术提高小麦抗盐能力对保障粮食安全至关重要。
近年来, 外源物质调控作物抗逆性成为研究热点。外源施加脯氨酸[4]、β-氨基丁酸[5-6]、壳寡糖[7]、H₂S[8]以及脱落酸[9]、水杨酸[10]等植物激素均能缓解盐胁迫对小麦的损伤, 有助于增强其抗盐性。大量研究证明, β-氨基丁酸(BABA)能通过提高抗氧化酶活性、渗透调节、增强膜稳定性及信号调控等途径增强植物胁迫耐受性[5-6, 11-12], 并表现出较其结构类似物α-氨基丁酸与γ-氨基丁酸更显著的抗逆性[12]。盐胁迫下, BABA通过ABA途径诱导逆激基因上调, 并激发烟草体内抗氧化系统提高耐盐性[6]; 通过积累水杨酸、腺苷以及三羧酸循环(TCA)主要代谢物, 激活植物抵御胁迫的信号通路[5]; BABA预处理能显著提高盐胁迫下大麦的相对含水量和干物质量, 诱导大麦根部抗氧化酶(CAT、POD、SOD)、PR蛋白及分子伴侣(热激蛋白HSC70、亲环素)显著上调, 增强大麦对盐胁迫的防御响应[11]。壳寡糖(COS)及其衍生物因其独特的生物活性, 近年来在植物抗逆调控领域备受关注。已有研究证实, 壳寡糖可有效提升苹果幼苗[13]、白三叶草[14-15]及黄连[16]等植物的胁迫耐受性。壳寡糖分子链上富含活泼的氨基和羟基, 可通过化学修饰与不同功能基团结合, 从而赋予其更高的生物活性或新功能特性。经化学修饰合成的苯胺类壳聚糖席夫碱, 其羟基自由基、超氧阴离子和DPPH自由基清除能力显著提高, 表现出优异的抗氧化活性[17]。N-琥珀酰壳聚糖通过促进玉米叶面气体交换, 同步提高酚类物质与渗透调节剂含量抵御干旱[18], 而壳寡糖硫酸酯则通过维持光合器官结构完整性, 显著增强盐胁迫下小麦的光能转化效率[19]。除化学修饰外, 壳寡糖脱乙酰度(DD)和分子量等核心参数对其生物活性也具有重要影响。Zou等[7]研究发现, 分子量为1 300 Da的壳寡糖诱导小麦抗盐活性的脱乙酰度排序为: DD50% > DD32% > DD71% > DD98%, 其生物学效应高度依赖于脱乙酰度的调控。
最新研究表明, β-氨基丁酸(BABA)与壳寡糖(COS)进行偶联能显著增强其协同抗逆效应。Yin等[20]合成的壳寡糖β-氨基丁酸(COS-BABA)衍生物使干旱胁迫下小麦干质量提高77.58%, 王文芸等[21]开发的COS-BABA衍生物则使盐胁迫下小麦干质量增加65.9%, 均表现出显著的协同增效作用。然而, 现有研究多以单一脱乙酰度壳寡糖为载体, 主要聚焦于分子量、接枝率等参数优化, 脱乙酰度对COS-BABA衍生物抗逆活性的调控研究尚未见报道。基于此, 本研究拟通过可控乙酰化技术调控脱乙酰度, 结合氨基丁酸羧基定向偶联策略, 制备不同脱乙酰度COS-BABA衍生物, 并采用浸种-浸根模式评估其缓解小麦盐胁迫的效应, 阐明脱乙酰度对衍生物抗盐活性的影响, 为壳寡糖分子精准改造及新型植物抗盐制剂开发提供理论支撑。
1 材料与方法 1.1 主要试剂壳寡糖(COS, 分子量为2 153 Da, 脱乙酰度为92.02%)、β-氨基丁酸(BABA)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)购自上海源叶生物科技有限公司; N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、吗啉乙磺酸(MES), 阿拉丁; 硝普钠(SNP)、苯酚, 索莱宝; 乙酸酐、甲醇、无水乙醇、氯化钠, 国药集团; 过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒, 索莱宝; 即用型透析袋(100~500 Da), 美国Spectrum; 小麦种子(长丰2112)。
1.2 主要仪器设备电导率仪、pH计、冷冻干燥机、紫外可见分光光度计、酶标仪、高速冷冻离心机、旋转蒸发仪、磁力搅拌器、电子天平、恒温水浴锅、人工气候箱、红外光谱仪、核磁共振光谱仪、有机元素分析仪。
1.3 研究方法 1.3.1 制备不同脱乙酰度壳寡糖参照文献乙酰化方法[22-23], 调整反应液浓度、反应时间、反应液pH以制备特定脱乙酰度壳寡糖。最终以甲醇-水(1∶1, V/V)作为反应溶剂, 按照1 g∶25 mL投5 g壳寡糖, 分别加入2.21 mL、1.16 mL、0.47 mL乙酸酐, 室温反应20 h后旋蒸浓缩并冻干, 获得不同脱乙酰度壳寡糖, 其脱乙酰度依据1H-NMR进行计算。
1.3.2 不同脱乙酰度COS-BABA衍生物的合成COS-BABA衍生物的合成参照Yin[20]的羧基偶联策略: 按壳寡糖与β-氨基丁酸物质的量1∶1.7投料, 将1.55 g β-氨基丁酸、8.63 g EDC·HCl及5.18 g NHS溶于100 mL MES缓冲液(0.1 mol/L, pH 5.5)中, 室温磁力搅拌3 h活化羧基后, 加入1.5 g不同脱乙酰度壳寡糖, 持续反应36 h。反应液经旋蒸浓缩后, 以截留分子量100~500 Da透析袋纯化5 d, 冻干获得目标衍生物, 其结构通过FT-IR、1H-NMR、13C-NMR进行表征。合成过程中通过调控壳寡糖/β-氨基丁酸物质的量之比及反应时间, 确保接枝率相对一致, 并通过有机元素分析验证接枝率。合成路线如图 1所示。
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| 图 1 壳寡糖与β-氨基丁酸酰胺化合成路线 Fig. 1 Amidation route of chitosan oligosaccharide and β-aminobutyric acid |
衍生物抗盐活性的研究采用浸种-浸根模式进行, 共设置12个处理组, 各处理组浸种液、催芽液及培养液情况如下表 1所示。除SNP组浸种液浓度为0.08 mmol/L外, 其余外源物质处理组浸种液浓度为500 mg/L。
| 处理组 | 浸种液 | 催芽 | 培养液 |
| CK | 水 | 水 | Hoagland营养液 |
| NaCl | 水 | 100 mmol/L NaCl | Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl |
| SNP | SNP | 100 mmol/L NaCl | Hoagland营养液+0.08 mmol/L SNP |
| BABA | BABA | 100 mmol/L NaCl | Hoagland营养液+100 mmol/L NaCl+20 mg/L样品 |
| 37A | 37A | ||
| 46A | 46A | ||
| 68A | 68A | ||
| 92A | 92A | ||
| 37-B | 37-B | ||
| 46-B | 46-B | ||
| 68-B | 68-B | ||
| 92-B | 92-B | ||
| 注: 37A、46A、68A、92A分别指脱乙酰度为37.3%、46.4%、68.3%及92.02%的壳寡糖原料; 37-B、46-B、68-B、92-B依次表示37A、46A、68A、92A分别与β-氨基丁酸(BABA)接枝的衍生物 | |||
浸种: 各处理组分别选取约300粒颗粒饱满、大小均一的小麦种子, 室温下浸泡在25 mL对应浸种溶液中10 h。
催芽: 将浸种后的种子腹股沟朝下摆放在置于一次性培养皿中的12目尼龙网上, 除正常组(CK)外, 均加入100 mmol/L NaCl溶液至浸没种子的1/2, 每个培养皿摆放50粒种子, 每个处理组3个重复。25 ℃避光催芽, 期间持续补充相应水分及盐溶液。
水培: 待长出的根自尼龙网孔向下扎至培养皿底时, 将发芽种子连同尼龙网一并移入种植杯中, 加入对应培养液至浸没种子的1/2, 水培至两叶一心期后取样测定相关指标。此阶段在光照培养箱中进行, 期间每天定时补加培养液至没过尼龙网, 每3 d更换一次培养液。
培养箱参数: 光照周期(昼14 h/夜10 h)、温度(昼25 ℃/夜20 ℃)、光照强度(昼80%/夜0%)、湿度全天70%。
1.3.4 抗盐相关指标测定生物量指标: 每个重复随机取10株小麦, 分别测定根长、苗高、苗鲜质量, 洗净后的幼苗105 ℃杀青1 h, 烘干至恒重后测定干质量。
光合色素含量: 参考李合生等[24]、尹秀晶等[25]的方法, 4 ℃无水乙醇提取24 h后测定OD665、OD649、OD470, 按对应公式分别计算叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量。
电解质渗出率: 电导率仪分别测定室温浸泡5 h及煮沸15 min后小麦鲜样电导率, 根据式(1)计算电解质渗出率:
| $ E(\%)=C_{\mathrm{S}} / C_{\mathrm{B}} \times 100, $ | (1) |
其中, E为电解质渗出率, CS为浸泡液电导率, CB为煮沸后电导率。
可溶性糖含量: 采用苯酚-浓硫酸法[26]测定485 nm波长下新鲜小麦第二片真叶提取液的吸光度, 根据标准曲线计算叶片中可溶性糖含量。
抗氧化酶活性: 取小麦第二片真叶, 液氮速冻研磨成粉, −80 ℃保存备用。采用试剂盒法分别测定叶片中过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性, 具体步骤见说明书, 酶活单位以每分钟每克组织催化底物变化量表示。
1.4 数据分析各指标测定数据以平均值±标准误差的形式表示, 采用SPSS 26进行单因素方差分析, 并基于LSD法进行多重比较。显著性水平P为0.05, 显著性差异组间用字母标记法区分, 柱状图中字母完全不同代表具有显著性差异(P≤0.05)。
2 结果分析 2.1 COS-BABA衍生物结构表征 2.1.1 傅里叶变换红外光谱测定β-氨基丁酸(BABA)接枝到壳寡糖(COS)上合成新衍生物(COS-BABA)的红外光谱如图 2所示。根据红外图(图 2), 1 593 cm–1处吸收峰是壳寡糖N-H弯曲振动的表现, 对应-NH2基团, β-氨基丁酸对其改性后该处峰消失, 并在1 630~1 640 cm–1及1 540~1 550 cm–1处出现两个新峰, 分别对应酰胺Ⅰ带(C=O伸缩振动)和酰胺Ⅱ带(N-H变形振动)特征峰[20], 表明形成了新的酰胺键, 证明β-氨基丁酸通过羧基与壳寡糖C2位氨基进行了酰胺化反应, 成功接枝到壳寡糖上。
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| 图 2 COS-BABA衍生物傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图 Fig. 2 FT-IR spectra of COS and the COS-BABA derivatives 注: COS为壳寡糖原料; COS-BABA表示壳寡糖β-氨基丁酸衍生物 |
COS与BABA形成的COS-BABA衍生物核磁共振氢谱(1H-NMR)如图 3所示。壳寡糖核磁氢谱中, H1 (δ=4.46)、H2(δ=3.04)及糖环上H3~H6(δ=3.3~3.9)特征峰清晰可见, δ=1.95处为乙酰基甲基质子峰[25, 27]。衍生化后, COS-BABA在δ=3.3、δ=2.3及δ=1.04附近出现归属于β-氨基丁酸β位、α位、γ位H的吸收峰[25]。上述新质子信号的出现, 证明β-氨基丁酸成功接入壳寡糖分子中。
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| 图 3 COS-BABA衍生物核磁共振氢谱(1H-NMR)图 Fig. 3 1H-NMR spectra of COS and the COS-BABA derivatives |
COS与BABA形成的COS-BABA衍生物核磁共振碳谱(13C-NMR)如图 4所示。壳寡糖核磁碳谱中, 化学位移δ=97.18、76.17、74.71、69.77、59.75、55.64分别归属于糖环上的C1、C4、C5、C3、C6及C2, δ= 21.96处为壳寡糖上未脱乙酰基的甲基碳信号[27]。β-氨基丁酸修饰的壳寡糖衍生物除糖环上的峰外, 在化学位移δ=173.59、43.39、35.88、19.25处出现新特征峰, 分别对应新形成的酰胺键C=O及β-氨基丁酸上β位、α位、γ位的碳[20]。上述羰基碳及β-氨基丁酸特征碳信号的出现, 证明了COS-BABA衍生物的成功合成。
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| 图 4 COS-BABA衍生物核磁共振碳谱(13C-NMR)图 Fig. 4 13C-NMR spectra of COS and the COS-BABA derivatives 注: COS为壳寡糖原料; COS-BABA表示壳寡糖β-氨基丁酸衍生物 |
在酰胺化反应前, 利用核磁共振氢谱计算乙酰化壳寡糖的脱乙酰度, 公式如下:
| $ D(\%)=\left[1-\frac{\frac{1}{3} I_{\mathrm{CH}_3}}{\frac{1}{6} \times I_{\left(\mathrm{H}_2 \sim \mathrm{H}_6\right)}}\right] \times 100, $ | (2) |
其中, D表示脱乙酰度,
衍生物接枝率依据元素分析进行计算, 根据CHNS模式下C、N元素含量可计算其接枝率, 结果如表 2所示。合成的4种不同脱乙酰度COS-BABA衍生物接枝率在25%~32%之间, 已尽可能缩小衍生物接枝率的差异。
| 衍生物 | DD/% | N/% | C/% | 接枝率/% |
| 37-B | 37.30 | 11.43 | 44.71 | 31.80 |
| 46-B | 46.40 | 11.43 | 44.16 | 26.70 |
| 68-B | 68.30 | 10.64 | 44.94 | 25.46 |
| 92-B | 92.02 | 10.96 | 44.78 | 27.64 |
植物生长指标是评估其生理状态及抗逆能力的重要依据, 根长、苗高、苗鲜质量及干质量变化可直观反映逆境对作物生长的抑制或缓解效应[29]。盐胁迫作为常见的非生物胁迫因子, 常导致植株根系发育受阻和地上部生物积累下降。本研究中, 盐胁迫(NaCl组)显著抑制小麦幼苗生长, 其根长、苗高、苗鲜质量和苗干质量较正常对照组(CK)分别降低45.86%、33.60%、58.68%和42.88%(图 5, P < 0.05)。添加外源物质处理后, 除68-B组干质量稍低外, 其余处理组根长、苗高、苗鲜质量、苗干质量各指标均较NaCl组不同程度增加, 其中92-B组根长增加52.74%, 苗高、苗鲜质量和干质量分别提升38.67%、83.60%和40.98%, 且显著优于其余处理组(P < 0.05), 表明其缓解盐胁迫、促生长效果最好。
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| 图 5 不同脱乙酰度COS-BABA衍生物对盐胁迫下小麦幼苗根长(a)、苗高(b)、苗鲜质量(c)、干质量(d)的影响 Fig. 5 Effects of the COS-BABA derivatives with varying DDs on root length (a), seedling height (b), fresh mass (c), and dry mass (d) of wheat seedlings grown under salt stress |
进一步分析发现, 各衍生物处理组根长、苗高排序为92-B > 68-B > 46-B > 37-B, 与脱乙酰度呈正相关。苗鲜质量与干质量呈现出随脱乙酰度升高先降低后增加的趋势(92-B > 37-B > 46-B > 68-B), 说明衍生物脱乙酰度较低时, 植物受盐胁迫影响显著, 生物量积累减少; 而当脱乙酰度进一步升高突破68%脱乙酰度阈值效应时, 抗逆效率提升, 生物量回升, 如92-B组。
2.2.2 不同脱乙酰度衍生物对小麦幼苗光合色素含量的影响光合色素是植物光能捕获与转化的核心载体, 其中叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)直接参与光反应中心电子传递[30], 而类胡萝卜素(Car)通过光保护与辅助吸光维持光合系统稳定性[31], 其含量降低将显著削弱光合效率。本研究中, 3种色素含量变化趋势一致, 盐处理(NaCl组)导致小麦幼苗Chl a、Chl b及Car含量较正常组(CK)显著上升, 分别增加40.71%、42.88%和26.95%。这一现象与多数盐胁迫抑制光合色素的报道相异, 推测是短期盐胁迫触发植物光保护机制, 通过暂时性色素积累增强光能捕获以补偿渗透调节消耗的能量需求。
衍生物处理后, 除46-B组叶绿素含量与NaCl组相当外, 其余衍生物处理组Chl a、Chl b及Car含量较NaCl组进一步升高, 增幅分别为11.90%~22.48%、11.31%~ 19.01%和15.81%~30.00%(图 6), 促进了盐胁迫下小麦光合色素的合成。各衍生物处理组3种光合色素含量92-B > 37-B > 68-B > 46-B, 在46%~92%脱乙酰度范围内随脱乙酰度增加逐渐升高。总体上, 92-B与37-B组的Chl a、Chl b及Car含量最高且无显著差异, 两种衍生物对盐胁迫下小麦幼苗光合色素的影响相当。
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| 图 6 不同脱乙酰度COS-BABA衍生物对盐胁迫下小麦幼苗叶绿素a(a)、叶绿素b(b)、类胡萝卜素(c)含量的影响 Fig. 6 Effects of the COS-BABA derivatives with varying DDs on the chlorophyll a (a), chlorophyll b (b), and carotenoid (c) contents of wheat seedlings grown under salt stress 注: 光合色素含量单位mg∙g−1 FM表示每g新鲜叶片中含有的色素质量 |
盐胁迫诱导植物体内活性氧(ROS)过量积累, 将攻击细胞膜脂质引发过氧化损伤, 导致膜透性增加, 细胞内K+、Ca2+等电解质大量外渗[32]。电解质渗出率因此成为评价膜完整性的关键指标, 其升高直接反映盐胁迫对膜系统的不可逆破坏。用不同脱乙酰度COS-BABA衍生物处理后小麦幼苗的电解质渗出率如图 7所示, 盐处理组(NaCl组)电解质渗出率较正常组(CK)显著上升41.29%, 表明盐胁迫严重破坏小麦幼苗细胞膜结构。外源添加COS-BABA衍生物处理组电解质渗出率较NaCl组降低9.39%~24.20%, 但均高于对应的壳寡糖原料组。可知, COS-BABA衍生物能帮助维持细胞膜透性, 但对细胞膜盐胁迫损伤的缓解作用弱于相应的壳寡糖, β-氨基丁酸的修饰一定程度上削弱了衍生物稳定细胞膜的能力。推测原因是β-氨基丁酸的羧基与壳寡糖氨基偶联, 减少了壳寡糖本身的正电荷密度, 导致衍生物与细胞膜磷脂层的静电吸附能力降低, 进而影响稳定膜结构的能力。
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| 图 7 不同脱乙酰度COS-BABA衍生物对盐胁迫下小麦幼苗电解质渗出率的影响 Fig. 7 Effects of the COS-BABA derivatives with varying DDs on the electrolyte exudation rate of wheat seedlings grown under salt stress |
可溶性糖作为植物体内重要的渗透调节物质, 其含量变化直接反映植物细胞渗透调节能力或代谢稳态[33]。当遭受非生物胁迫时, 植物通过积累可溶性糖降低细胞水势, 促进渗透吸水维持膨压, 从而增强抗逆性[34]。本研究中, 盐胁迫(NaCl组)导致小麦幼苗可溶性糖含量较正常对照组(CK)显著降低70.22%(图 8), 严重干扰糖代谢稳态。衍生物组处理后, 可溶性糖含量较NaCl组显著增加, 其中37-B组增幅最大(166.87%), 92-B组次之(103.69%)。在脱乙酰度37%~92%范围内, 随脱乙酰度升高, 衍生物处理组可溶性糖含量先降低后升高, 与苗鲜质量和苗干质量趋势基本一致, 表明可溶性糖积累不仅是盐胁迫下渗透调节的重要机制, 也是代谢恢复和生物量积累的重要标志。结合前述衍生物对电解质渗出率的影响, COS-BABA衍生物通过增强渗透调节与膜系统保护双重机制, 显著提升小麦幼苗耐盐性。
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| 图 8 不同脱乙酰度COS-BABA衍生物对盐胁迫下小麦幼苗可溶性糖含量的影响 Fig. 8 Effects of the COS-BABA derivatives with varying DDs on the soluble sugar contents of wheat seedlings grown under salt stress 注: 可溶性糖含量单位mg∙g−1 FM表示每g新鲜叶片中含有的可溶性糖质量 |
盐胁迫诱导植物体内活性氧(ROS)爆发, 将引发膜脂过氧化及细胞结构损伤, 从而抑制小麦幼苗生长[33, 35]。为应对氧化压力, 植物进化出以过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)为核心的酶促ROS清除系统[32]。本研究添加不同脱乙酰度衍生物处理, 对小麦幼苗3种抗氧化酶的影响如图 9所示。盐胁迫下(NaCl组)小麦幼苗CAT活性较正常对照组(CK)显著降低, 而POD与SOD的活性分别提高122.32%和30.39%。衍生物处理后, 所有衍生物处理组POD、SOD活性较NaCl组显著升高28.99%~80.77%、42.07%~92.83%, 且均高于对应脱乙酰度壳寡糖原料组。进一步分析发现, 不同脱乙酰度衍生物处理组CAT活性排序为: 46-B < 68-B < 37-B < 92-B, 在脱乙酰度46%~92%范围内随脱乙酰度增加逐渐升高。与CAT不同, 衍生物组POD活性排序为: 92-B < 37-B < 46-B < 68-B, 在脱乙酰度37%~ 68%范围内随脱乙酰度增加逐渐升高。SOD活性排序为: 46-B > 37-B > 68-B > 92-B, 在脱乙酰度46%~ 92%范围内随脱乙酰度增加逐渐降低。这些结果表明, 衍生物通过差异化调控不同抗氧化酶活性来增强小麦抗盐性, 并且这种调控作用受脱乙酰度显著影响。
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| 图 9 不同脱乙酰度COS-BABA衍生物对盐胁迫下小麦幼苗过氧化氢酶(a)、过氧化物酶(b)、超氧化物歧化酶活性(c)的影响 Fig. 9 Effects of the COS-BABA derivatives with varying DDs on catalase (a), peroxidase (b), and superoxide dismutase activities (c) in wheat seedlings grown under salt stress 注: 酶活单位以每g组织在单位时间内催化底物的转化量表示, U∙g−1 FM指每g新鲜叶片中含有的酶活性单位数 |
植物遭受盐胁迫最直观的表现是生长状态受抑制, 添加外源诱导剂可有效缓解此类生理损伤。根据已有研究, 盐胁迫导致小麦严重矮化、根系发育受阻[36], 干物质积累减少[37]; 外源添加COS-GABA衍生物(DD > 90%)使小麦根长增加24.1%、苗鲜质量提高48.9%, 促进盐胁迫小麦生长作用显著[21]。与上述结果一致, 本研究制备的4种不同脱乙酰度COS-BABA衍生物促进了盐胁迫小麦根系伸长、株高生长及生物量积累, 表现出显著的促生长效果。同时, 该衍生物还显著提升了盐胁迫小麦幼苗的叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素含量, 光合色素含量在46%~92%脱乙酰度范围内呈上升趋势, 脱乙酰度为92%的衍生物(92-B)水平最高, 此结果与毛小涛等[38]利用不同脱乙酰度壳寡糖处理马家柚幼苗时发现的叶绿素含量变化趋势相一致, 表明壳寡糖及其衍生物的脱乙酰度是调控植物光合系统功能的关键因素。光合色素作为光能捕获与转化的核心载体, 其水平直接影响植物光能转化效率及生长速率。推测COS-BABA衍生物可能通过强化光合系统功能来促进盐胁迫小麦生物量的积累, 具体作用机制需结合色素代谢关键酶活性及光信号通路进一步验证。
当盐胁迫损伤持续加重时, 植物体内ROS爆发, 进而引发膜脂过氧化, 此种情况下, 植物将激活抗氧化防御系统应对氧化应激, 关键在于协同调控CAT、POD、SOD等抗氧化酶活性以提高活性氧清除能力。本研究中, 盐处理提高了小麦幼苗POD、SOD活性, 却降低了CAT活性。POD、SOD活性的增强源于小麦接收盐胁迫信号后, 做出的抗氧化防御反应。而CAT活性并未同步提高, 推测是随着盐胁迫的进行, 植物体内H2O2积累过量, 超出CAT调节阈值, 引发酶活性抑制或结构损伤所致[32]。外源添加COS-BABA衍生物后, 小麦幼苗SOD、CAT和POD活性进一步提高, 促进体内过量自由基的清除, 进而减少电解质外渗及膜脂过氧化, 维持细胞膜结构稳定, 最终增强小麦幼苗耐盐性。对比β-氨基丁酸修饰前后的抗氧化酶活性变化发现, 脱乙酰度相同时, 衍生物的POD和SOD活性均显著高于对应的壳寡糖原料, 这表明β-氨基丁酸修饰能显著增强对POD与SOD活性的正向调控作用。在46%~92%脱乙酰度范围内, 衍生物组SOD活性随脱乙酰度升高呈下降趋势, 推测原因是脱乙酰度增加导致氨基基团暴露增多, 分子正电荷增强, 易与SOD酶活性中心的负电区域(如Cu/Zn-SOD的羧酸基团)发生静电结合, 阻碍超氧阴离子进入活性中心[39]。另外, 脱乙酰度提高使壳寡糖分子链刚性增加, 形成空间位阻[40], 进而影响酶-底物互作也可能是原因之一。同样的46%~92%脱乙酰度范围内, 衍生物组CAT活性随脱乙酰度增加逐渐升高, 与SOD活性变化趋势相反。SOD作为抗氧化防御系统的第一道防线, 负责将O2⁻·转化为H2O2[41]; 而CAT则通过分解H2O2来保护线粒体和过氧化物酶体, 其活性通常与植物耐盐性呈正相关。据Hasanuzzaman等[42]的研究, 盐胁迫下CAT缺陷型植物表现出更严重的H2O2积累和光系统Ⅱ损伤, SOD和CAT的协同作用不仅有利于细胞氧化还原稳态的维持, 对叶绿体保护也至关重要。本研究合成的COS-BABA衍生物通过协同调控CAT介导的H2O2清除途径并优化光合系统Ⅱ电子传递效率, 有效缓解盐胁迫对植物造成的损伤。
壳寡糖及其衍生物的生物活性受聚合度、脱乙酰度、分子量及取代基类型等因素的影响[43]。本研究条件下, 各脱乙酰度衍生物的分子量及β-氨基丁酸接枝率保持稳定, 因此其活性差异主要源自脱乙酰度的变化。衍生物抗盐活性受脱乙酰度显著影响, 具体为: 脱乙酰度 > 37%时, 形态生长促进效应与脱乙酰度呈正相关; 37%~68%中低脱乙酰度范围内, 生物量积累、可溶性糖含量与脱乙酰度呈负相关; 46%~92%中高脱乙酰度范围内, CAT活性、光合色素含量与脱乙酰度呈正相关, 植物通过精准调控光合系统增效与抗氧化酶系统协同作用提升抗盐活性。总体上, 高脱乙酰度衍生物92-B抗盐活性最高, 低脱乙酰度衍生物37-B次之, 两者均显著高于中脱乙酰度衍生物46-B与68-B。这种差异源于脱乙酰度调控的分子特性: 高脱乙酰度使分子链上游离氨基密度增加, 形成强阳离子特性, 促进其与植物细胞膜负电性受体的静电吸附作用, 从而更有效激活抗逆响应。Okada等[44]研究证实, 小麦细胞膜上存在特异性识别壳寡糖N-乙酰基的高亲和力结合蛋白, 此蛋白能感知诱发剂触发防御信号。37-B衍生物的高抗盐活性可能与其保留的N-乙酰基占比较高, 能更有效地与识别受体相互作用, 激活下游盐胁迫响应信号通路有关。而中等脱乙酰度衍生物因阳离子密度不足、乙酰基比例不够, 与受体结合能力处于中间态, 导致其抗盐活性相对较低。
综合而言, 脱乙酰度是调控COS-BABA衍生物抗盐活性的关键因素, 各衍生物抗盐活性综合表现为: 92-B > 37-B > 46-B > 68-B。高脱乙酰度衍生物(如92-B)通过增强光合系统效率、精准抗氧化以及促进生物量积累, 多靶点调控抗盐作用。后续可通过分子对接进一步解析衍生物与抗氧化酶的结合模式, 并整合多组学技术挖掘脱乙酰度依赖的代谢通路调控网络, 为靶向设计新型植物抗逆剂提供理论依据。
4 结论本研究基于可控乙酰化技术制备不同脱乙酰度壳寡糖, 并结合羧基定向偶联策略成功合成4种特定脱乙酰度的壳寡糖β-氨基丁酸衍生物。通过红外光谱(FT-IR)、核磁共振波谱(1H-NMR、13C-NMR), 证实β-氨基丁酸的羧基成功接枝到壳寡糖C2氨基上。以浸种-浸根水培模式, 系统探究了该类衍生物诱导小麦幼苗的抗盐作用及脱乙酰度对其抗盐活性的影响。结果表明, 衍生物通过多维调控机制显著提升小麦幼苗抗盐能力, 且该诱抗作用受脱乙酰度显著影响, 其中92%高脱乙酰度壳寡糖β-氨基丁酸衍生物(92-B)综合抗盐效果最佳, 使盐胁迫下小麦生物量、光合色素含量、可溶性糖含量及抗氧化酶活性分别提升40.98%~ 83.60%、19.01%~30.00%、103.69%、28.99%~42.53%。本研究首次解析了脱乙酰度对壳寡糖β-氨基丁酸衍生物抗盐活性的调控作用, 为壳寡糖分子精准改造及新型抗盐剂的开发奠定了理论基础。
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