2026, Vol. 50
文章信息
- 曹佐明, 徐洪强, 朱杰, 董迎辉. 2026.
- Cao Zuoming, Xu Hongqiang, Zhu Jie, Dong Yinghui. 2026.
- 缢蛏与近江蛏种间杂交子代高盐耐受性分析
- High salinity tolerance analysis of hybrid offspring between Sinonovacula constricta and S. rivularis
- 海洋科学, 50(2): 1-12
- Marine Sciences, 50(2): 1-12.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20251027002
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文章历史
- 收稿日期：2025-10-27
- 修回日期：2026-02-08
2. 浙江万里学院 现代农学院, 浙江 宁波 315101;
3. 浙江万里学院 宁海海洋生物种业研究院, 浙江 宁海 315604
2. College of Modern Agriculture, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315101, China;
3. Ninghai Marine Biological Seed Industry Research Institute, Zhejiang Wanli University, Ninghai 315604, China
蛏类是我国重要的海水养殖品类, 在长期的养殖发展中, 形成了缢蛏(Sinonovacula constricta)为主, 近江蛏(S. rivularis)、小刀蛏(Cultellus attenuatus)、小荚蛏(Siliqua minimai)为辅的产业格局[1]。其中缢蛏是我国传统四大养殖贝类之一, 其肉质鲜美, 口味独特, 具有成熟的育苗、养殖以及加工产业。缢蛏属于广盐性种类, 适宜盐度为4~28, 盐度高于32时活力明显减弱[2]。而近江蛏自然分布于日本和中国闽南地区的淡水入海口, 出肉率高, 生长速度快, 但盐度适应范围狭窄, 适宜盐度为3~20, 盐度高于20成活率显著降低[3-4]。由于缢蛏和近江蛏在栖息地上存在较大差异, 二者在自然条件下不易发生杂交。鉴于缢蛏与近江蛏同属缢蛏属, 且在盐度耐受性、生长性状、外部形态等方面具有丰富的遗传变异, 为了获得生长速度快、经济性状优良且抗逆能力强的优良品种, 本课题组前期开展了2个物种的种间杂交试验, 并获得大量的正、反交杂交子代。初步试验结果表明, 杂交子代具有明显的生长优势, 且高盐耐受性相较于近江蛏具有明显提升。
盐度是影响海洋生物生长发育的重要环境因子, 对贝类的生存和繁衍起着决定性作用[5-6]。当盐度过高不适于正常生长、存活时, 贝类常通过消耗机体糖类、脂肪等营养物质进行生理代谢调节, 同时还会利用体内相关酶或者转运蛋白来实现渗透压平衡调节[7]。研究表明, 长时间的高盐胁迫常导致贝类生长滞缓、代谢缓慢。就缢蛏而言, 当遭受高盐胁迫时, 其双壳紧闭、纤毛摆动减少, 滤水率和摄食率降低[8], 与此同时其能量代谢和抗氧化酶活性也降低[9]。然而高盐海水相较于低盐养殖的贝类, 其肉质更加紧实, 风味更加鲜美, 这是因为高盐环境致使缢蛏体内脂质等特殊呈味物质的含量发生了变化, 导致其风味发生了变化[10]。因此, 研究缢蛏和近江蛏杂交子代高盐适应能力及其在高盐环境下的调节机制, 对培育高盐耐受性强、生长速度快的蛏类养殖新品种具有重要的应用价值。
渗透调节是海洋生物适应不同盐度环境的关键生理机制[11]。贝类通过有机和无机渗透调节2条途径来维持体内外的渗透压平衡, 其中有机调节是通过游离氨基酸和其他有机物质的合成代谢[12]; 无机调节依赖于Na+、Cl−、K+和Ca2+等无机离子的含量变化, 当贝类受到外界渗透压力时, 细胞内外无机离子的含量会迅速发生变化, 参与维持细胞内外渗透压的平衡[13]。其中, NKA(Na+-K+-ATPase)、CA(碳酸酐酶)和VHA(V-H+-ATPase)等在无机渗透调节中发挥重要作用[14]。NKA通过催化ATP水解供能, 驱动Na+和K+于细胞膜两侧的对向运输, 主动转运Na+和K+[15]。在NKA发挥离子调控作用的同时, CA与VHA的活性也发生相应变化, CA通过参与胞内二氧化碳水合过程的可逆催化为Na+/H+、Cl–/HCO3–离子交换提供H+和HCO3–[16], 而VHA则通过泵出H+产生膜内外电势差, 使Na+通过Na+/H+交换器进入膜内进行离子交换[17]。本研究旨在探讨不同盐度胁迫下缢蛏和近江蛏杂交子代生理代谢和NKA、CA、VHA酶活性的变化, 以期揭示缢蛏和近江蛏杂交子代在不同盐度环境下的存活和生理适应情况, 同时也为蛏类耐高盐新品种培育奠定坚实基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料2024年3月, 于浙江省宁波市咸祥镇宁波市海洋与渔业科技创新基地采集2022年10月构建的缢蛏和近江蛏正交组CR(缢蛏♀×近江蛏♂)和反交组RC(近江蛏♀×缢蛏♂), 以及自繁组CC(缢蛏♀×缢蛏♂)和RR(近江蛏♀×近江蛏♂)各3 000颗(生长相关数据统计见表 1)。实验前将CC、CR、RC和RR暂养7 d, 控制盐度为20。每日换水2次, 每天投喂牟氏角毛藻(Chaetoceros mulleri)和大扁藻(Platmonas helgolanidica)1次。高盐度人工海水用生化海水晶(台州市盐业有限公司)配制, 盐度使用精密数字盐度仪(盐度计MBS-ygwdj1)测定。
| 交配组合 | 壳长/mm | 壳高/mm | 壳宽/mm | 湿质量/g |
| CR | 61.45±4.21 | 18.76±1.52 | 14.93±1.81 | 14.89±3.52 |
| RC | 62.88±3.24 | 20.42±1.11 | 16.84±1.58 | 18.79±4.18 |
| CC | 60.58±3.04 | 20.16±3.58 | 15.33±1.17 | 15.39±2.71 |
| RR | 61.37±3.21 | 20.05±1.79 | 15.86±1.18 | 16.69±3.75 |
| 注: CR为缢蛏♀×近江蛏♂、RC为近江蛏♀×缢蛏♂、CC为缢蛏♀×缢蛏♂、RR为近江蛏♀×近江蛏♂。 | ||||
基于预实验获得的杂交组和自繁组盐度极限耐受范围, 并根据半致死盐度测定的通用原则, 本实验设置的盐度梯度涵盖了从低盐到高盐的胁迫范围, 超越了常规最佳适应盐度, 以确定其半致死阈值。其中CR和RC组设置5个盐度梯度, 分别为23、25、27、30、34, CC的5个盐度梯度分别为30、32、34、36、38, RR组的5个盐度梯度分别为19、21、23、25、27。将各组置于不同盐度进行胁迫, 每个盐度设置3个重复, 每个重复放置100颗个体。在实验开始后第6、12、24、48、72、96、120 h统计死亡率, 并分别用概率单位法和直线内插法计算96 h的半致死盐度LC50。
1.2.2 耗氧率、排氨率和摄食率的测定基于预实验获得的耐受范围, 对杂交组和缢蛏自繁组设置相同的4个盐度梯度, 分别为23、25、27、30, 设置3个重复, 每个重复放置100颗个体, 并于96 h进行取样测定。
于胁迫96 h后取样, 用静水法测量杂交组和缢蛏自繁组的耗氧率和排氨率。每个实验组设3个平行, 每个平行随机选6颗个体并将其放入碘量瓶, 水体体积为500 mL, 水体盐度为各实验组对应的胁迫盐度, 用塑料薄膜封口, 实验持续时间为2 h, 设置1个空白对照组(不放样品)。溶解氧浓度用数字化多参数分析仪(WTW Multi, Germany)测定, 排氨率采用次溴酸钠氧化法测定, 耗氧率及排氨率计算方法[18]如下:
| $ \begin{gathered} O R\left(\mathrm{mg} \cdot \mathrm{~g}^{-1} \cdot \mathrm{~h}^{-1}\right)=\left(A_0-A_t\right) \times V /(W \times T), \end{gathered}$ | (1) |
| $ A R\left(\mu \mathrm{~g} \cdot \mathrm{~g}^{-1} \cdot \mathrm{~h}^{-1}\right)=E / W \times T, $ | (2) |
式中, At和A0分别为测试水中溶解氧的最终浓度和初始浓度(mg/L), V为测试水的体积(L), W为缢蛏平均湿质量(g), T为测试的持续时间(h), E为测试水的氨氮含量(µg)。
摄食率实验在0.5 L烧杯中进行, 投喂饵料为广盐性牟氏角毛藻, 密度为4.5× 105个/mL。实验前, 在烧杯中倒入相应盐度充氧藻水, 每个烧杯投放3颗待测样品, 实验进行1 h。实验结束后, 将采集的水样加鲁戈氏液固定, 血球计数板计数, 重复3次[19]。取样品软体组织放入烘箱, 在60 ℃条件下烘干至恒质量并称量, 软组织干质量精确到0.001 g。
| $ F R\left(\mathrm{~mL} \cdot \mathrm{~g}^{-1} \cdot \mathrm{~h}^{-1}\right)=V \times\left[\ln \left(C e_0 / C e_T\right)-\ln \left(C c_0 / C c_T\right)\right] /(W \times T), $ | (3) |
式中, V(mL)为实验水体体积; W(g)为实验用贝软体组织干质量; T(h)为实验持续时间; Cc0(cells/mL)为实验开始时空白对照组的藻类初始浓度; CcT(cells/mL)为T时间空白对照组的藻类浓度; Ce0(cells/mL)为实验开始时实验组的藻类浓度; CeT(cells/mL)为T时间实验组的藻类浓度。
1.2.3 酶活性的测定基于杂交子代与缢蛏自繁组的生理代谢能力在盐度25与30间均存在显著差异, 进一步测定了盐度25和30时第0、6、24、48、96 h的NKA、CA和VHA酶活力。分别从每组、每个时间点取3颗缢蛏的鳃组织, 用于NKA、CA、VHA酶活力测定。VHA测试盒(YJ574833)、CA测试盒(YJ5748331)、NKA测试盒(YJ593404)均来自上海酶联免疫生物工程研究所, 实验步骤按照试剂盒说明书进行。
1.3 数据处理利用Excel 2022和GraphPad Prism8.0进行统计和作图分析, 通过直线内插法[20]和概率单位法[21]计算各组半致死盐度LC50, 用Duncan法进行差异显著性检验, P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 半致死盐度比较分析在盐度27和30胁迫96 h后, CR组平均相对存活率分别为96.33%、85.7%, RC组平均相对存活率分别为71.33%、46.33%(图 1)。通过概率单位法确定CR与RC组的96 h半致死盐度分为31.08、28.83, 直线内插法确定CR与RC组的96 h半致死盐度分为31.54、29.57; 在盐度36和38胁迫96 h后, CC组的平均存活率为50.00%、78.57%(图 1), 概率单位法和直线内插半致死盐度分为35.93、36.00; 在盐度21和23胁迫96 h后, RR组的平均存活率为57.14%、37.71%(图 1), 概率单位法和直线内插半致死盐度分别为21.73、22.00。
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| 图 1 不同盐度胁迫下的存活率 Fig. 1 Survival rates under different salinity stresses |
| 群体 | 回归方程 | 96 h LC50 | 下限 | 上限 | 显著性P |
| CR | Y=46.00x−61.31 | 31.08 | 29.40 | 32.83 | 0.000 |
| RC | Y=21.64x−31.59 | 28.83 | 27.99 | 29.90 | 0.000 |
| CC | Y=31.92x−49.65 | 35.93 | 35.25 | 36.71 | 0.000 |
| RR | Y=15.33x−20.52 | 21.76 | 20.84 | 22.55 | 0.000 |
| 注: P < 0.01代表差异极显著。CR为缢蛏♀×近江蛏♂、RC为近江蛏♀×缢蛏♂、CC为缢蛏♀×缢蛏♂、RR为近江蛏♀×近江蛏♂。 | |||||
| 群体 | 回归方程 | 96 h LC50 | 下限 | 上限 | 显著性P |
| CR | Y=10.42x−280.01 | 31.54 | 29.95 | 33.13 | 0.000 |
| RC | Y=9.02x−211.95 | 29.57 | 27.98 | 31.16 | 0.000 |
| CC | Y=9.11x−269.80 | 36.00 | 34.41 | 37.59 | 0.000 |
| RR | Y=9x−148.84 | 22.00 | 20.41 | 23.59 | 0.000 |
| 注: P < 0.01代表差异极显著。CR为缢蛏♀×近江蛏♂、RC为近江蛏♀×缢蛏♂、CC为缢蛏♀×缢蛏♂、RR为近江蛏♀×近江蛏♂。 | |||||
结果表明, 盐度胁迫对缢蛏、杂交蛏的耗氧率、排氨率和摄食率具有显著影响。在盐度23~30范围内, 各组的耗氧率、排氨率和摄食率均随着盐度的升高呈下降趋势(图 2a, 2b, 2c)。盐度低于27时, CR和RC组生理代谢指标显著高于CC组(P < 0.05); 在盐度高于30时, CR与RC组生理代谢指标显著低于CC组(P < 0.05)。同时发现, 两杂交组生理代谢水平在盐度23~30范围内基本一致, CR组略高于RC组。在盐度高于30时, CR与RC的耗氧率、排氨率和摄食率显著降低(P < 0.05), 而CC仅小幅下降, 且无显著差异(P > 0.05)。
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| 图 2 盐度对各实验组耗氧率、排氨率、摄食率的影响 Fig. 2 Effects of salinity on oxygen consumption rate, ammonia discharge rate, and feeding rate 注: 不同大写字母代表同一组(CR, RC, CC)下不同盐度组间存在显著差异(P < 0.05), 不同小写字母代表同一盐度下不同组(CR, RC, CC)间存在显著差异(P < 0.05)。 |
不同盐度下, 杂交子代与缢蛏自繁组的氧氮比(O∶N)均随着盐度的升高而升高(图 3)。在盐度23~30下, CR、RC、CC的O∶N值分别为5.28~15.19、5.15~15.09和5.35~6.83。在盐度27时, CR、RC、CC的O∶N值较盐度25时显著升高(P < 0.05); 在盐度30时, CR与RC的O∶N值较盐度27时也显著升高(P < 0.05), CC无显著变化。在盐度23~27时, 杂交子代与缢蛏自繁组无显著差异, 而在盐度30时, 杂交子代要显著高于缢蛏自繁组(P < 0.05)(图 3)。
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| 图 3 不同盐度下的氧氮比 Fig. 3 O∶N values under different salinity conditions 注: 不同大写字母代表同一组(CR, RC, CC)下不同盐度组间存在显著差异(P < 0.05), 不同小写字母代表同一盐度下不同组(CR, RC, CC)间存在显著差异(P < 0.05)。 |
酶活检测结果表明, 高盐对杂交组NKA活性存在显著影响(图 4a, 图 4b)。在盐度25时, 随胁迫时间的增加, CR、RC、CC组的NKA活性显著升高(P < 0.05), 24 h以后下降并趋于平稳; 在盐度30时, 3个组NKA活性逐渐升高并在6 h达到峰值(P < 0.05), 随后也逐渐下降并趋于稳定。而当盐度25时, CR与RC的NKA酶活均显著高于CC(P < 0.05), 在盐度30时, CR与RC酶活均显著低于CC(P < 0.05)。
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| 图 4 高盐对杂交子代和缢蛏NKA活性的影响 Fig. 4 Effects of high salinity on Na+-K+-ATPase activity in hybrids and Sinonovacula constricta 注: 不同大写字母代表同一组(CR, RC, CC)下不同时间点存在显著差异(P < 0.05), 不同小写字母代表同一时间点下不同组(CR, RC, CC)间存在显著差异(P < 0.05)。 |
碳酸酐酶(CA)活性结果表明, 在盐度25、30时, 随胁迫时间的延长, CR、RC、CC的CA活性显著升高(P < 0.05), 均在24 h达到峰值以后下降并趋于平稳。而在盐度25时, CR与RC的CA酶活均显著高于CC(P < 0.05), 在盐度30时, CR与RC酶活均显著低于CC(P < 0.05) (图 5a, 5b)。
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| 图 5 高盐对杂交子代和缢蛏CA活性的影响 Fig. 5 Effects of high salinity on carbonic anhydrase activity in hybrids and Sinonovacula constricta 注: 不同大写字母代表同一组(CR, RC, CC)下不同时间点存在显著差异(P < 0.05), 不同小写字母代表同一时间点下不同组(CR, RC, CC)间存在显著差异(P < 0.05)。 |
V-ATP酶活结果表明, 在盐度25、30时, 随胁迫时间的延长, 3个组V-ATP活性显著降低(P < 0.05), 24 h达到最低值后上升并趋于平稳。而在实验前24 h时, CR与RC的V-ATP酶活与CC组之间无显著差异, 在48、96 h时, CR与RC在盐度25下V-ATP酶活均显著高于CC(P < 0.05), 而在盐度30下V-ATP酶活显著低于CC(P < 0.05)。在盐度25和30组中, 杂交组CR与RC组之间也存在差异, 但不显著(P > 0.05)(图 6a, 图 6b)。
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| 图 6 高盐对杂交子代和缢蛏V-ATP活性的影响 Fig. 6 Effects of high salinity on V-ATPase activity in hybrids and Sinonovacula constricta |
在遗传育种领域, 种间杂交是常用的遗传改良手段, 可以显著扩大动植物的基因库, 将亲本的优良性状传给子代, 从而获得具有良好表型性状的杂交子代[22]。本研究基于缢蛏与近江蛏之间盐度耐受性差异, 对其进行种间杂交并获得了耐高盐的正、反杂交子代, 测得杂交组CR、RC和自繁组CC、RR的96 h高盐半致死盐度分为31.08、28.83、35.61、21.76。正、反杂交组高盐耐受能力均介于两亲本之间, 说明杂交子代高盐耐受性状相关基因启动并表达, 从而相较于近江蛏亲本表现出明显的耐高盐杂种优势[23]。另外, CR组高盐耐受性与CC组类似, 表现出一定的母本效应。在贝类种间杂交中, 张跃环等[24]、杜俊鹏等[25]认为杂交组在不同生长时期表型性状均会表现一定的母本效应。杨林颖等[26]在紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)与厚壳贻贝(M. coruscus)的杂交研究中, 发现正交组(M. galloprovincialis♀×M. chilensis♂)较厚壳贻贝自交组(M. chilensis♀×M. chilensis♂)有显著的生长优势, 这可能与母本紫贻贝的生长特性有关。涂康等[6]发现熊本牡蛎与福建牡蛎正交组(C. sikamea♀×C. angulata♂)的适盐范围与熊本牡蛎自交子代相近, 而与福建牡蛎自交组的适应高盐环境差异较大, 表现出母系遗传趋势。综上表明, 在贝类的杂交育种中, 可以利用母本效应对亲本进行科学合理配组, 提高杂交后代的优良性状表型[27]。
3.2 高盐对杂交子代耗氧率、排氨率与摄食率的影响盐度与水生动物的呼吸代谢、摄食行为和免疫防御等生理机能紧密相关[28]。这些机能反映了水生动物在稳态下能量消耗的情况, 如维持离子和渗透压平衡、蛋白质构象转换以及基本生命活动的能量需求, 而耗氧率和排氨率是衡量离子和渗透压调节的关键指标[29]。当盐度降低时, 青蟹(Scylla serrata)耗氧率和排氨率急剧变化[30]; 而将凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)由盐度36转移至盐度2时, 耗氧率和排氨率均显著增加, 且存活率明显降低, 原因可能是其消耗了更多的能量来维持渗透压平衡, 导致免疫代谢和生长的能量分配减少, 从而死亡[31]。在本研究中, 盐度低于27时, CR与RC组的耗氧率、排氨率和摄食率均显著高于CC组(P < 0.05), 而当盐度升至30时则显著低于CC组(P < 0.05), 表明在盐度27以内, 杂交组可通过有效的渗透调节维持正常代谢水平, 而水体盐度30时, 杂交组水管不再伸出, 双壳紧闭, 盐度30对缢蛏而言是等渗条件, 而对杂交子则是高盐应激, 杂交子通过关闭进出水管等行为减少生理活动[32], 从而抵御高盐胁迫带来的负面影响, 进而导致了杂交子代摄食率、耗氧率、排氨率显著下降(P < 0.05)。
3.3 高盐对杂交子代氧氮比的影响O∶N值通过量化代谢过程中氧气消耗量与氮排泄量的比值, 反映其能量代谢底物的优先利用策略: 低O∶N值提示蛋白质主导分解供能, 表征胁迫响应状态; 高O∶N值则表明脂肪或碳水化合物为主要代谢基质, 反映生理稳态特征。该比值可作为敏感的生物能量学指标, 揭示环境压力下贝类代谢途径的动态调整及其适应性代偿机制[33]。在本研究中, 杂交子代群体的O∶N值范围在5.28~15.19和5.15~15.09, 而缢蛏的O∶N值范围在5.35~6.83。在盐度27以下, 杂交子代与缢蛏的能量均主要由蛋白质提供; 盐度30时, 杂交子代的能量主要由脂肪提供, 而缢蛏由蛋白质和脂肪共同提供。这说明杂交子代可能通过动态调整代谢底物来应对能量需求变化, 杂交子代可能整合了双亲的代谢相关基因, 在能量利用效率或氮废物处理能力上更具优势。
3.4 高盐对杂交子代NKA、CA与VHA活性的影响离子浓度是评价海洋生物渗透调节能力的重要指标。海洋生物通过调节离子浓度来适应水环境的变化, NKA作为Na+/K+泵的关键组成部分, 对维持细胞内Na+和K+的稳态起着重要作用, CA参与二氧化碳的水合反应, 为Na+和Cl–的转运提供反离子[34], 而VHA促进Na+通过Na+通道进出细胞, 完成离子交换[35]。在本研究中, 在盐度胁迫后, 各实验组NKA与CA活性均呈现先升高后降低的变化趋势, 这与渗透调节的阶段性特征相符, 通常胁迫初期(0~24 h)酶活性显著升高以应对离子失衡, 后期(24~96 h)随机体内环境的调控稳定逐渐回落。曹伟等[36]发现在盐度30时, 缢蛏幼贝NKA酶活性随胁迫时间的延长呈先上升后下降, 并逐步稳定的变化趋势。陈铭等[37]研究了盐度胁迫对缢蛏CA基因mRNA表达的影响, 发现其表达水平随着时间推移表现先升高后降低的变化趋势。在本研究中, V-ATP酶(VHA)活性在胁迫初期(0~24 h)受到显著抑制, 至调节阶段(24~96 h), VHA活性逐步回升, 可能其与NKA形成协同调节机制: 一方面, NKA通过建立Na+梯度驱动离子转运; 另一方面, VHA通过水解ATP产生的跨膜质子梯度, 为Na+/H+逆向转运提供驱动力[38], 这种时序性激活模式体现了生物体应对盐度胁迫的能量优化策略。马金武[39]对三疣梭子蟹不同盐度下VHA的酶活进行测定, 发现盐度低于20时VHA酶活也呈现出先下降后上升的趋势。徐娴等[40]在研究盐度胁迫下缢蛏渗透压变化时, 各实验组的VHA酶活力同样呈现出先下降后上升的趋势。另外, 研究还发现杂交组较自繁组表现出明显的盐度适应差异, 在盐度25时, 杂交群体(CR、RC)NKA和CA活性均显著高于CC组(P < 0.05)。而在30高盐胁迫下, 杂交群体酶活性显著低于CC组(P < 0.05), 表明杂交组经过基因组重组修饰, 其遗传背景发生了较大改变, 在中高盐度表现出较高的代谢水平。
4 结论本研究比较了缢蛏和近江蛏杂交子代高盐耐受性差异, 计算了各组的半致死盐度, 并比较分析了杂交组在盐度27和30时生理代谢和盐度调节相关酶活性差异。结果表明, CR、RC、CC和RR组分别为31.08、28.83、35.60和21.76; 与缢蛏自繁组CC相比, CR与RC组在盐度27以下具有较高的生理代谢水平, 离子转运酶活性也显著高于亲本自繁组, 揭示杂交组高盐耐受能力较近江蛏具有明显提升, 较缢蛏在中高盐水平也具有明显优势。另外, CR组在高盐胁迫下表现出更高的生理代谢能力和渗透调节酶活性, 表明CR组较RC组具有更高的高盐耐受性。本研究为开展缢蛏和近江蛏杂交育种研究以及蛏类种质资源开发提供了科学依据。
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