2026, Vol. 50
文章信息
- 王玟心, 薛东秀, 李渊, 刘进贤. 2026.
- Wang Wenxin, Xue Dongxiu, Li Yuan, Liu Jinxian. 2026.
- 基于环境DNA的靶向物种特异性检测技术及其在水生生态系统监测中的应用
- Research advances in targeted species-specific detection using environmental DNA with applications in aquatic ecosystem monitoring
- 海洋科学, 50(2): 73-90
- Marine Sciences, 50(2): 73-90.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20251023002
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文章历史
- 收稿日期：2025-10-23
- 修回日期：2025-12-19
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 自然资源部第三海洋研究所, 福建 厦门 361005
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Third Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Xiamen 361005, China
水生生态系统的物种特异性检测是实现生物多样性保护与资源可持续利用的重要基础。拖网调查、视觉观测或声学追踪等传统调查方法虽长期主导该领域, 却存在成本高、时空覆盖度低、对隐蔽性强或濒危物种的检测灵敏度不足等问题, 且调查过程中易造成对敏感生态系统的侵入性干扰[1-2]。尤其是针对低丰度的目标物种(如入侵种的早期扩散个体或濒危物种的残存种群), 传统手段往往难以实现快速、准确的定位与识别, 进而影响管理措施的时效性和科学性[3-4]。
环境DNA(Environmental DNA, 以下简称eDNA)一词最早出现在微生物学研究领域[5], 其定义为从环境样本(如土壤、水体、沉积物、空气等)中提取的生物体释放的复杂混合物总DNA[6]。该技术通过捕获环境介质中脱落的细胞、黏液或排泄物等遗传物质, 能够在无需捕获或干扰目标生物的前提下实现物种存在性的高灵敏度检测[7]。近年来, 随着分子生物学与生物信息学分析手段的逐步发展, eDNA技术除了在多物种群落监测领域得到广泛应用推广之外, 还逐步在单物种特异性检测方面得到了长足的发展, 尤其在生态监测与资源评估领域展现出广泛应用前景。以TS=(“environmental DNA” OR eDNA) AND TS=(aquatic OR “water ecosystem” OR “freshwater” OR marine) AND TS=(“species-specific” OR “species specific”)为组合关键词在Web of Science总数据库进行检索、以“环境DNA AND水生生物”为关键词在知网和万方数据库进行检索, 共获得567篇文献。经过筛选与甄别, 最终筛选出152篇以水生生态系统中单物种特异性检测为研究主题的研究文献, 涵盖了222个不同水生物种的特异性检测案例(图 1、2)。图 1展示了2013年1月—2025年6月间, 水生生物eDNA物种特异性研究相关文献的年度发表趋势。整体来看, 相关研究自2016年起进入快速发展阶段, 文献数量逐年递增, 特别是在2017—2024年期间, 年发表量基本稳定保持在10篇以上, 呈现持续上升态势, 2024年达到峰值, 发表文献数量20余篇。进入2025年, 尽管统计数据尚不完整, 文献数量已有明显积累, 表明基于eDNA的靶向物种特异性检测已成为水生生态监测领域的重要研究方向之一, 研究热度仍在持续。根据图 2的统计结果, 截至2025年6月, 在利用eDNA技术进行水生生物物种特异性检测的研究中, 物种特异性检测相关研究在不同的分类类群的应用程度存在显著差异。其中, 鱼类(104项)和软体动物(49项)是物种特异性检测研究较多的类群; 甲壳类(16项)、两栖类(22项)、爬行类(13项)及水生哺乳类(11项)也占有一定比例; 而扁形/环节/棘皮/刺胞动物(13项)以及水生植物/藻类(4项)的相关研究则相对较少。这一分布格局说明基于eDNA的靶向物种特异性检测在濒危物种保护、外来入侵物种的监测预警, 以及生态系统管理中已逐步成为一种成熟且有效的工具, 但在水生植物、微生物类群中的靶向应用仍有拓展空间。部分具有代表性的靶向物种特异性检测研究包括:
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| 图 1 2013年1月—2025年6月所发表的eDNA特异性物种研究的文章数量 Fig. 1 Number of research articles published annually on species-specific eDNA (January 2013—June 2025) |
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| 图 2 eDNA物种特异性相关研究涉及不同分类类群的物种数量 Fig. 2 Number of species in species-specific eDNA studies categorized by taxonomic groups |
(1) 无脊椎动物: 如螯虾(Pacifastacus leniusculus)的种群动态监测[8]、入侵物种多棘海盘车(Asterias amurensis)的早期预警检测[9], 以及水母(Chrysaora pacifica)的快速识别与分布确认[10-11]等;
(2) 鱼类: 如大黄鱼(Larimichthys crocea) 与近缘小黄鱼(L. polyactis)的鉴别与资源评估[12-13]、濒危物种中华鲟(Acipenser sinensis)的分布监测[14-15]、洄游性鳗鲡(Anguilla japonica, A. marmorata, A. anguilla)的地理分布特征解析[16-17], 以及生活在溪流的岩石下的濒危物种尖须异齿鰋(Oreoglanis siamensis)的物种保护监测[18]等;
(3) 两栖类: 如清迈疣螈(Tylototriton uyenoi)的保护区生境评估与保护政策支持[19]; 中国大鲵(Andrias davidianus)的野外实时监测[20]等;
(4) 爬行类: 如入侵物种缅甸蟒(Python bivittatus)、非洲岩蟒(P. sebae)、红尾蚺(Boa constrictor)、亚马逊森蚺(Eunectes murinus)和黄水蚺(E. notaeus)的野外实时监测[21]等;
(5) 水生哺乳类: 如长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis)的空间分布追踪[3, 22]、中华白海豚(Sousa chinensis)的区域分布检测[23]以及日本水鼩(Chimarrogale platycephalus)的栖息地生态监测[24]等;
近年来, 水生环境中单物种eDNA检测研究主要呈现两大应用导向:
(1) 管理驱动型: 主要聚焦于入侵物种的防控预警、濒危物种的保护管理, 以及资源物种的资源评估, 服务于生态治理与可持续利用需求;
(2) 技术验证型: 侧重于在极端或复杂环境条件下验证检测方法的稳定性与适用性, 包括在低浓度eDNA、DNA降解严重样本或与近缘物种共存背景下的特异性和灵敏度测试。
虽然已有多项文献综述聚焦eDNA技术在淡水与海洋生态系统的应用进展, 主要强调宏条形码技术(metabarcoding)在群落多样性检测中的潜力[1-2, 25-26], 但目前针对单物种靶向特异性检测的技术体系研究现状与进展仍缺乏系统性梳理与总结。因此, 本文通过整合2013年1月至2025年6月间的相关研究文献, 全面回顾并综述了eDNA技术在水生生物单物种特异性检测和管理中的研究进展, 重点围绕引物设计策略、关键检测技术路径、面临的技术瓶颈及未来发展方向展开讨论, 以期为水生生态学研究人员、资源管理决策者及一线保护工作者提供切实的技术参考, 推动eDNA技术从实验室研究阶段迈向走向生态管理中的标准化应用。
1 水生生物单物种特异性eDNA检测技术体系水生生物单物种特异性eDNA检测的技术体系框架如图 3所示, 涵盖了从样品采集、eDNA的提取、靶标引物设计、基因与检测技术选择、方法学验证、结果解读到技术挑战应对及应用推广的完整环节。首先, 在样品获取与DNA提取阶段, 需要根据研究区域与目标物种特性, 选择合适的采样方式和保存方法, 并通过优化的提取方案保证eDNA得率。其次, 需根据目标物种的遗传特征, 选择适宜的靶基因片段(如mtCOⅠ、Cytb、12S rRNA、16S rRNA、D-Loop等), 以确保检测的特异性和灵敏度; 再次, 在检测技术选择与扩增阶段, 根据实际应用场景选择适当的检测方法, 包括常规PCR、qPCR、ddPCR等核酸扩增方法, 或LAMP、RPA等快速等温扩增技术。检测结果既可以通过荧光定量、熔解曲线判读, 也可结合LFA试纸条等便携读出方式。第四, 需要对所选方法进行系统验证, 包括引物的特异性检测、灵敏度评估与最低检出限确认, 以确保在低浓度或复杂环境样本中具备稳定性与可重复性。第五, 在检测优化与结果解读阶段, 研究者需结合抗抑制策略(如稀释法、添加抗腐殖酸试剂)和信号增强技术(如LFA试纸条、纳米材料传感技术), 提升检测的可靠性。结果解读需严格区分假阳性与假阴性, 并结合生态背景进行科学分析。此外, 针对引物设计、采样技术和环境干扰等挑战, 逐步形成标准化与公共化流程。同时, 将该方法拓展至种群动态追踪、遗传多样性评估及生态系统管理, 推动eDNA技术的广泛应用与持续发展。
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| 图 3 水生生物单物种特异性eDNA检测技术体系框架图 Fig. 3 Technical framework of species-specific environmental DNA detection in aquatic ecosystems |
引物设计是eDNA物种特异性检测的核心环节, 直接决定检测的特异性、灵敏度以及其在不同环境中的适用性。目前, 水生生物eDNA检测常用的靶基因主要包括: (1)线粒体蛋白编码基因: 包括COⅠ、Cytb以及NADH脱氢酶系列基因(ND2、ND4和ND5)。这些基因进化速率较高, 通常具备良好的物种分辨能力, 是物种特异性检测中最常用的分子标记。其中, COⅠ与Cytb的应用最为广泛, 已成为引物设计的核心靶标; ND系列则在部分研究中得到应用, 补充了检测的多样性。(2)线粒体核糖体基因: 12S和16S rRNA。这类基因片段相对保守, 并具有较好的通用性, 因此在跨类群比对与水生哺乳动物等特定类群的检测中应用较多。(3)线粒体控制区D-Loop, 该区段进化速率较高, 常用于种群遗传学和群体多样性研究, 但在物种特异性检测中可能因高变异性导致引物设计难度增加, 并存在假阴性风险, 因此应用比例相对较低。不同基因片段在物种分辨率、已有参考序列数量以及环境适用性等方面各具优势, 研究者通常根据目标物种的分类位置、进化亲缘关系及研究需求, 综合权衡后进行选择[2, 6]。图 4统计了2013年1月—2025年6月间已发表的水生物种特异性扩增研究中所采用的引物标记。结果显示, mtCOⅠ和mtCytb应用最为广泛, 是物种特异性引物设计的首选; mt12S rRNA与mt16S rRNA的应用比例次之; 而mtND2、ND4、ND5及mtD-Loop的使用比例较低, 主要出现在特定研究背景下的探索性应用。图 5进一步展示了不同物种类群所采用靶基因的比例分布情况。结果显示: 在水生无脊椎动物(如甲壳类、软体动物)的研究中, mtCOⅠ使用比例最高, 其次为mt16S rRNA; 在鱼类的研究中mtCytb应用比例最高, 且有少量ND系列基因应用; 在两栖类与爬行类的研究中mtCytb和mtND4的使用频率相对较高; 在水生哺乳类的研究中各类分子标记使用分布较为均衡。综上所述, 引物选择策略应根据目标物种的进化特征与研究目的进行综合判断, mtCOⅠ与mtCytb是目前最核心的物种特异性检测基因。
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| 图 4 水生生物物种特异性eDNA检测中常用靶基因统计 Fig. 4 Statistics of the commonly used target genes in species-specific eDNA detection for aquatic organisms |
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| 图 5 水生生物物种特异性eDNA检测研究中各类群采用的靶基因比例统计 Fig. 5 Statistics on the proportion of target genes used for species-specific eDNA detection in aquatic organisms across different taxonomic groups |
COⅠ作为线粒体蛋白编码基因, 因其拷贝数远高于核DNA, 特别适用于低浓度eDNA样本的检测, 且其拥有较为完善的跨物种数据库资源(如BOLD系统和MitoFish数据库), 为快速比对与目标物种身份验证提供了坚实基础[27]。基于其较高的种间变异性和种内相对保守性, COⅠ基因已成为目前水生生物物种特异性eDNA引物设计中应用频率最高的标记之一, 尤其在软体动物、甲壳动物和刺胞动物的研究中应用广泛。然而, COⅠ也存在一定局限性。在种内高变异的物种中, 序列差异可能导致假阴性结果, 而在近缘物种间序列过于相似时, 亦可能引发假阳性结果。这些问题在实际环境监测中需要特别关注, 研究者通常通过优化3'端的引物设计、引入探针或结合多标记验证来减小风险。Simpfendorfer等[28]利用COⅠ基因设计物种特异性引物, 结合常规PCR技术检测大齿锯鳐(Pristis pristis)的eDNA, 并通过测序分析确认了物种特异性, 同时评估了实验水族箱与野外水体中eDNA的检测可靠性, 揭示了该濒危物种在澳大利亚戴利河流域淡水栖息地的分布潜力, 为该物种的保护提供了新思路; Mauvisseau等[29]利用COⅠ基因设计物种特异性引物, 结合qPCR技术检测真蛸(Octopus vulgaris)的eDNA浓度, 并通过Pearson相关性分析、Wilcoxon检验及熔解曲线分析, 系统验证了eDNA浓度与真蛸生物量之间的正相关关系, 同时评估了实验水族箱与野外水体中eDNA的检测效率, 揭示了该经济物种在西班牙坎塔布连海渔业区的潜在分布区域; Boothroyd等[30]基于COⅠ基因序列设计了61 bp的超短片段物种特异性引物和探针, 采用qPCR技术成功检测到北美淡水环境中高度降解的眼斑雀鳝(Lepisosteus oculatus)的eDNA, 并通过Sanger测序验证了扩增片段的物种来源; 李苗等[31]基于COⅠ基因设计了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的物种特异性引物, 比较了不同的eDNA富集方法与提取方法对研究结果的影响, 建立了一套中国对虾eDNA技术的操作流程, 提高了中国对虾的检出率, 为其野外分布监测及生物量评估提供了技术支撑。综上, COⅠ基因是目前最常用的水生生物eDNA物种特异性检测靶基因, 但同时也存在假阴性和假阳性的潜在风险。因此, 在实际应用中应结合物种特征和实际研究目标, 综合考虑多种标记与验证手段, 以提升结果的可靠性。
1.1.2 线粒体细胞色素b (mtCytb)Cytb基因在许多物种间表现出较高的种间分辨率, 在鱼类、两栖类、爬行类与水生哺乳类的物种特异性检测中得到了广泛应用。Knudsen等[32]针对波罗的海6种商业性捕捞鱼类(大西洋鲱Clupea harengus、大西洋鳕Gadus morhua、大西洋鲭Scomber scombrus、欧洲鳗鲡A. anguilla、欧洲比目鱼Platichthys flesus和欧洲鲽Pleuronectes platessa)的mtCytb和mtND4基因序列设计了长度约100 bp的短片段扩增引物, 并结合TaqMan探针及qPCR实现了特异性检测, 验证了eDNA浓度与底拖网单位捕捞努力量渔获量(CPUE)之间的相关性, 验证了其作为海洋鱼类资源监测补充手段的可行性; Krishnan等[33]针对革胡子鲶(Clarias gariepinus)mtCytb基因的特定区域(171 bp)设计引物, 通过严格的生信筛选和实验验证, 确保其对目标物种的高特异性(无同属近缘种及相近科物种的交叉扩增), 并基于qPCR技术在印度海得拉巴市11个水体样本中成功检出目标物种, 为该入侵物种的监测与管理提供了高效可靠的技术支持。然而, He等[34]在对雅鲁藏布江等青藏高原水系的裂腹鱼类(主要为裸鲤属及相关类群)的研究中指出, mtCytb基因对经历快速适应性辐射的类群的物种区分能力有限, 可能会由于分辨率不足导致错误判定。因此, 在实际应用中, 需要结合其他标记(如mtCOⅠ或mt16S rRNA)进行交叉验证, 以确保检测结果的准确性。
1.1.3 线粒体控制区(mt D-Loop)D-Loop区位于线粒体基因组的非编码区, 因其进化速率较快, 通常作为群体遗传学分析与个体识别的分子标记。然而, 其在eDNA物种特异性检测中的应用存在显著局限性: 其种内保守性相对较低, 可能导致引物无法覆盖全部单倍型而产生假阴性。因此, D-Loop在eDNA检测中通常不是首选标记, 更多是作为mtCOⅠ、Cytb、12S/16S rRNA等常用靶标的补充, 或在结合eDNA的群体遗传研究中使用。Tang等[3]基于长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis)的D-Loop区设计了物种特异性引物, 成功应用于其在长江流域的监测, 验证了该标记在水生哺乳类检测中的潜力; Dugal等[35]首先通过Cytb-TaqMan探针(105 bp)对疑似存在鲸鲨(Rhincodon typus) eDNA的海水样本进行预筛选, 在确认阳性样本后, 进一步基于D-Loop(412 bp)片段结合Illumina测序开展单倍型分析, 提示D-Loop并不适合直接用于物种存在/不存在的检测, 而是作为后续高分辨率群体遗传分析的工具; Oliver等[36]基于西印度洋矛尾鱼(Latimeria chalumnae) D-Loop区设计了特异性引物, 结合PCR与高通量测序在南非iSimangaliso海洋保护区的深海峡谷中成功检测到西印度洋矛尾鱼的存在, 扩展了eDNA技术在复杂水动力环境和深海地形中的应用潜力。总体来看, D-Loop在eDNA研究中的价值主要体现在种群遗传多样性与单倍型分辨层面, 而非物种快速鉴定。在实际引物设计中, 应结合多样本序列构建目标物种共识序列, 并利用近缘种比对锁定3'端错配位点, 以降低假阴性风险[37]。
1.1.4 线粒体核糖体基因(mt12S rRNA和16S rRNA)12S rRNA和16S rRNA属于线粒体基因组编码的核糖体RNA分子, 基因片段较短, 引物通用性强, 在eDNA样本中具有较高的扩增成功率, 因此在早期的水生生物eDNA研究中被广泛应用, 尤其适用于群落水平的多物种宏条形码分析和系统发育研究[26, 38-40]。在这些应用中, 12S/16S rRNA能够较好地覆盖不同系统发育分支, 便于快速获得群落组成信息。然而, 在单物种特异性检测中, 12S/16S rRNA的适用性存在明显局限: 其序列较为保守, 近缘种间分辨率不足, 容易导致假阳性。Rodpai等[18]在开发泰国尖须异齿鰋(O. siamensis)的物种特异性引物时发现, 基于12S/16S rRNA的序列差异不足以区分近缘物种O. colurus和O. vicinus, 进而基于mtCOⅠ区域设计引物实现物种特异性检测; Marques等[4]基于eDNA开展耳廓扇贝(Pinna nobilis)的物种特异性检测时, 初步筛选的16S rRNA引物由于扩增效率不足(凝胶条带信号较弱)而被弃用, 最终采用了基于mtCOⅠ设计的物种特异性引物以实现稳定检测。尽管存在这些局限性, 仍有一些研究证实了12S/16S rRNA在特定场景下的应用价值。Katano等[41]利用12S rRNA基因设计物种特异性引物与探针, 结合qPCR技术检测日本爪鲵(Onychodactylus japonicus)的eDNA浓度, 并通过Cohen’s Kappa一致性检验、配对Welch’s t检验及Pearson相关性分析系统比较了eDNA方法与传统采样调查的检测效率, 同时评估了水面与石块下采样对eDNA浓度的影响, 揭示了该濒危物种在日本兵库县井保川流域的分布特征; Ono等[16]利用16S rRNA设计引物, 结合qPCR技术检测日本鳗鲡(A. japonica)与花鳗鲡(A. marmorata)的eDNA浓度, 并通过广义线性混合模型(GLMM)分析了环境因子(如水深、溶解氧)对两物种分布的影响, 揭示了其在日本九州西部河流中的分布差异。综上, 12S/16S rRNA更适合用于宏条形码和系统发育研究, 而非所有物种的特异性检测。在需要区分近缘种或研究快速辐射类群时, 存在分辨率不足的缺陷, 研究者更倾向于选择mtCytb或mtCOⅠ等基因作为主要靶标, 并在必要时将12S/16S rRNA作为补充标记。
1.1.5 线粒体NADH脱氢酶2、4和5(mtND2、ND4和ND5)ND2、ND4和ND5基因是线粒体NADH脱氢酶亚基基因, 有较高的种间变异性和相对较低的种内变异性, 因此在部分水生生物(尤其是鱼类、两栖类和爬行类)的物种特异性eDNA检测中得到了应用。这些基因片段可作为mtCOⅠ、Cytb的补充, 用于解决部分类群中传统标记分辨率不足的问题。Osathanunkul等[19]基于ND2基因设计了泰国清迈疣螈(T. uyenoi)的物种特异性引物与探针, 结合qPCR技术检测其eDNA浓度, 研究通过特异性验证、灵敏度测试(检出限LOD为7.99拷贝/反应)与实地验证, 系统评估了该方法的可靠性, 结果表明该方法能够可靠追踪濒危两栖类的野外分布; Xu等[42]利用ND4基因并结合巢式PCR方法开展中华鲟(A. sinensis)的物种特异性检测, 通过长江中下游大范围同步采样, 揭示了该物种的季节性迁徙模式, 且检测结果与已知的繁殖扩散规律一致, 验证了其在大尺度洄游鱼类监测中的应用潜力; Dunn等[43]利用ND5基因设计物种特异性引物与探针, 结合qPCR技术开展钝吻真鲨(Carcharhinus amblyrhynchos)与白边真鲨(C. albimarginatus)的物种特异性监测, 并将结果与水下视觉普查和声学遥测数据进行比较, 评估了该方法揭示不同保护压力下鲨鱼分布差异的能力, 结果表明该检测方法能有效反映鲨鱼的大尺度分布格局。总体来看, ND2、ND4和ND5在特定类群中可作为物种特异性检测的有效靶标, 但相较于mtCOⅠ和mtCytb, 它们在应用广度上仍有限。因此, 这些基因更适合作为补充性或类群特异性标记, 用于提升检测的分辨率与适用性。
1.2 检测技术分类与比较单物种特异性eDNA检测技术的选择需紧密围绕研究目标、环境条件与实际条件(如检测成本、设备等)展开, 其常用方法包括常规PCR、实时定量PCR(qPCR)、微滴数字PCR(ddPCR)、CRISPR-Cas系统以及环介导等温扩增(LAMP)等技术。我们统计了2013年1月—2025年6月间各水生生物eDNA特异性检测研究中采用的检测技术类型数量分布(图 6)。其中, qPCR因其操作相对简便, 灵敏度高且成本相对较低, 成为了物种特异性eDNA研究的首选技术方法, 而其他方法也在各自适用的场景(如极低丰度检测、野外快速筛查等)中展现出独特价值, 技术体系的多样化发展有助于满足不同监测场景下的实际需求。以下我们从技术原理、靶基因适配性、性能与应用场景等方面系统解析各类检测技术的优势与不足(表 1)。
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| 图 6 不同技术类型在物种特异性eDNA研究中的应用分布情况 Fig. 6 Application distribution of different technology types in species-specific eDNA research |
| 检测技术 | 灵敏度 | 是否定量 | 成本水平 | 便携性 | 优势 | 局限性 | 应用场景 |
| qPCR | 高(约 0.5 copies/μL) |
是 | 中等 | 需实验室设备 | 技术成熟, 特异性好, 应用最广 | 易受抑制剂影响, 需标准曲线、假阳性风险 | 稳定条件下的常规检测与动态种群评估 |
| ddPCR | 极高(约 0.05 copies/μL) |
是 | 高 | 需专用设备 | 绝对定量, 耐抑制剂, 假阳性率低 | 成本高, 操作复杂, 耗时长 |
极低丰度目标物种检测, 高浊度或复杂环境样本 |
| CRISPR-Cas | 极高(可达阿托摩尔级) | 否 | 中等偏高 | 潜在便携(开发中) | 快速反应, 高特异性, 适合现场检测 | 依赖预扩增, 靶标受PAM序列限制, 难以定量 | 快速现场筛查, 近缘物种高特异性识别 |
| LAMP | 高(0.002 ng/反应) | 是 | 低 | 极佳 | 高灵敏度、高特异性、快速、便携设备支持、免DNA提取 | 低浓度样本定量重复性差、易产生非特异性扩增、极端环境稳定性不足 | 入侵物种的早期预警、野外实时监测、保护区或封闭海湾的低密度种群检测 |
| 常规PCR | 较低 | 否 | 中等 | 需实验室设备 | 特异性好, 检测便捷, 应用技术成熟 | 无法定量, 耗时相对较长, 灵敏度较低, 易产生假阴性结果, 大量样本在电泳槽混用易产生假阳性结果 | 稳定条件下的大批量样本定性检测 |
| 巢式PCR | 较高 | 否 | 低 | 需实验室设备 | 高灵敏度、高特异性、成本低 | 无法定量、灵敏度低于qPCR、操作步骤多(需两轮PCR)、污染风险较高 | 低密度物种检测、濒危物种和入侵物种的大范围监测分布监测 |
qPCR被广泛认为是eDNA物种特异性检测的“金标准”, 其原理是通过荧光探针(如TaqMan)或嵌入染料(如SYBR Green)实时检测DNA扩增, 并依据阈值循环数(Ct值)定量目标eDNA浓度[44]。其操作简便, 特异性高, 灵敏度高(检出限可达0.5 copies/μL)[45]。qPCR在实验室条件下表现稳定, 已经被广泛应用于濒危物种(如长江江豚)的种群调查监测[22]及入侵种, 如欧洲青蟹(Carcinus maenas)的早期预警[46]等。Zhang等[47]基于mtCytb基因设计特异性引物与TaqMan探针, 在东海44个站点检测镰鲳(Pampus echinogaster)的分布情况, 检出限达0.8 copies/μL, 阳性检出率为82%, 结果与拖网调查一致。在实际应用中, qPCR仍存在一些局限性: 其扩增过程易受环境抑制剂(如腐殖酸、多糖等)干扰, 从而导致检测灵敏度显著下降; 同时, 仪器依赖性较强, 需要配备实时荧光定量PCR仪。此外, 引物二聚体或非特异性扩增可能引发假阳性, 增加结果误判风险。因此, 研究者通常需结合熔解曲线分析以区分目标与背景信号, 或采用高特异性探针(如TaqMan-MGB)来进一步提高检测的准确性[48-49]。
1.2.2 微滴数字PCR(ddPCR)ddPCR通过将反应体系分割为数万个微滴并进行独立扩增, 基于荧光信号统计阳性液滴数量, 并利用泊松分布实现绝对定量, 无需依赖标准曲线[50]。该方法灵敏度显著高于qPCR(可达0.05 copies/μL)[4], 对PCR抑制剂具有更强耐受性, 尤其适用于检测低丰度样本或复杂环境(如高浊度河流)样本[51-52]。同时, 其假阳性率通常低于qPCR[53]。Baker等[52]基于ddPCR定量检测海水中虎鲸(Orcinus orca)的eDNA浓度, 并结合测序验证其生态型分类, 展示了ddPCR在开阔海域濒危物种监测的应用优势。然而, ddPCR所需设备昂贵, 操作复杂, 且检测中可能出现液滴“雨”(droplet rain)等信号模糊现象。此外, 当仅有1至2个液滴呈阳性时, 结果往往处于判读临界状态: 既可能由于非特异性扩增或污染而被视为假阳性, 也可能因信号不足而被归类为阴性。因此, 在实际应用中, 需结合多次重复检测和严格的阴性对照, 以确保结果的可靠性[51, 54-55]。
1.2.3 CRISPR-Cas系统CRISPR-Cas技术通过Cas12或Cas13核酸酶对靶标DNA/RNA序列进行识别并切割, 触发荧光或试纸条信号, 从而实现无需复杂仪器的快速检测[11]。该方法通常通过对线粒体基因组进行多序列比对, 在满足PAM位点(如Cas12a的5′-TTTV-3′)要求的同时, 结合近缘物种之间的碱基差异, 设计出高度特异性的靶标区域, 从而在近缘种间实现高精度区分[56]。Williams等[56]通过等温重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR-Cas12a系统, 针对大西洋鲑(Salmo salar) mtND5基因设计了特异性crRNA与引物, 在37 ℃等温条件下实现了大西洋鲑与褐鳟(S. trutta)的快速鉴别(< 2.5 h), 且灵敏度达amol级别, 为野外便携式生物传感器开发及生物多样性检测提供了新思路; Kim等[11]建立了RPA-CRISPR-Cas12a体系, 在1 h内即可完成水母(C. pacifica) eDNA的野外检测, 灵敏度达2 copies/μL。尽管CRISPR-Cas技术展现出极高的特异性和便携性, 但仍存在局限性。首先, 其检测往往依赖预扩增步骤(如RPA或LAMP), 增加了操作复杂性与潜在的污染风险。其次, 靶标选择受到PAM位点限制, 导致其并不适用mtCOⅠ、Cytb、12S rRNA等常规标记位点。最后, 该体系目前更适合“有/无”型快速检测, 难以进行精确定量[11, 54, 56]。因此, CRISPR-Cas技术在物种特异性eDNA检测中更多被视为一种新兴补充方法, 尤其在野外快速筛查和便携式应用场景中展现出独特价值[11, 56]。总体而言, 尽管CRISPR-Cas系统在特异性与便携性方面展现出显著潜力, 但目前仍属于新兴技术, 尚未成为水生生物eDNA物种特异性检测中的主流方法。
1.2.4 环介导等温扩增(LAMP)LAMP技术由Notomi等[57]于2000年首次提出, 最初主要用于病原体(如病毒、细菌等)的快速检测, 其核心依赖链置换型DNA聚合酶(如Bst酶)与多引物的协同作用, 在恒温(60~65 ℃)条件下实现靶标DNA的高效扩增。与传统qPCR相比, LAMP无需热循环仪, 可通过便携式恒温加热装置与检测模块(如光学读数或颜色变化监测)完成扩增与结果判读, 因此在野外条件下具有低成本、快速、简便的优势[57-58]。Hartle-Mougiou等[58]首次将LAMP技术应用于海洋入侵鱼类eDNA的定量检测, 构建了针对入侵地中海的斑鳍蓑鲉(Pterois miles) mtCOⅠ基因的比色定量检测方法(qcLAMP)。该方法利用PrimerExplorer V5软件设计了5条特异性引物并优化了引物浓度以抑制非特异性扩增及引物二聚体的形成(如BIP与LB引物间的潜在交叉反应), 结合pH敏感染料与便携式设备(Pebble-R), 在65 ℃恒温条件下40 min内完成扩增, 通过摄像头实时监测颜色指数生成定量曲线, 可覆盖5个数量级的线性范围(0.002~20 ng)。然而该技术也存在局限性: 首先, 要求靶标基因具备足够保守的区域作为引物结合位点, 限制了非保守区的应用; 其次, 在低浓度样本中(如0.002 ng), 其扩增时间(TTP)的变异系数较高, 重复性不如实验室qPCR稳定。最后, 由于LAMP使用多引物体系, 容易产生非特异性扩增及引物二聚体信号, 因此仍需严格的引物设计和体系优化, 以确保结果的准确性[58]。同样需要指出的是, LAMP技术虽在野外快速筛查中表现出色, 但其在实验室常规检测中的应用仍不及qPCR和ddPCR广泛, 尚未成为主流的标准化检测手段。
1.3 辅助技术eDNA检测技术的性能提升和应用拓展依赖于多类辅助技术的协同应用。首先, 侧向流动层析试纸技术(LFA/LFD)可与常规PCR或者重组酶聚合酶扩增(RPA)结合, 快速实现结果的可视化判读, 具有灵敏度高、成本低、操作简便的优势, 适用于现场便携式物种检测; 其次, 抗抑制剂策略是保证检测灵敏度的关键环节。针对腐殖酸、多糖等环境抑制剂对扩增反应的干扰, 可通过稀释模板、改进采样方法(如使用特定滤器)以及添加抗抑制试剂等方式有效降低影响, 从而提升检测的准确性与稳定性; 此外, 纳米技术(如碳纳米管芯片、激光光谱分析)在eDNA研究中逐渐被应用, 可实现快速且高灵敏的信号检测, 为复杂水体环境中的现场应用提供了新思路。同时, 测序技术(如Sanger测序和二代测序)在特异性验证和定量分析中发挥重要作用, 不仅能提升物种鉴定的准确性, 还能对目标DNA片段进行更精细的定量分析, 辅助验证扩增结果的可靠性。未来的发展趋势将更加强调方法与环境的适配性。例如, 在高浊度水域中, 可能需要结合高灵敏度标记(如mtD-loop区短片段扩增)与高分辨率检测技术(如ddPCR)进行联合应用。同时, 通过自动化与集成化设备的开发, 可进一步提升检测效率, 推动eDNA物种特异性检测从实验室走向标准化、常态化的现场应用。
1.3.1 侧向流动层析试纸技术(Lateral Flow Assay/ Lateral Flow Dipstick, LFA/LFD)LFA/LFD是一种便携式可视化检测技术, 通常与扩增方法结合使用, 包括PCR-LFA(常规PCR结合LFA)和RPA-LFD(重组酶聚合酶扩增结合LFD)。两者均可通过检测条带(测试线T与质控线C)实现结果的快速可视化: PCR-LFA利用常规PCR扩增后, 通过LFA试纸条读出结果, 操作简单, 灵敏度高; 而RPA-LFD则突破了PCR对热循环仪的依赖, 可在恒温条件下实现快速扩增, 更适合野外便携检测[21, 59]。Doyle等[59]首次将其应用于eDNA的物种特异性研究中, 通过PCR-LFA实现了大堡礁长棘海星(Acanthaster cf. solaris)的eDNA现场检测, 结合常规PCR扩增, 利用生物素/地高辛标记引物与市售PCRD™试纸, 仅需10 min即可完成可视化结果判读, 检测限达0.11 pg DNA(6.7拷贝/反应), 灵敏度接近ddPCR, 但检测成本减半, 为复杂海洋环境中低密度目标种群的检测提供了高效工具; Ling等[20]通过RPA-LFD结合Chelex 100快速提取, 40 min完成提取, 恒温(37 ℃)10 min扩增与5 min可视化检测, 实现了中国大鲵(A. davidianus)在野外的高效检测, 检测限达0.1 ng/mL, 优于常规PCR, 在黄山实地测试中, 3/4位点检测呈阳性, 验证了该方法在复杂水体中的高灵敏性和特异性。该方法技术设备需求低、操作简便, 一定程度上适用于水生生态环境中“低技术门槛”检测方案, 可结合便携式PCR仪, 在2 h内完成从扩增到现场检测的全流程, 显著提升了野外实地eDNA物种特异性检测的效率。但其仍存在一定的局限性: 需通过多组引物筛选及优化反应参数(如温度、时间、Mg²⁺浓度)降低假阳性的风险, 且无法实现定量检测, 限制了其在生物量动态监测或种群密度估算中的应用[21, 59]。
1.3.2 抗抑制策略在eDNA检测中, 腐殖酸(humic acids)和腐殖质(humic substances)是环境样本中最常见的抑制剂, 在DNA提取过程中常与目标DNA一同被富集, 可能直接干扰PCR反应体系, 导致检测灵敏度下降或产生假阴性结果[8, 60]。为缓解抑制效应, 研究者提出了多种优化策略。(1) 稀释DNA模板: 如10倍稀释, 可在一定程度上降低抑制剂的浓度, 并可通过比较稀释前后Ct值的变化(ΔCt)评估抑制效应。若ΔCt在2.82~3.82范围内(理论值为3.32), 通常认为抑制效应在可接受范围内[8]。(2) 采样优化: 在水体采样时, 建议采集较大体积(> 1 L)的水样, 并避免底泥扰动(采样深度高于底部约40 cm), 以减少腐殖质混入, 从源头上降低抑制剂含量; (3) 采用专门针对环境样品优化的试剂(如耐腐殖酸的Environmental Master Mix 2.0), 以及一次性滤膜或封闭式滤器(如Sterivex滤器), 不仅能有效降低抑制剂干扰, 还能减少交叉污染风险[8, 51]。通过上述策略的综合应用, 可以显著提高eDNA检测的灵敏度与可靠性, 为在复杂环境条件下的目标物种检测提供技术保障。抗抑制策略并非单一独立环节, 而应贯穿于采样、DNA提取到扩增反应优化的全流程, 以确保检测结果的准确性与可重复性。
1.3.3 纳米技术纳米技术近年来被探索性地应用于eDNA检测, 主要集中在提高灵敏度与特异性方面, 目前仍处于实验室验证阶段, 尚缺乏大规模野外应用案例。如微流体碳纳米管平台[61]: 将eDNA进行PCR扩增之后, 用碳纳米管芯片表面修饰物种特异性探针, 使碳纳米管的阻抗特性发生改变, 当目标DNA结合时, 阻抗值会显著增加, 可以通过电信号变化实时判定结果。该方法灵敏度高、特异性强, 能够实现快速、实时检测, 未来可能适用于港口船舶压载水中入侵物种的现场检测。激光透射光谱技术[62]: 在PCR扩增之后, 将PCR产物与功能化纳米颗粒混合, 目标DNA结合后引发颗粒尺寸增加, 然后通过激光透射光谱测量颗粒尺寸分布的变化(如峰值偏移), 判定目标DNA是否存在。该方法可在数分钟内完成检测, 在实验室条件下表现出高特异性和高灵敏度。
1.3.4 测序技术测序技术在物种特异性检测中主要起到结果确认和辅助分析的作用。Sanger测序通过扩增并测定特定DNA片段(如mtCOⅠ、Cytb), 可精确验证扩增片段是否来自目标物种, 准确度高, 特别适用于目标种与近缘种的区分, 以及单倍型分析。Sasano等[63]利用Sanger测序验证了qPCR阳性产物与黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)的mtCytb基因完全匹配, 并结合eDNA的时空分布数据揭示了黑鲷在Tango海湾(Tango Bay)的周年分布模式, 揭示了其对近岸栖息地的依赖性。二代测序(NGS)技术能够在一次实验中产生数百万到上亿条短片段reads(一般100~300 bp), 通过高通量覆盖和生物信息学比对, 可以有效降低因DNA降解带来的假阴性风险, 并提高在复杂样本中区分多物种及近缘物种的能力。与宏条形码不同, 在物种特异性检测中, NGS常用于辅助验证特定引物检测的准确性, 或深入解析目标物种的种群遗传结构。White等[64]利用Illumina MiSeq平台对eDNA样本中的16S rRNA和COⅠ基因进行高通量扩增子测序, 验证了针对洞穴鱼类白蛇胸鳝(Ophisternon candidum)所设计的物种特异性PCR检测方法, 并结合地下水采样数据揭示了该稀有物种在洞穴生态系统中的分布范围, 评估该技术在环境影响评估和监测中的潜力。值得注意的是, 高通量测序技术(如Illumina平台)虽然在某些近缘物种的区分上仍存在一定挑战, 但随着参考数据库的不断完善以及生物信息学分析方法的持续优化, 其分辨能力将进一步提升, 有望成为未来物种特异性检测中的重要支撑技术。
2 技术挑战 2.1 引物设计瓶颈在基于物种特异性的eDNA研究中, 引物设计虽已经是常规步骤, 但在实际应用中仍存在技术挑战, 其核心挑战在于靶基因区的选择及其在近缘种间的变异程度。近缘物种的序列相似性常导致错误扩增, 产生假阳性信号。引物区错配不足会导致非目标模板在低浓度下优先结合引物, 从而抑制目标DNA扩增, 其中设计引物3'端的特异性对区分近缘种尤为关键。Thomson-Laing等[65]在研究中指出, 由于长鳍鳗(A. dieffenbachia)与短鳍鳗(A. australis)的mtCytb基因序列相似性高达94%, 为其设计物种特异性ddPCR引物与探针面临巨大挑战。为此, 他们特意将引物与探针设计在种间变异最大的基因区段, 并重点确保在引物3'末端引入关键碱基错配, 从而成功避免了近缘种间的交叉扩增, 证实了引物3'端特异性对于区分高相似度物种至关重要。此外, 在多重PCR体系中, 引物间的互作可能形成引物二聚体, 导致出现假阳性或灵敏度下降, 尤其是在非目标DNA浓度较高的复杂样本中更为显著[48]。
2.2 采样与提取技术采样与提取技术作为常规步骤, 在实际应用中也仍然存在技术问题。在开放水域或复杂地形区域中, 传统采样方法常受限于人力与设备效率, 自动过滤设备的引入显著提高了采样通量与效率。Gonzalez Colmenares等[49]采用Hydrapak SeekerTM耐压瓶与VanDoorn水平点式采样器, 通过潜水员或船只部署实现了快速水样采集, 但是由于海流影响, VanDoorn采样器在下降过程中可能偏离鱼群密集区, 导致空间代表性下降。在浑浊水域(如河口、浑浊海水)或生态条件复杂的环境中(如密集的海草床), 水体样本的eDNA浓度可能因泥沙吸附或颗粒物遮挡而降低, 此时, 沉积物样本可作为eDNA的补充来源[56, 66-68]。Kirtane等[68]通过比较牟氏水龟(Glyptemys muhlenbergii)栖息地水体与沉积物的eDNA回收率, 证实沉积物中eDNA浓度更高, 并建议在富含有机质的沼泽等复杂水体环境中, 沉积物应作为eDNA的优先采样基质。然而沉积物提取存在预处理复杂、DNA降解累积(旧DNA)等问题, 而水体样本易受环境动态因素(如流速变化)影响, 导致两种环境介质间数据可比性下降[65-66, 69]。
2.3 环境干扰因素eDNA的稳定性与分布受多重环境变量影响。研究表明90%的eDNA会在采样后48 h内降解[70-71], 而高水温(35 ℃, 冷水湖中20 ℃)、UV-B辐射与微生物活动(微生物活性与温度、pH的交互作用导致降解速率非线性变化)都会加速DNA降解, 使得采样后的DNA保存和检测窗口较短[49, 72-73]。此外, 不同采样站点的水温、溶解氧(DO)、pH和电导率的差异亦会影响eDNA信号强度, 使不同站点结果难以直接比较。深层缺氧(DO约0 mg/L)环境下, 冷水鱼类(如红鲑Oncorhynchus nerka)可能被迫选择次优栖息地, eDNA检测难以区分是生物主动分布还是eDNA被动沉降导致的信号变化[73]。Zhang等[74]通过调控水族箱盐度(15~30)的实验, 发现黄鹂无齿鲹(Gnathanodon speciosus)的eDNA浓度在盐度变化范围内无显著差异(ANOVA, P > 0.05), 表明盐度在此范围内可能对eDNA浓度影响有限; 然而Eichmiller等[75]发现淡水环境中盐度升高可能加速eDNA降解, 因此盐度变化的具体影响还需结合具体物种与其他环境条件进一步综合评估验证。此外, 未来需通过多变量建模(如GLMM等)解析环境因子的综合作用, 以提升检测的可靠性与准确性。
2.4 标准化缺失当前eDNA技术在采样、保存、提取与检测各环节缺乏统一标准, 严重影响不同研究间的数据可比性。如采样方法(滤膜孔径、水样体积)、保存剂类型、DNA提取试剂盒选择以及实验过程中对照组的设置等操作细节缺乏统一规范, 导致相同物种在不同实验室的eDNA回收率和检测的阈值存在差异, 数据可比性较低。Thalinger等[76]提出的五级验证量表(1级至5级)为eDNA检测方法的标准化验证提供了系统框架(如表 2), 但目前仅有少数研究达到4级及以上标准, 大部分方法仍停留在1级或2级阶段。
| 等级 | 核心要求 | 附加说明 |
| 1级 | 1. 完成基础计算机模拟分析(in silico analysis) 2. 在目标物种组织样本中成功检测DNA 3. 通过引物(和探针)进行常规PCR扩增 |
基础验证层级, 仅需理论与实验室组织样本验证 |
| 2级 | 1. 全面报告PCR条件(如退火温度、循环次数等) 2. 对近缘非目标物种进行体外实验(in vitro testing) |
需验证引物特异性, 避免交叉反应 |
| 3级 | 1. 明确环境样本的提取与eDNA浓缩方法(如滤膜类型、沉淀试剂等) 2. 从环境样本中检测到目标物种 |
验证实际环境样本检测的可行性 |
| 4级 | 1. 明确最低可检测DNA浓度(LOD) 2. 在多个环境样本中检验方法的稳定性(extensive field testing) 3. 对共存非目标物种进行特异性测试 |
量化检测灵敏度与方法适用性 |
| 5级 | 1. 通过计算机模拟检查近缘种, 保证绝对特异性 2. 结合统计模型评估检测概率 3. 验证环境中生态与物理因素对检测结果的影响 |
实现高特异性、高精度、可重复的标准化检测 |
假阳性可能来源于引物或探针设计缺陷导致近缘物种DNA扩增; 采样工具交叉污染与实验室气溶胶、试剂污染; 或者是非生物源的目标DNA(如DNA通过鸟类粪便传播至非栖息地)造成的外源信号。假阴性可能来源于目标物种密度低于检测阈值; 高丰度的非目标DNA对引物位点的竞争性结合; DNA在流水系统中被稀释或受环境样本中抑制剂的干扰等[77]。Pinfield等[77]在虎鲸(O. orca)的研究中发现, 当环境中存在高丰度非目标物种时, 其eDNA可能通过竞争性扩增抑制目标信号增加假阴性概率。因此在实验过程中除了要严格控制防止污染之外, 还需要根据目标物种的生态习性和生存环境制定采样计划、增加采样体积等[77], 针对技术误差, 还可以结合多个基因靶点以及ddPCR技术等提高检测的灵敏度。Osathanunkul[53]通过多尺度占据模型(multiscale occupancy models)量化了qPCR与ddPCR的假阳性概率差异分别为0.129和0.009, 表明ddPCR在降低假阳性方面更具优势。Lehman等[78]提出了三重阳性判定标准(荧光阈值> 3 000 RFU、阳性液滴范围5 000~ 7 000 RFU、目标DNA浓度≥0.08 copies/μL), 显著降低检测过程中的假阳性风险。
3 创新技术发展方向 3.1 模型开发与一体化技术在全球气候变化的背景下[79], eDNA技术正逐步与生态模型和多源数据融合, 用于提升物种分布解析的空间精度和生态解释力。当前主要发展方向包括:
(1) 水动力模型开发: 通过将eDNA分布模式与水流动力过程相结合, 可以反推目标物种的实际分布情况。Lehman等[78]提出未来需结合水动力模型分析eDNA来源位置, 并开发多基因位点(如mtND2与mt12S rRNA)联检技术以提升检测的可靠性; Sansom等[55]使用稳定流模型(steady flow modeling)模拟eDNA在河流中的传递过程, 结合平流-扩散机制(advection-dispersion)预测下游特定位置的eDNA浓度, 并将数值模型与eDNA浓度及物种的现存量关联, 将水动力模型整合进具有更高时空分辨率的定量分析框架, 该方法显著提高了eDNA运输机制与濒危物种分布预测的精度, 但未来仍需结合实地观测数据(如河床形态变化)进一步优化模型参数, 提升地形稳定性、流量控制与建模精细度。
(2) 声学模型结合: 通过将eDNA浓度与声学回声强度进行回归分析, 可建立eDNA信号与生物量之间的定量关系。Yamamoto等[80]利用回声探测技术和eDNA方法对日本舞鹤湾内的日本竹䇲鱼(Trachurus japonicus)生物量进行研究, 构建了表层海水日本竹荚鱼eDNA浓度与回声强度之间的拟合模型, 结果表明二者之间存在显著的正相关关系, 验证了eDNA在生物量估算中的应用潜力。
(3) 内在潜能(Intrinsic Potential, IP)栖息地模型结合: eDNA方法与GIS技术和大尺度地理数据结合, 预测鱼类潜在栖息地分布[81-83]。Matter等[84]首次将IP模型与eDNA检测结合, 选取梯度(GRAD)、年均流量(MAD)、河谷约束(VAL) 3个地理水文参数, 构建了适宜性曲线(Suitability Curves), 有效预测了大鳞大马哈鱼(O. tshawytscha)幼体在流域内的潜在分布区域, 有效指导了后续eDNA采样点布局。
此外, 芯片实验室(Lab-on-a-Chip)设备的开发正推动eDNA检测向微型化、一体化方向演进, 野外、港口及其他现场环境下进行即时生态监测提供了新的技术可能。
3.2 标准化与公共化方法学标准化是eDNA技术走向常规监测应用的关键。Thalinger等[76]提出的五级验证量表(Level 1—5)为物种特异性eDNA检测技术的标准化提供了系统性框架(如表 2所示)。该研究通过评估327篇已发表文献中的546个物种特异性eDNA检测研究案例, 发现其中80%的分析案例及其方法仅发表于单篇论文, 且多数(30%)仅达Level 1标准, 凸显了当前该领域内方法验证不足的问题。该框架通过细分14个验证主题模块(如“计算机模拟分析”、“PCR条件”等), 为物种特异性检测提供了系统化标准路径(如近缘物种体外测试、检测概率建模), 有效推动了eDNA技术向高精度、可重复和标准化的方向发展。
在公共化应用方面, 公民科学与全球数据库建设正成为eDNA检测体系的重要组成部分。Crane等[85]通过美国国家河口研究保护区系统(NERRS)这一平台, 将科研人员、实习生和公民科学志愿者的采样力量进行整合, 建立了针对入侵物种欧洲青蟹(C. maenas)的标准化eDNA检测方法, 展示了公民科学在区域生态管理中的实用价值; Valsecchi等[86]通过物种特异性qPCR技术(靶向mt12S rDNA区域引物MmoMV2R), 结合“Spot the Monk”公民科学项目, 实现了地中海僧海豹(Monachus monachus)的非侵入性检测。依托Spot the Monk Observatory开放科学平台, 项目实时发布eDNA检测结果, 所分析的450份样本中约350份由公众(如航海组织、渔民及竞赛运动员等)参与采集。该平台通过实时数据更新、渐进式累积展示及FAIR原则(可查找、可访问、可互操作和可重用)提升了数据透明度, 并通过更简洁的语言解释分子检测与物种保护的意义, 激励了公众持续参与。其项目检测结果实时公开, 有效维持了志愿者的积极性, 证实了该模式在濒危物种分布追踪、栖息地评估及公众科普教育中的高效应用, 同时为地中海僧海豹的保护策略的制定提供了数据支持与协作范例[86-87]。未来, 随着全球数据库共建与技术标准化的推进, eDNA将进一步推动生态管理向精准化、科学化与大众化方向发展。
3.3 追溯种群历史沉积物中保存的古eDNA为追溯水生物种的长期演化历史提供了新途径。研究表明, 线粒体DNA可在湖泊沉积物中保存数千年至上万年[26]。Olajos等[88]通过分析瑞典Hotagen与Stora Lögdasjön湖的沉积物岩心(覆盖时间约10 000年), 成功重建了真白鲑(Coregonus lavaretus)的种群历史动态。该研究展示了通过eDNA技术结合沉积物岩心样本, 能够可靠地重建物种的长期生态演化过程, 为未来开展多种水生生物历史动态分析提供了重要的技术参考与应用前景。
3.4 种群遗传多样性评估eDNA技术不仅能够用于单物种的特异性检测, 还能通过结合高通量测序技术用于评估种群遗传多样性和群体遗传结构[89]。Parsons等[89]通过mtCytb、D-Loop区设计的特异性引物结合NGS测序, 对港湾鼠海豚(Phocoena phocoena)阿拉斯加东南部的种群开展了遗传分化研究, 结果表明区域内存在显著遗传分化, 表明当前的管理单元可能需要进一步细分, 并强调了eDNA技术在难以直接采样的海洋物种群体遗传研究中的应用潜力; Andres等[90]结合eDNA与鱼体组织样本通过高通量测序分析28个多态性微卫星位点, 对入侵北美大湖区的黑口新虾虎鱼(Neogobius melanostomus)进行群体遗传多样性研究, 发现基于eDNA的分析能检测到组织样本中66.8%的核等位基因(高频等位基因检出率达83.7%), 基于eDNA估算的等位基因频率与组织样本结果显著相关(R=0.69, P < 0.001), 并且成功揭示了与组织样本分析一致的群体遗传结构空间模式, 即显著的距离隔离现象。尽管eDNA方法会系统性地低估种群内的遗传多样性指标并高估私有等位基因数量, 且估算的群体间遗传分化绝对值偏高, 但其在揭示主要的等位基因频率模式和群体遗传结构方面与传统方法较为一致, 证明了eDNA用于群体遗传学研究的巨大潜力。Ai等[91]通过针对11个线粒体保守区域设计的RNA探针进行目标富集, 并结合Illumina HiSeq测序, 对两种虾虎鱼科的群体(Acanthogobius hasta与Tridentiger bifasciatus)开展了种群丰度估算研究。结果表明, 基于segregating sites数量的估算方法比传统的eDNA浓度定量更为稳健, 在受控实验中其预测值与真实个体数的相关性(R2=0.70)显著高于基于浓度的模型(R2=0.46), 证实该方法能有效减少个体间DNA贡献差异对丰度估算的干扰。尽管eDNA方法在多样性估值上仍可能存在系统性偏差, 但其在难以直接采样的水生生物中展现出显著优势, 为非侵入式群体遗传研究提供了可行路径。
3.5 三代测序技术的革新潜力三代测序技术凭借无PCR扩增依赖和超长读长的优势, 为eDNA研究带来了新的发展方向。该技术有望降低扩增偏好性和环境抑制剂带来的检测偏差, 并实现对完整线粒体单倍型的直接解析。现有研究多依赖PCR结合二代测序来探索eDNA中的单倍型多样性, 如Dugal等[35]通过靶向扩增与Illumina测序从海水eDNA中成功鉴别出鲸鲨(R. typus)的单倍型, 但仍受限于PCR扩增偏好性。随着测序成本下降和分析流程完善, 三代测序有潜力推动eDNA应用从物种存在性检测, 进一步拓展至种群个体识别和精细遗传结构解析。
4 结论与展望本文系统综述了水生环境中基于环境DNA的靶向物种特异性检测技术及其在水生生态系统监测中的应用进展, 梳理了其技术体系, 包括靶基因选择策略、多种检测方法的比较与适用场景, 以及辅助技术的整合应用等等, 概述了其创新技术发展, 尤其是在群体遗传多样性评估分析、结合三代测序方面的巨大潜力。
在水生生态系统监测与管理中, eDNA技术展现出巨大的潜力, 相较于传统侵入性采样方法, 其通过非侵入式手段精准识别水生生物种类, 实现了对水生生物的高灵敏度、物种特异性检测, 已成为水生生态系统监测与管理中的重要工具。尽管仍存在标准化与准确性等方面的挑战, 但其在物种保护、入侵预警及资源管理中的广泛应用前景, 标志着水生生态监测范式的根本转变。
在检测技术整合中, 未来eDNA检测的发展方向在于靶基因选择、检测技术与辅助技术的深度协同。由于不同物种和环境条件差异较大, 需要结合分辨率、保守性及环境适应性来制定策略: (1)早期预警或高丰度种群调查: 可采用常规PCR、巢式PCR、LAMP实现快速、低成本的定性检测, 适合大规模初筛和常规检测。(2)静水环境及丰度适中种群: 推荐使用片段适中的编码区引物(如mtCOⅠ、Cytb), 结合qPCR实现灵敏定量; 必要时可进一步引入二代或三代测序, 提高丰度估算和时空分布的准确性。(3)流速适中、透明度高、近缘种较少的水体: 优先选择mtCOⅠ、Cytb等高分辨率的编码区片段, 结合qPCR, 在效率与准确性之间取得平衡。统计结果表明, 2013年1月— 2025年6月间mtCOⅠ/Cytb与qPCR的组合在特异性研究中应用比例最高(图 7)。(4)水体浑浊或近缘种重叠度高的环境: 适合采用短片段(100~200 bp)、错配性强的非编码区(如D-loop)片段, 结合ddPCR技术, 增强抗抑制能力并提升低丰度样本的检出精度。(5)常规监测与动态评估: 可先用巢式PCR、常规PCR或结合LFA/LFD实现快速初筛, 对阳性样本再应用ddPCR精准定量, 从而兼顾快速性与高精度。总体而言, 未来的发展趋势是多技术融合与场景化适配: 即根据水体特征和目标物种的进化特性, 灵活选择靶基因与检测方法, 并结合自动化、便携式平台, 提高检测在保护区、入侵物种防控和渔业资源评估中的广泛适用性。
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| 图 7 不同靶基因与检测技术的组合在物种特性eDNA研究中的应用情况 Fig. 7 Application landscape of different combinations of target genes and detection technologies used in species-specific eDNA research |
在科学前沿领域, 相关研究针对单物种特异性的eDNA检测技术对各类检测手段进行了检测阈值的探索和标准化界定, 为更好地在生态学领域研究应用分子手段提供了重要支撑。此外, eDNA也为种群历史动态重建与遗传多样性评估提供了一种非侵入性的研究手段, 有助于未来多学科多领域进一步融合, 构建可复用的技术框架, 推动宏观生态研究与微观分子工具的协同创新。
在生态保护领域, 针对濒危物种的eDNA检测技术, 能够通过极低浓度的DNA痕迹, 追踪其分布与活动规律, 为栖息地修复和种群保护及恢复策略提供精准数据支撑。然而仍需建立eDNA数据共享与隐私保护机制, 避免濒危物种位置信息泄露引发的盗捕风险。在入侵物种防控方面, eDNA的早期预警能力尤为关键。恰如Yang等[9]的研究表明, 通过eDNA检测可在多棘海盘车(A. amurensis)入侵初期发出预警, 较传统调查提前响应, 为及时采取防控措施、降低经济损失和生态灾害提供了依据; Furlan等[92]首次将eDNA技术系统应用于入侵鱼类根除计划的成效评估, 通过统计模型评估了塔斯马尼亚Lake Sorell中低密度欧洲鲤(Cyprinus carpio)种群的存在及Lake Crescent的根除成功率, 揭示了eDNA技术在入侵物种管理中的应用潜力及高浊度环境下的检测挑战。这种“防患于未然”的策略, 不仅降低了生态修复成本, 还有效避免了因物种入侵而引发的生态系统崩溃风险。
在社会意义方面, 公民科学项目的兴起将公众的参与融入eDNA采样与监测网络, 通过更简化的技术流程与建设数据共享平台, 激发了群众对生态保护的关注与行动。同时, eDNA技术的高效性正逐步以实际监测数据推动政策的制定, 如对小黄鱼、大黄鱼等重要经济鱼类的资源评估, 以及渔业配额管理和禁渔期规划提供了科学依据, 实现了生态保护与资源可持续利用之间的平衡。此外, 推动便携式检测设备与自动化采样平台的普及, 正加速eDNA技术从实验室向河口、湖泊与海岸等一线生态场景的转化, 使其真正成为生态治理的“现场哨兵”。
从长远看, eDNA技术不仅代表着科学仪器与方法的革新, 更成为促进人与自然和谐共存的桥梁。通过DNA信号实现特异性物种的高效检测, eDNA技术为全球水生濒危物种的保护、入侵物种的防控以及资源可持续管理提供了兼具科学与人文价值的解决方案。随着技术的深化与推广, eDNA技术有望重塑人类守护水生生态环境的方式, 引领生态治理从被动响应迈向主动预警的新纪元。
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