溶酶体半胱氨酸组蛋白酶具有广谱的蛋白水解活性，能水解多种动物蛋白和植物蛋白(卢士英等，2004)。人体内目前发现了11种半胱氨酸组蛋白酶: 组蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、X和W(Turk et al，2012)。由于组蛋白酶B(CB)和组蛋白酶L(CL)与哺乳动物和人类癌细胞转移过程有关，因此备受关注。CB和CL能直接溶解或者间接激活细胞外基质如胶原蛋白、层粘连蛋白、基底膜等成分的溶解，从而促进肿瘤细胞向深部组织浸润，为癌细胞的转移打开通道(卢士英等，2004)。CB和CL在鱼类卵黄蛋白的水解过程中的作用亦得到广泛的研究与认可(Sire et al，1994; Carnevali et al，1999; LaFleur et al，2005; Carnevali et al，2006)。甲壳动物等节肢动物的卵子与鱼类卵子一样，含有大量的卵黄蛋白，该蛋白在酶的水解作用后方可为后续胚胎的发育提供营养。越来越多的研究报道表明CB和CL同样参与节肢动物卵黄蛋白的水解，如桑蚕Bombyx mori(Kageyama et al，1990)和软蜱Orithodors moubata(Fagotto，1990a，b)卵巢中发现了对卵黄蛋白具有水解作用的CL类似蛋白的存在，同样蚊子Aedes aegypti体内的CB类似蛋白酶亦参与卵黄蛋白的降解(Cho et al，1999)。有关经济虾类CL基因克隆及其表达研究报道较多。目前CL及其类似物cDNA全长已经从美国龙虾Homarus americanus(Laycock et al，1992)、挪威龙虾Nephrops norvegicus(Le Boulay et al，1995)、凡 纳滨对虾Penaeus vannamei(Le Boulay et al，1996)、刀额新对虾Metapenaeus ensis(Hu et al，2004)、盐水虾Artemia franciscana(Warner et al，2004)和日本沼虾Macrobrachium nipponense(Zhao et al，2013)体内分离获得。但是经济虾类CB基因目前仅有北极甜虾P and alus borealis(Aoki et al，2003)和斑节对虾Penaeusmonodon(EF213113.1，未发表)的相关报道。日本沼虾(M. nipponense)肉味鲜嫩，营养丰富，分布广泛，是我国重要的经济淡水养殖虾。本研究首次克隆了日本沼虾CB(MnCB)基因cDNA全长，并分析其蛋白结构，寻找其活性位点，预测其具有催化活性的结构; 并对其蛋白序列进行同源性和系统进化树的分析，显示MnCB序列和其它物种的关系; 采用荧光定量PCR(qPCR)的方法测定其在各组织及卵巢发育过程中的表达量，初步探讨其在日本沼虾体内的作用及与卵巢发育的关系，为日本沼虾体内该基因的功能研究提供一些基础知识。

日本沼虾(1.3—2.1 g)购自上海市铜川路水产市场。试验虾从市场购回后，于实验室水族箱中充气暂养一周后解剖，分别取卵巢、肝胰腺、鳃、肌肉、胸神经节、心脏、肠和血细胞等组织和细胞液氮中速冻，-80°C保存用于后续RNA抽提。其中卵巢不同发育阶段分别取样，其它组织均取自卵巢发育Ⅱ期的雌虾。每个组织均取8—12尾虾。卵巢发育分期采用6期法(Wu et al，2009)。

RNA采用Unizol试剂按照试剂说明书抽提。取抽提获得的1μLRNA用于凝胶电泳，检测RNA的完整性。取1μLRNA进行紫外分光光度测定OD₂₆₀/ OD₂₈₀比值，检测RNA纯度。取0.5μg RNA采用cDNA TaKaRa PrimerScript^TM第一链cDNA合成试剂盒(大连宝生物)合成cDNA。

用于5'RACE和3'RACE的cDNA分别采用Smart Race试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA，USA)和3'-RACE合成试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)按照说明书操作步骤合成。引物AP、AUAP、5'-CDS primer A、SMART II A Oligonucleotide和UPM均由RACE试剂盒提供。3'RACE和5’RACE特异性引物均按照日本沼虾卵巢EST文库中MnCB片段采用primer 5.0软件设计获得。MnCB 3'RACE特异性引物3'MnCBP1，3'RACE巢式引物3'MnCBP2。根据上述获得的3'端片断设定引物3’MnCBP3作为3'RACE特异性引物进行新了一轮3'RACE扩增，获得MnCB的polyA尾巴。MnCB 5'-RACE特异性引物为5'MnCBP1。上述所有特异性引物的序列及其T_m值见表 1。

核酸和蛋白序列相似性比较采用NCBI BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析，蛋白特性分析采用专业蛋白分析系统Expert Protein Analysis System(http://www.expasy.org/)，信号肽和结构域分析分别采用SignalP 3.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignaIP/)和结构域扫描程序Motif scan program(http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)分析，同源性分析采用ClusterW多序列比较软件(http:// www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)和Boxshade软件(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)进行阴影分析，系统进化树采用Mega软件包中的邻接法(NJ)构建。用于阴影分析和系统进化树构建的基因序列号见表 2。

MnCB qPCR引物序列为qCBF和qCBR(表 1)，内参基因为β-actin，引物序列来自文献(Zhao et al，2011)。qPCR反应体系: SYBR Premix Ex Taq(2×)10.0 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，cDNA 2.0 μL，10 μmol/L的引物各0.4 μL，ddH₂0 6.8 μL。反应程序: 95°C预变性1 min，95°C变性5 s，60°C退火40 s，40个循环。

MnCB和β-actin的表达量采用标准曲线法计算。标准曲线的制备: 将已知浓度的cDNA稀释成不同浓 度(10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5)，测定不同浓度cDNA的CT值，横坐标为cDNA浓度对数，纵坐标为CT值作图，获得cDNA浓度对数与CT值之间的标准曲线。将未知样品的CT值代入标准曲线，计算出样品的cDNA浓度。MnCB的相对表达量采用MnCB和β-actin表达量的比值表示最终表示为平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用One-way ANOVA对日本沼虾各组织中MnCB基因表达量进行统计分析，用Duncan氏多重比较法分析组间差异显著程度，显著水平为P<0.05。

3’RACE和5’RACE测序结果通过Bioedit软件拼接后获得全长为1643 bp的MnCB，cDNA序列和推导的氨基酸序列见图 1。该序列含有12 bp的5’-UTR，996 bp的ORF和702bp的3’-UTR(序列号: HM134079)。ORF区共编码331个氨基酸，此多肽包含16个氨基酸组成的信号肽、63氨基酸组成的前导肽和252个氨基酸组成的成熟肽三个部分，其理论pI为6.36，分子量为36.5 kDa。

图 1 MnCB cDNA及翻译的氨基酸全长 Fig. 1 Complete cDNA sequence and deduced amino acid sequence of MnCB斜体表示信号肽序列，下划线为前导肽，波浪线为成熟肽，方框为活性位点，下划线加粗斜体为加尾信号，双下划线为polyA，星号(*)为终止密码子

图选项

经多重比较后发现，MnCB与其它不同甲壳动物组蛋白酶B(CB)一样都存在一些保守的结构域(图 2)，且一般位于非信号肽序列部分。系统进化树的分析结果(图 3)显示: 牙鲆Paralichthys olivaceus、大西洋庸鲽Hippoglossus hippoglossus、斑马鱼Danio rerio和鲑鱼Salmo salar四种鱼类聚在一起，同为甲壳类的北极甜虾、斑节对虾和日本沼虾聚成一支，软体动物的文蛤Meretrix meretrix和环节动物的日本血吸虫Schistosoma japonicum分别自成一支。

图 2 MnCB序列与其它物种组蛋白酶B序列的多重比较 Fig. 2 Alignment of MnCB with other aquatic organisms homologues 阴影部分表示相同的序列，灰色表示保守但不完全相同的序列，空心箭头为活性位点，实心箭头为S2亚位点

图选项

图 3 MnCB与其它物种的组蛋白酶B的N-J系统发育树 Fig. 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of MnCB amino acid sequences from other animals

图选项

内标基因β-actin在各组织的表达量较一致，MnCB基因在测定的各组织中也均有表达，其中在心脏中表达量最高，肌肉、肝胰腺和胸神经节中表达量中等，肠、鳃和血细胞中的表达量较低(图 4)。

图 4 日本沼虾不同组织中MnCB基因的相对表达量 Fig. 4 Relative expression level of MnCB mRNA in different tissues of M. nipponense图中字母相同表示表达量差异不显著(P>0.05)，不相同表示表达量差异显著(P<0.05)，下同

图选项

不同发育阶段卵巢中MnCB基因表达变化过程见图 5。在卵巢的发育过程中，MnCB的表达量先增后降。从卵原细胞增殖期(Ⅰ期)发育至卵黄发生前期(Ⅱ期)，MnCB表达量显著增加，增至Ⅰ期2倍左右，至初级卵黄发生期(Ⅲ期)MnCB的表达量急剧增加，分别为Ⅱ期和Ⅰ期表达量的5倍和10倍左右，差异显著(P<0.05)，次级卵黄发生期(Ⅳ期)表达量继续增加，但是Ⅳ期和Ⅲ期的表达量差异不显著(P>0.05)，成熟期(V期)下降。产卵后(VI期)、V期和Ⅱ期两两差异均不显著(P>0.05)。

图 5 日本沼虾卵巢不同发育阶段MnCB mRNA的相对表达量 Fig. 5 Temporal expression profile of the MnCB transcript in the ovary of M. nipponense during ovarian development柱状图上字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)

图选项

多重比较结果显示CB蛋白在进化过程中保守性较强，且这些保守序列主要位于非信号肽部位。通过CB保守序列建立的N-J系统树显示几种鱼类聚为一支、几种甲壳类聚为一支，该结果和传统的分类结果一致。

MnCB氨基酸序列中具有4个活性位点: Gln¹⁴³、Cys¹⁴⁹、Asn²⁸⁸和His³⁰⁹。CB属于C1 家族多肽酶，该家族酶的催化残基为Cys和His形成的二聚体。另外朝向His咪唑环的Asn和位于Cys残基前面的Gln在催化过程中也起非常重要的作用，Gln具有帮助Cys残基在催化过程中形成氧阴离子洞的作用。另外MnCB氨基酸序列中具有6个S2亚位点: Phe152、Pro153、Ala170、Gly274、Ala277和Glu322。S2亚位点是木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶的口袋结构，这一结构有利于与大疏水残基或芳香残基结合，而且CB基因口袋结构的底部还具有可以与Arg结合的Glu。

文献报道显示组蛋白酶通常由16—18个氨基酸的信号肽、62—100个氨基酸的前导肽和220—230个氨基酸的成熟肽组成(Berti et al，1995; Lecaille et al，2002)。本研究克隆得到的MnCB亦由信号肽、前导肽和成熟肽三个部分组成，其氨基酸数目分别为16、 63和252，信号肽和前导肽的数量介于上述报道范围之内，成熟肽超过上述范围。这一结果与北极甜虾P. borealis中的报道一致， 北极甜虾组CB的成熟肽为253个氨基酸(Aoki et al，2003)。组蛋白酶合成之初没有活性，以酶原的形式存在，随着pH值的改变，溶酶体减弱前导肽和催化位点之间的连接，改变酶原的构象，使之变成具有活性的酶，H⁺-ATP酶使卵巢中pH值降低，促进酶原的激活(Fagotto，1995; Kwon et al，2001; Selman et al，2001; Turk et al，2001; Raldúa et al，2006)。

本研究测定日本沼虾MnCB广泛存在于各组织中，其中心脏中表达量最高，胸神经节、肝胰腺和肌肉中的表达量均较高。MnCB在心脏和肌肉中的高表达可能与CB 能降解肌球蛋白、肌钙蛋白、原肌蛋白和肌动蛋白的作用有关(陈磊等，2008)。肝胰腺在甲壳动物体内扮演着极其重要的角色，不仅具有消化吸收的作用，而且具有重要的免疫功能，另外日本沼虾肝胰腺还是卵巢发育的重要营养来源(Zhao et al，2013)。所以肝胰腺中MnCB高表达可能与CB兼有胞内消化和抗原加工的功能有关(卢士英等，2004)。肝胰腺中CB高表达在北极甜虾中也有类似的研究报道(Aoki et al，2003)。另外，同样具有胞内消化作用的CL在美洲龙虾(Laycock et al，1992)和挪威龙虾(Le Boulay et al，1995)肝胰腺中亦高度表达。甲壳动物的胸神经节是重要的神经内分泌器官，可以分泌GSH等性腺刺激激素从而促进卵巢发育(穆淑梅等，2004)，而CB具有激素活化的作用(卢士英等，2004)，所以日本沼虾胸神经节中MnCB的高表达可能与MnCB活跃激素分泌的功能有关。

甲壳动物的卵黄蛋白原(Vg)按照合成来源可以分为内源性和外源性。卵巢自身合成的为内源性，卵巢以外的组织，如肝胰腺、脂肪体或滤泡细胞中合成的为外源性。外源合成的Vg，通过血液循环运送至卵母细胞，通过膜受体结合后进入卵母细胞中(张士璀等，2002)。Vg在卵母细胞的成熟过程中被分解为脂磷蛋白、高磷蛋白和β’组分等卵黄蛋白(Vn)，储存于卵黄颗粒中，Vn进一步水解为氨基酸为胚胎发育提供营养(Finn，2007)。Vg水解为Vn进而水解为氨基酸均需要水解酶的参与。有研究表明CB和CL在甲壳动物该水解过程中发挥着重要的作用(Fagotto，1990a，b; Kageyama et al，1990; Cho et al，1999)。本试验qPCR测定结果显示日本沼虾卵巢中MnCB的表达量与卵巢的发育程度有关，随着卵巢的发育，MnCB表达量逐渐增加，卵巢发育至初级卵黄发生期表达量急剧增加，次级卵黄发生期表达量继续增加，并达到最大值，成熟期下降。这表明MnCB与日本沼虾的Vg或者Vn的水解有关。有研究表明组蛋白酶D(CD)和CB蛋白活性在海鲷Sparus aurata卵黄发生早期最高，且进一步的研究表明CD可以水解Vg，而CB对Vg没有水解作用，另外CL在卵黄发生后期活性最高，为Vn的水解酶(Carnevali et al，1999)。本课题组发现

日本沼虾组蛋白酶L(MnCL)在卵巢发育至次级卵黄发生期，表达量急剧增加并达到最大值(Zhao et al，2013)，也就是说，在卵巢发育过程中MnCB基因表达量增加比MnCL早，这和海鲷的研究结果一致(Carnevali et al，1999)。斑马鱼中CB不仅可以直接水解Vn，而且还可以激活CL的活性，促进CL对Vn进行水解(Carnevali et al，2006)。日本沼虾卵巢发育至Ⅲ期MnCB基因表达急剧增加，Ⅳ期MnCL基因急剧增加， 这种先后关系也许暗示着MnCB和MnCL之间的某种关联，也许如斑马鱼中MnCB可以激活MnCL的活性具有某种的激活作用。