水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一类参与生命活动中水分子跨膜运输的调控蛋白，属于主要内嵌蛋白超家族成员(major intrinsic protein superfamily)，它主要介导水分由低渗区向高渗区的跨膜转运，也能转运甘油、尿素、氨水等中性小分子。自从Pretson等(1992)发现了第一个水通道蛋白1(CHIP28)以来，研究人员已经发现水通道蛋白广泛分布于古菌、真菌和真核生物组成的三界系统中。水通道蛋白在脊椎动物和植物中已经有很多研究报道，人类13种水通道蛋白(从水通道蛋白0到12)已经被发现并且鉴定; 但是，无脊椎动物水通道蛋白的研究相对较少，并且主要集中在模式生物线虫、果蝇和昆虫中; 在软体动物中研究甚少(Yang，2000; Huang et al，2007; Campbell et al，2008; Ishibashi et al，2011; Pieńkowska et al，2014)。水通道蛋白是一个多亚型的蛋白家族，根据氨基酸序列的同源性可以分为四种类型: 第一类为AQP1-like型(包括AQP0，1，2，4，5和6，属于典型的传统AQP，只转运水分子)，第二类为AQP3-like型(包括AQP3，7，9和10，属于水甘油通道蛋白，除了水分子，还可以转运甘油、尿素、氨水等中性小分子)，第三类为AQP8-like型(只包括AQP8这一种传统水通道蛋白)，第四类为AQP11-like型(包括AQP11和12，属于非传统AQP)(Soto et al，2012)。所有的水通道蛋白都是以同源四聚体形式存在于细胞膜表面，每个单体包括6个跨膜区段(Ⅰ—Ⅵ)和5个环形结构(loopA-E)。根据“砂漏”模型(Agre et al，1993)，B环和E环从两侧半嵌入膜内形成一个开放式狭窄的水通道。保守的NPA基序(Asn-Pro-Ala)和选择性水孔构件ar/R(aromatic/arginine，芳香族/精氨酸区)被认为是最主要的控制水或其它中性小分子渗透性的关键区域(Eric et al，2006)。

香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)是我国华南沿海养殖的主要经济种，主要分布在广东、广西等地，年产量在130多万t，产值在80—100亿元(中国渔业年鉴，2013)。香港牡蛎与其它牡蛎种类相比较，其价值主要体现在体大肉肥、味道鲜美，另外其市场价值远高于其它种类牡蛎，深受广东、广西、港澳、东南亚一些国家消费者青睐(张跃环等，2012)。作为河口区域典型牡蛎经济种(Lam et al，2003)，它对低盐有较强的抗性，但对高盐仍具有一定的耐受性，更适宜于栖息在河口咸淡水环境(谢忠明，2003)。水通道蛋白作为促进水分子跨膜运输的重要蛋白，参与渗透平衡的调节，在盐度变化剧烈的环境中发挥重要作用。目前，对编码牡蛎水通道蛋白的基因研究甚少，且不清楚盐度胁迫下水通道蛋白基因的表达特性。因此，本文采用RACE技术首次克隆了香港牡蛎水通道蛋白1(AQP1)基因cDNA全长，分析该基因编码蛋白序列特征、理化性质和空间结构，通过实时荧光定量PCR技术分析该基因在香港牡蛎中的组织分布及7天盐度胁迫下的表达情况，旨在为进一步研究香港牡蛎的广盐适应机制提供分子理论基础。

实验材料为壳高在120mm左右的2龄香港牡蛎，采自广东省阳江市阳西县程村。在实验室27°C，盐度为18海水中暂养一周后，选取健康香港牡蛎个体，快速吸取出淋巴液，离心(12000 r/min，30s)后弃上清，立即加入等量TRIzol reagent(Invitrogen公司)重悬沉淀，继续提取RNA或者冻存于-80°C。另外，取下小块外套膜、鳃、闭壳肌、消化腺和整个心脏，加入1mL TRIzol reagent，匀浆，继续提取RNA或者冻存于-80°C。

盐度处理时，将200只健康牡蛎随机分为4组，即4盐度组、18盐度组、32盐度组和42盐度组。由于香港牡蛎最适盐度范围为10—20(谢忠明，2003)，所以本实验以18盐度组作为对照组。用0.8%扁藻喂养，并且每天换3次海水。处理开始后，在时间节点1天(24h)、3天(72h)、5天(120h)和7天(168h)对四组分别随机挑取5个个体，取出一小块鳃组织，立即加入TRIzol，匀浆后冻存。

大肠杆菌菌株DH5α、克隆载体pMD^TM19-T、exTaq酶、DNAmarker、T₄ DNA连接酶、DNA片段纯化回收试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、逆转录试剂盒PrimeScriptⅡ1^st Str and cDNA Synthesis Kit 、用于定量实验的逆转录试剂盒Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser 购于宝生物工程(大连)有限公司。TRIzol试剂购于Invitrogen公司。RACE试剂盒BD SMART RACE cDNA Amplification kit 购于Clontech公司。实时定量试剂盒2×SYBR Green Master Mix 购于Roche公司。用罗氏的LightCycler 480Ⅱ仪器进行Real-time PCR。引物合成和测序工作在北京六合华大进行。

根据TRIzol reagent(Invitrogen公司)的产品说明操作提取淋巴及匀浆后的各个组织总RNA，用Nanodrop 2000c(Thermo公司)测定RNA的纯度和浓度，并用电泳检测RNA质量。用PrimeScriptⅡ1^st Str and cDNA Synthesis Kit进行cDNA第一链的合成，反转录产物用于PCR扩增或者保存在-20°C。

根据在NCBI 太平洋牡蛎EST数据库中获得的一段序列，设计引物ChAQP1F1和ChAQP1R1(表 1)，以混合各个组织cDNA第一链为模板进行PCR扩增。反应条件为: 94°C预变性3min; 94°C变性30s，50°C退火 30s，72°C延伸1min，共30个循环; 最后72°C延伸10min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化目的片段。将纯化产物连接至pMD19-T质粒载体上，转化至E. coli DH5α感受态细胞中，培养过夜，挑取单克隆进行菌落PCR验证，阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。测序结果在NCBI上进行Blast比对，初步确定获得片段为香港牡蛎水通道蛋白1基因。

根据上述克隆获得的片段序列，设计用于5’RACE扩增的基因特异性引物ChAQP1R2和ChAQP1R3，用于3’RACE扩增的基因特异性引物ChAQP1F2和ChAQP1F3(表 1)。按照BD SMART RACE cDNA Amplification kit试剂盒说明，利用引物GR5P/ChAQP1R2和GR3P/ChAQP1F2进行5’RACE和3’RACE第一轮反应，反应条件为: 94°C 3min; 94°C 30s，72°C 2min，5个循环，94°C 30s，70°C 30s，72°C 2min，5个循环，94°C 30s，68°C 30s，72°C 2min，25个循环; 72°C 10min。以第一轮PCR产物为模板，引物GR5NP/ChAQP1R3和GR3NP/ChAQP1F3进行第二轮反应，反应程序为: 94°C 3min; 94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，25个循环; 72°C 10min。PCR产物进行切胶回收纯化，连T载体，转化，挑克隆，送测序，获得测序结果经Blast比对后，用DNAstar软件拼接所得序列片段，最后获得完整全长序列。

根据已拼接的基因序列设计特异性引物ChAQP1F4和ChAQP1R4(表 1)，PCR扩增香港牡蛎AQP1的编码区，反应条件为: 94°C 3min; 94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min，30个循环; 72°C 10min。1.2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，测序验证。

从NCBI蛋白数据库中获得水通道蛋白1同源序列，MatGAT2.02软件分析氨基酸序列的一致性(Tamura et al，2007)。ProtParam(http: //web.expasy.org/ protparam/)分析蛋白质基本理化性质。蛋白质保守结构域的预测由在线软件Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)完成(http: //smart.emblheidel- berg.de/)。氨基酸多序列分析由ClustalX 1.81软件完成。分子进化树由MEGA 4.0软件构建获得。蛋白质亲水性分析通过ProtScale在线服务器预测(http: //web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)(Kyte et al，1982)蛋白质三级结构预测在SWISS-MODEL中进行，用Rasmol 2.7.0.1查看预测的结构。

以香港牡蛎不同组织总RNA及不同盐度胁迫下鳃组织中总RNA 1µg为底物，按照Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser产品说明合成用于实时定量PCR的单链cDNA模板。根据全长AQP1序列信息，设计特异定量引物ChAQP1F5和ChAQP1R5; 以看家基因β-actin为内参基因，设计内参定量引物β-actin F1和β-actin R1(表 1)，用于测定香港牡蛎AQP1基因在不同组织中的时空表达量; 以看家基因GAPDH为内参基因，设计内参定量引物GAPDHF1和GAPDH R1(表 1)，用于测定香港牡蛎AQP1基因在不同盐度胁迫下的表达量; 定量PCR反应体系20µL为: 10 µmol/L的上、下游引物各2µL; 2×SYBR Green Master Mix(Roche，USA)10 µL; cDNA模板2 µL; 灭菌超纯水H₂O 4µL。定量PCR反应条件为: 95°C预变性1min; 95°C变性10s，55°C退火15 s，72°C延伸20s 共40个循环。为检测定量PCR的特异性，在反应结束时进行熔融曲线分析。数据由LightCycler 480Ⅱ1.5软件生成并且记录。采用${{\text{2}}^{-\Delta \Delta \text{Ct}}}$法分析香港牡蛎AQP1 mRNA在不同组织中的相对表达量。

采用SPSS软件包单因素方差分析法(one-way ANOVA)中的Duncan多重比较检验法对实时定量PCR中的数据进行分析，比较香港牡蛎AQP1在组织分布及不同盐度胁迫下鳃中的相对表达量(平均值±标准差)差异。

以香港牡蛎各个组织混合cDNA为模板，使用引物ChAQP1F1和ChAQP1R1进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测获得约600bp的核酸条带(图 1a)，测序获得核酸序列。将核酸序列在NCBI中Blast比对，初步确定获得香港牡蛎AQP1基因序列。再用特异性引物ChAQP1R2、ChAQP1R3和ChAQP1F2、ChAQP1F3分别进行5’RACE和3’RACE两轮PCR扩增，分别获得1条大小约503 bp(图 1b)和353 bp(图 1c)的核酸条带。将3段序列拼接后得到长度为1153 bp的香港牡蛎水通道蛋白1基因全长序列。其5’非编码区(UTR)长度为165 bp，3’非编码区长度为100 bp，基因编码区长为888 bp，编码295个氨基酸(图 2)。设计包含编码区及以外若干序列的特异引物ChAQP1F4和ChAQP1R4扩增获得1060 bp的核酸条带(图 1d)，经测序验证为目的基因，将此基因命名为ChAQP1。将序列提交至GenBank，获得登录号KJ704847。

图 1 香港牡蛎ChAQP1 PCR 扩增结果 Fig. 1 The PCR amplification products of ChAQP1 in C. hongkongensis M: DL2000 marker; a: 中间片段; b: 5'端片段扩增; c: 3'端片段扩增; d: 全长cDNA片段

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Protparam在线预测软件表明该蛋白分子式为C₁₄₆₃H₂₂₇₈N₃₇₀O₄₀₀S₁₄，分子量为31.89 kDa，等电点为8.61，负电荷氨基酸总残基数(Asp+Glu)为21，正电荷氨基酸总残基数(Arg+Lys)为24，脂肪系数为99.19，亲水性总平均数为0.439，为脂溶性蛋白，不稳定系数为20.16，属于一类稳定的蛋白。

SMART在线服务软件对获得的ChAQP1基因进行蛋白质结构域预测，结果表明有1个与该基因匹配的蛋白质结构域MIP(major intrinsic protein superfamily)，位于第31—243位氨基酸(图 2)。

图 2 ChAQP1的全长cDNA序列及推导的氨基酸序列 Fig. 2 The cDNA sequence of ChAQP1 and deduced amino acid sequences ORF区用大写字母显示, 5’UTR和3’UTR用小写字母显示。灰色阴影标示SMART预测的MIP结构域。椭圆框显示的是NPA基序。终止子用“*”表示

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ProtScale分析蛋白质疏水性表明，该蛋白二级结构中具有6个跨膜螺旋TM1—TM6，5个连接环A—E(图 3)。

图 3 ChAQP1疏水性图 Fig. 3 Hydropathy plots of ChAQP1 数字1—6表示跨膜结构域, 字母A—E表示5个连接环

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MatGAT分析表明，ChAQP1氨基酸序列除了与太平洋牡蛎氨基酸序列一致性为87.8%以外，与其它的都只有30%左右的一致性(表 2)。由于与人类AQP1氨基酸序列一致性为40.2%，故选择人类AQP1(PDB ID:1H6I)为模板，利用SWISS-MODEL中Target- Template Alignment进行ChAQP1蛋白三级结构预测。结果发现(用Rasmol查看)两者有相似的结构，都存在六个跨膜结构域，2个半跨膜结构域和5个连接环(图 4、图 5)。

图 4 ChAQP1蛋白预测的三级结构 Fig. 4 The predicted 3D structure of ChAQP1

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图 5 1H6I蛋白三级结构 Fig. 5 The 3D structure of 1H6I

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Clustal 同源多序列比对结果(图 6)表明ChAQP1有两个保守的NPA(天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸)结构基序，位于第93—95和第208—210位氨基酸处，这与其它物种AQP1中序列一致。ar/R选择性水孔构件由F73、H196、S205和R211四个位点构成，除了S205位点相对不保守，其它三个位点存在高度保守性，这表明ChAQP1属于传统的水通道蛋白，只允许水分子通过该孔道。另外，在第一个NPA基序上游发现有ISGGH序列(第87—91位)，在其它传统AQP氨基酸序列中也普遍存在。此结果进一步说明，水通道蛋白1的NPA基序和ar/R结构在不同物种中存在很高的进化保守性。

图 6 ChAQP1与其它物种AQP1氨基酸序列比对 Fig. 6 Multiple alignment of ChAQP1 amino acid sequences with other AQP1 proteins “*”代表一致, “: ”代表高度保守, “.”代表低度保守。2个阴影部分代表2个NPA基序, 椭圆标示ar/R结构并且方框标示ISSGGH序列。横线标示保守的跨膜结构域。AQPl 来源及GenBank登录号详见表2

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使用MEGA 4.0软件中的N-J建树方法对ChAQP1蛋白序列和其它物种中的AQP1及AQP家族成员构建分子进化树(图 7)。结果显示，AQP家族成员聚类分成4个主要分支，即AQP1-like，AQP3-like，AQP8-like和AQP11-like四类，ChAQP1属于AQP1- like分支。将AQP1-like分支序列中AQP1序列重新构建进化树(图 8)，结果表明，脊椎动物能较好地聚为一类，无脊椎动物则不能聚为一类。在无脊椎动物中，香港牡蛎与太平洋牡蛎聚为一类，亲缘关系最近，这显示了它们中水通道蛋白1相似性但也存在差异。

图 7 ChAQP1与其它物种水通道蛋白的系统进化分析 Fig. 7 Phylogenetic analysis of ChAQP1 with AQP family members of other species

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图 8 ChAQP1与其它物种AQP1的系统进化分析 Fig. 8 Phylogenetic analysis of ChAQP1 with AQP1 of other species

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ChAQP1 mRNA在各个组织中的表达量可以通过实时定量PCR的方法进行检测，结果表明ChAQP1基因在香港牡蛎鳃、外套膜、闭壳肌、消化腺、性腺、心脏和淋巴中都有表达，其中在闭壳肌中表达量最高，其次是外套膜、性腺、消化腺、鳃。心脏、淋巴中表达量较低(图 9)。

图 9 ChAQP1 mRNA在不同组织表达量分布图 Fig. 9 Tissue distribution of ChAQP1 mRNA expression level 每个bar代表平均值归一化的表达水平(n=3)

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7天盐度胁迫实验结果如图 10。香港牡蛎最适盐度为18，故以之作为对照组。低盐处理后(盐度为4)，ChAQP1基因的表达量与对照组表达量相近，并随盐度胁迫时间的延长维持在一个相对稳定的水平，1天、3天、5天、7天分别为对照组的1.06、0.90、0.72、0.92倍。在32高盐胁迫下，ChAQP1基因的表达量在前五天呈现出略微下降的趋势，分别为对照组的0.65、0.76、0.86倍，而在第7天恢复正常水平(1.11倍)。42高盐胁迫下，ChAQP1基因的表达量在前五天迅速下降，随时间延长维持在一个较低水平，分别为对照组的0.18(P<0.01)、0.48、0.28(P<0.05)倍，在第7天恢复正常水平(1.03倍)。

图 10 7天盐度处理对ChAQP1基因表达的影响 Fig. 10 Relative expression level of ChAQP1 was analyzed under salinity stress in 7 days 图中数据为平均值±S.E (n =5), 显著性差异用1个星号(P<0.05)和2个星号(P<0.01)标示

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本研究采用RACE技术从香港牡蛎中克隆获得其香港牡蛎水通道蛋白1基因ChAQP1(KJ704847)，对其进行蛋白保守区段预测发现，该蛋白具有一个典型的MIP结构域、6个跨膜螺旋、5个连接环。在氨基酸同源性序列比对中，ChAQP1含有两个保守的NPA基序，这与其它物种中水通道蛋白1一致; ar/R区氨基酸组成在F73、H196和R211这三个位点上与其它物种AQP1中的也是高度一致，这符合传统水通道蛋白的特性，ar/R区氨基酸形成的孔径正好允许水分子通过(Beitz et al，2006)。第一个NPA基序上游的ISGGH序列也是高度保守的，可见，ChAQP1是非常传统的，只允许水分子穿过双分子膜的水通道蛋白，在关键的功能结构域上具有较高的保守性。系统进化分析表明，该蛋白属于AQP-1like类型的水通道蛋白。对不同物种AQP1序列进行聚类分析发现，ChAQP1与同科同属的太平洋牡蛎AQP1遗传距离最近，与同为软体动物门的腹足纲蜗牛(Lymnaea stagnalis，Catascopia occulta和Stagnicola palustris)遗传距离比较近，而与哺乳动物中的人类及鼠遗传距离相对较远，符合其遗传进化关系。

组织分布结果显示ChAQP1 mRNA 在香港牡蛎主要组织鳃、外套膜、闭壳肌、消化腺、性腺、心脏和淋巴中都有表达，其中鳃、外套膜、闭壳肌、消化腺和性腺表达量相对较高些，这说明着ChAQP1可能在转运水分子的相关生理过程中起到重要作用。Moon等(1993)研究发现人类AQP1也存在各个组织器官组成型表达的现象，人类AQP1广泛分布于红细胞、肾、眼、肺和血管内皮细胞等组织中。Pieńkowska等(2014)研究蜗牛AQP1，发现在脑、肾、足和消化腺等组织器官中都有广泛分布。Tipsmark等(2010)发现大西洋鲑鱼AQP-1a也广泛分布在肠、肾、鳃、脑等组织中。在7天盐度胁迫实验中，以盐度18作为对照，当盐度达到42时，ChAQP1基因表达受到抑制，而在低盐(4)组没有太大的变化，在高盐(32)组呈现出略微下降的趋势。这与Meng等(2013)利用转录组数据分析太平洋盐度适应性时，发现的3个AQP基因在高盐(盐度为40)和低盐(盐度为10)下均为呈下调趋势的结果不太一致。这是因为太平洋牡蛎最适盐度为30，为了维持细胞膨胀与收缩的稳定，机体通过增加蛋白质磷酸化来降低水通道蛋白活性，从而保护机体免于更多水分的进入，而在盐度4到32范围内，香港牡蛎ChAQP1基因表达量和正常盐度下表达量波动不是很大，这说明在该盐度范围内AQP1基因参与盐度调节的能力是有限的，尤其是在低盐下。这种现象同样出现在鲈鱼中，Ivone等发现鲈鱼在低盐下，鳃组织中AQP1基因表达量并没有变化(Giffard-Mena et al，2007)。而在高盐下，AQP1基因表达量普遍存在下调趋势。在42盐度下，香港牡蛎ChAQP1基因表置信水平通过在每个分支节点上进行1000次重复获得。标尺显示发生0.2%概率氨基酸位点变异的长度。序列信息由缩写名、物种全名和登录号构成。方框标示ChAQP1蛋白达量显著下降，这说明机体通过降低该基因的表达来降低AQP1蛋白的活性，抑制机体内水分的流失，保持机体内水盐平衡，提高机体对逆境的耐受力。同样的现象也出现在大西洋鲑鱼中，从淡水到海水的过程中，鲑鱼AQP1-a基因在鳃中表达量也明显下调(Tipsmark et al，2010)。以上结果表明，在香港牡蛎中，AQP1参与了调节渗透压平衡，为探讨香港牡蛎广盐适应性提供一定的实验数据和根据。