微卫星标记是以2—6个核苷酸单位组成的串联重复序列，存在于绝大多数真核生物基因组中，因此又称简单序列重复(Simple sequence repeats，SSRs)和短串联重复(Simple t and em repeats，STRs)(Tautz et al，1984)。它由核心序列和侧翼序列两部分构成，核心序列高度多态，而侧翼序列则一般高度保守。相较于以往的分子标记，微卫星标记具有数量丰富、操作简便、重复性好、共显性遗传等优点(Schug et al，1998)，因此已成为水产动物种群遗传多样性分析、亲缘关系鉴定和遗传图谱构建等方面的有效工具(Chistiakov et al，2006)。

EST(Expressed Sequence Tag)即表达序列标签，是一段通过单向测序得到的200—250 bp核苷酸序列(侯战辉等，2008)。由于来源于cDNA文库，因此EST是功能基因的一部分，可以对其进行基因注释(邱樱，2013)。EST-SSR即存在于EST序列上的微卫星标记，与传统的基因组微卫星标记(Genomic-SSR)相比，EST-SSR标记开发成本低，可以节省大量的人力物力，并且在不同物种间具有一定的通用性(易少奎等，2013; 董迎辉等，2013)，因此已经成为新型高效的开发SSR途径。

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)又称黑鮶，俗称黑寨、黑老婆等，是分布在西北太平洋近岸的温水性岩礁栖息鱼种，广泛存在于黄海、渤海近海海域，为卵胎生鱼类。由于其肉质鲜美、营养丰富，而且生长较为迅速，已成为我国北方深水网箱养殖的重要经济鱼种。进行许氏平鲉的良种选育，既可保护自然资源，又可提高养殖效率，意义重大，而开发具有良好多态性的微卫星标记是进行遗传育种的基础。已有研究者采用传统方法开发了一些许氏平鲉Genomic-SSR标记(Yoshida et al，2005; An et al 2009; Bai et al，2011; Yasuike et al，2013)，但对EST-SSR标记的开发未见报道。本研究首次利用已发表的许氏平鲉EST序列进行EST-SSR标记开发，分析了与Genomic-SSR标记的差异，并检测了其在近缘种朝鲜平鲉(Sebastes koreanus)、褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)的通用性，以期为许氏平鲉良种选育提供条件。

许氏平鲉野生群体样品30个取自长岛附近海区，朝鲜平鲉样品8个取自大连，褐菖鲉样品8个取自威海乳山。尾鳍和肌肉样品暂存放在70%乙醇中，带回实验室后于-20°C冰箱保存。采用传统酚/氯仿/异戊醇法抽提基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性、NanoDrop2000紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度。DNA样品保存于-20°C冰箱中，实验前进行稀释，终浓度为50ng/μL。

从NCBI公共数据库(http: //www.ncbi.nlm.nil. gov/sites/entrez)下载许氏平鲉EST序列(检索词为Sebastes schlegelii)。对序列进行拼接后利用SSR Hunter 1.3软件查找微卫星序列，查找条件为: 二碱基重复5次以上(含5次); 三碱基重复4次以上(含4次); 四碱基、五碱基和六碱基重复均在3次以上(含3次)。

用Primer Premier 5.0软件设计引物。引物长度控制在18—22bp; GC含量控制在40%—60%，正反引物相差不超过10%; Tm值控制在40—60°C，正反引物相差不超10°C; 产物长度控制在100—500bp。设计好的引物送生工生物(上海)有限公司合成。

实验在Eppendorf普通梯度PCR仪中进行。第一步用3个DNA样品混合进行初步筛选，选出能够稳定扩增目的条带的EST-SSR引物; 第二步对扩增效果不理想的引物进行梯度优化。实验用酶为TIANGEN Taq DNA Polymerase ET101-02-04，25μL反应体系如下: 2μL DNA 模板(50ng/μL)，2.5μL 10×buffer，引物各1μL(50μmol/L)，0.5μL dNTP(10mmol/L)，0.2μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，剩余体积以灭菌水补齐。PCR程序设为: 94°C预变性5min，接着进行30个循环: 94°C 变性45s，退火45s，72°C延伸1min，循环结束后72°C延伸10min。扩增产物进行8%(W/V)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染染色，并用扫描仪拍照。

筛选出的EST-SSR引物进行野生群体PCR扩增，反应体系和扩增程序同引物筛选部分，不同引物的退火温度参见表 1。扩增产物进行8%(W/V)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染染色、扫描仪拍照。

用多态性微卫星引物对朝鲜平鲉和褐菖鲉DNA样品进行PCR扩增，反应体系和扩增程序同引物筛选部分，不同引物的退火温度参见表 1。扩增产物进行8%(W/V)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染染色，扫描仪拍照。

统计各SSR位点DNA带型，估算条带分子量大小，统计结果输入POPGENE 32(Yeh et al 1999)计算每个位点的等位基因数(N_a)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)和香农多样性指数(I)。用软件CERVUS 3.0(Marshall et al，1998)计算多态信息含量(Polymorphic information content，PIC)。GENEPOP v.4.1.4(Rousset，2008)检验Hardy-Weinberg平衡和连锁不平衡情况。另外统计18对多态EST-SSR引物对朝鲜平鲉和褐菖鲉个体的通用率和多态率，分析各位点通用性情况。

从NCBI公共数据库下载的1980条EST序列经拼接、SSR位点查找后，发现181条EST序列含有SSR位点，共计224个，EST-SSR位点的发现率为9.14%，平均每条EST序列上有SSR位点1.24个。其中，含有一个EST-SSR位点的144条，两个EST-SSR位点的33条，三个及三个以上EST-SSR位点的4条。依据Weber(1990)提出的分类方法，所有EST-SSR位点中完美型比例占到91.52%，二到六碱基重复均有出现，位点个数分别为109、88、4、2和2，分别对应百分比53.17%、42.93%、1.95%、0.98%以及0.98%。其中，二碱基重复出现频率最高，分为10种重复类型，以TG/CA基序最多，占33.03%，占总完美型位点的17.56%; 三碱基重复有23类，以CAG/CTG出现频率最高，为12.50%，四到六碱基所有重复类型皆出现一次。

对查找到的224个EST-SSR位点进行进一步分析，挑选出部分适合设计引物的位点，共设计引物56对，筛选后共计46对引物能够进行有效扩增，野生群体多态性检测结果显示，其中18个位点具有多态性(表 1)，位点HJ4137的电泳图见图 1。

图 1 位点HJ4137的PCR扩增结果 Fig. 1 The result of PCR amplification of locus HJ4137

图选项

所有位点共检测出70个等位基因，每个位点观测等位基因数为2—9，平均观测等位基因数为3.89。观测杂合度(H_o)在0.0333—0.8000之间，平均观测杂合度为0.3037; 期望杂合度(H_e)在0.0333— 0.7927之间，平均期望杂合度为0.3757; 香农指数(I)在0.0848—1.7819之间，平均香农指数为0.7416; 每个位点的多态信息含量(PIC)在0.0323—0.7522之间，平均多态信息含量为0.3419，其中高度多态(PIC> 0.5)位点5个，中度多态(0.25<PIC<0.5)位点4个，中高度多态位点比例为50.00%。经Bonferroni校正后，仍有3个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.0028)，但两两位点间不存在连锁不平衡现象(表 2)。

在朝鲜平鲉中除位点HJ606和HJ4183其余位点均能有效扩增，其中6个位点多态; 在褐菖鲉中所有位点均能有效扩增，除位点HJ4215和HJ4286单态外其余位点均为多态。18个位点在朝鲜平鲉和褐菖鲉中的通用率分别是88.89%和100%，多态率为33.33%和88.89%。其中，位点HJ4215和HJ4286在许氏平鲉中显示多态而在朝鲜平鲉、褐菖鲉个体中为单态; 位点HJ4136、HJ4202以及HJ4959对许氏平鲉、褐菖鲉显示多态而在朝鲜平鲉中为单态; 位点HJ606和HJ4183对许氏平鲉、褐菖鲉显示多态而在朝鲜平鲉中不能有效扩增; 位点HJ126、HJ4203以及HJ4249对许氏平鲉、褐菖鲉显示多态，且对褐菖鲉多态性更高; 位点HJ4137、HJ4930、HJ4944以及HJ9578在三个物种中均具有较高多态性，且在许氏平鲉中多态性最高(表 3)。位点HJ4136在朝鲜平鲉、褐菖鲉和许氏平鲉中的多态性检测结果见图 2。

图 2 位点HJ4136在朝鲜平鲉和褐菖鲉以及许氏平鲉中的检测结果 Fig. 2 The results of transferability of locus HJ4136 in Sebastes koreanus，Sebastiscus marmoratus and Sebastes schlegelii a: 位点HJ4136在朝鲜平鲉中的通用性检测结果; b: 位点HJ4136在褐菖鲉中的通用性检测结果; c: 位点HJ4136在许氏平鲉中多态性检测结果

图选项

到目前为止，NCBI公共数据库中许氏平鲉EST序列共1980条，相比研究较早的水生生物来说数目较少。本研究中许氏平鲉EST-SSR位点发现率为9.14%，而海带为5.03%(王国良，2010)、坛紫菜为5.64%(杨惠等，2009)、泥蚶为6.50%(董迎辉等，2013)、中华鳖为7.45%(许晓军等，2013)、牙鲆为7.95%(陈松波等，2010)，这说明相较于其它水生生物，许氏平鲉EST-SSR位点发现率较高，具有较好的开发潜力。本研究查找到的许氏平鲉EST-SSR核心序列以二碱基重复出现频率最高，这一结果与有关马氏珠母贝(邱樱，2013)、牙鲆(陈松波等，2010)以及中华鳖(许晓军等，2013)的研究结果相同，而在其它学者的研究中也存在不同结果，比如在泥蚶、海带和坛紫菜中均以三碱基重复最丰富(杨惠等，2009; 王国良，2010; 周小龙等，2013)。

许氏平鲉EST-SSR核心序列以TG/CA基序最为常见，在205个完美型位点中占到17.56%，李霞等(2004)有关剑尾鱼的研究结果与之类似。18个多态EST-SSR位点中，有4个位点核心序列是TG或CA基序，重复次数范围在5—14之间，占完美型多态位点比例26.67%，因此在本研究中许氏平鮋EST-SSR位点TG/CA基序的开发效率较高; 上述4个多态位点分别是HJ126、HJ4136、HJ4959以及HJ4137，对应的核心序列重复次数和等位基因个数分别为5、5、12、14和2、4、7、9，由此可见随着核心序列重复次数增加位点多态性有逐渐增强的趋势。通常认为微卫星多态性的形成与复制过程中的滑链错配有关(张云武等，2001)，由此形成的插入或缺失突变会导致微卫星核心序列长度的变化(乔洪金等，2012)，而核心序列重复次数越高其出现插入或缺失突变的几率就越大。

许氏平鲉46对有效扩增的EST-SSR引物中，其中18对具有多态性，多态检测率为39.13%; An等(2009)开发的许氏平鲉Genomic-SSR位点14对有效扩增，其中13对多态，多态检测率高达92.86%; Yasuike等(2013)设计30对完美型Genomic-SSR引物，其中17对有效扩增并且显示多态，多态检测率为100.00%。EST序列中有效扩增的微卫星引物中，具有多态性的微卫星比例明显低于基因组中的微卫星比例。此外，Bai等(2011)开发的多态Genomic-SSR位点平均观测等位基因数、平均观测杂合度以及平均期望杂合度分别为5.7、0.4194和0.5002，均高于本研究开发的EST-SSR，同样的结果也存在于An等(2009)和Yasuike等(2013)开发的许氏平鲉Genomic-SSR标记中。上述结果均证实了以往学者有关EST-SSR位点多态性低于Genomic-SSR位点的结论(齐晓艳等，2013; 周小龙等，2013)。一般认为这是由于EST序列来源于基因编码区，更易受到选择压力的作用从而表现出较高的保守性，因此多态性要比基因组SSR低(Chabane et al，2005)。

微卫星侧翼序列在近缘物种中比较保守，根据已有物种的微卫星引物实现跨物种通用是开发微卫星引物的一种有效途径。分子标记可以被分为两类，Ⅰ型分子标记与已知功能的基因相关联，而Ⅱ型分子标记与基因组未知区域相关(O’Brien，1991)。EST序列来源于功能基因，由此开发的EST-SSR引物属于Ⅰ型微卫星引物，而Ⅰ型微卫星引物已被证实比未知基因背景的Ⅱ型引物通用性更强(Holton et al，2002)。Ma等(2010，2011)开发了拟穴青蟹Ⅱ型和Ⅰ型微卫星引物，并分别检验其在同属物种中的通用情况，结果显示紫螯青蟹(Scylla tranquebarica)对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)Ⅰ型微卫星引物的通用性更强。本研究中开发的18对多态EST-SSR引物对褐菖鲉的通用率和多态率分别达到100%和88.89%，显著优于An等(2009)开发的14对Genomic-SSR位点，后者的相关数据分别为78.57%、78.57%。

一般认为，对于微卫星引物，亲缘关系越近的物种实现扩种扩增的可能性越大，而在本研究中，与许氏平鲉亲缘关系较远的褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)却表现出了更好的通用性。此外，通过分析An等(2009)有关许氏平鲉14对微卫星引物在4个近缘种中的通用性实验结果得知，与许氏平鲉亲缘关系较近的Sebastes inermis通用情况(通用率10/14，多态率10/14)却没有Sebastes marmoratus(通用率11/14，多态率11/14)好。同样的结果都与褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)这个物种有关，具体原因有待进一步研究分析。另外，上述结果与赵丽丽(2008)在青石斑鱼和美洲黑石斑鱼的跨种扩增结果类似，后者认为这可能与跨种扩增研究中使用的样品数量有限、DNA复制时错配而产生假阳性带、副产物带过多、多态位点判断等原因有关。此外，通用性实验结果显示，位点HJ606和HJ4183在许氏平鲉和褐菖鲉中可以有效扩增而在朝鲜平鲉中不能有效扩增，这一结果得到进一步确认后可以应用于从上述三个物种中鉴定朝鲜平鲉的工作。

本研究结果显示，许氏平鲉EST-SSR位点检出率较高，具有较好的开发潜力，实验开发的多态EST-SSR位点可用于许氏平鲉群体遗传多样性分析、系统进化分析和近缘种通用性检测等研究，为今后许氏平鲉的良种选育工作奠定基础。