鱿鱼产量巨大，全世界有中国、挪威等超过60个国家和地区从事鱿鱼捕捞加工生产，而鱿鱼的消费和利用也以这些国家和地区为主(李桂芬，2003)。在鱿鱼加工过程中产生大量的下脚料(袁亚辉等，2002)。主要包括内脏，皮、头等废弃物，这些物质通常被利用加工成鱼粉或者作为废弃物掩埋，产品附加值低，不利于鱿鱼加工行业的发展，而且造成环境污染(王建中等，1999; 陈意，2006)。国外对鱿鱼加工下脚料的利用主要通过生物技术对其进行处理，加工成各种高营养蛋白食品，使其蛋白质资源充分利用(FAO，1998)。在国内鱿鱼肝脏的利用仅有鱿鱼肝脏干粉的加工，并且是用作饲料，技术水平不高(秦玉青等，2002; 赵红伟，2003)。鱿鱼肝脏中分离提取的各种生物活性肽(程云辉等，2001)，作为消化吸收效率更高的蛋白质水解产物，不仅可应用于食品和饲料行业，而且还可应用于疾病的防治，为维护人类的健康作出贡献(Morimura et al，2002)。

由于鱿鱼肝脏中蛋白质分解后的氨基酸组成有较大的差别，没有一个完整的模式可以探寻，导致氨基酸小肽的分离难度较大。为此，针对鱿鱼肝脏蛋白氨基酸的特点，建立一套适合鱿鱼肝脏中降血压活性肽的分离技术就显得尤为必要(陈吉球，1997; 吴建平等，1998; 赵海珍等，2004)。传统常用的分离技术主要包括膜分离技术，微滤技术，高效液相色谱技术等等(何海伦等，2004)。而在进行抑制肽的分离提取方面，一般采用几种方法相结合(文允镒，1996; 薛向阳等，2004)。从鱿鱼肝脏中可以提取出消化吸收率更高的蛋白质水解产物，提取的活性肽可以用作癌症等疾病的治疗，为人类的医药事业做出了巨大贡献(Erdös et al，1987; Li et al，2004)。本研究利用鱿鱼肝脏蛋白为原料，采用各种分离纯化技术提取出降血压活性肽等物质，为鱿鱼肝脏在保健食品和药品等方面的应用提供了理论依据(Linz et al，1995; Voors et al，1998)，研究成果将实现鱿鱼肝脏等废弃物得以综合利用，减少大气环境污染，具有重要的研究意义。

原料与试剂: 冷冻鱿鱼肝脏，由舟山兴业集团公司提供，放置于低温冰箱冷冻保存，保存温度为-18℃。ACE酶、特丁基对苯二酚(TBHQ)、底物Hip-His-Leu、丙酮、硼酸盐缓冲液(pH 8.3)、TFA溶液、甲醇、茚三酮、浓盐酸、胃蛋白酶、乙腈等。

实验设备: 高效液相色谱仪LC600(南京科捷分析仪器有限公司)、分析天平AL104、超滤器labscale、酶解罐、pH计、高温炉、冷冻离心机CF16RX、紫外检测仪、超级恒温水浴锅等。

在(36±1)℃，pH 2.0，加酶量为2%，底物浓度为2.5%的条件下，研究酶解时间对鱿鱼肝脏蛋白水解的效果，测定ACE活性肽的含量。

酶解底物浓度的确定: 在温度为36℃，pH 2.0，酶与底物的比为2%的条件下，研究酶解时间对鱿鱼肝脏蛋白水解的效果，测定ACE活性肽的含量。

酶制剂添加量的确定: 在温度为37℃，pH 2.0，底物浓度为2.5%的条件下，研究酶解时间对鱿鱼肝脏蛋白水解的效果，测定ACE活性肽的含量。

将鱿鱼肝脏和水分按照1︰3的比例要求进行混合，在混合过程中通入氮气，防止其被氧化变质，同时加入适量的抗氧化剂BHA，放入高压锅(121℃，0.5Mpa)中处理20min后，在5000 r/min的条件下离心15min，去掉最上层的鱼油后，用丙酮进行处理，真空干燥后获得鱿鱼肝脏蛋白，后添加2%的胃蛋白酶酶解20h，酶解的条件为底物浓度2%、酶解温度36℃及酶解pH 2.0。最后酶解终止，以90℃条件保持15min为佳，除去分子量高于20kDa以上的产物。收集水解产物后置于4℃冰箱中保藏。

参考Cheung和Cushman介绍的方法对抗压活性肽的抑制活性进行测定(Cushman et al，1971)。

ACE抑制率(%)=(对照品种马尿酸的峰面积-样品中马尿酸的峰面积)/对照品种马尿酸的峰面积×100%

取酶解液稀释处理后加入缓冲溶液，在水浴锅中加入处理20min，在280nm下测光密度值。以蒸馏水做对比，在上述波长下进行光密度的测定，将去掉空白后的光密度带入标准曲线算出蛋白质含量，水解度(DH%)的计算公式如下:

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式中: A为蛋白质含量(mg)，W为样品重量(g)，V₁为水解液的总体积(mL)，V₂为显色时所用稀释液体积(mL)。

采用超滤对酶解液中的分子进行处理，主要截留分子量为20kDa以上的分子，将收集到的超滤液保藏于4℃备用。然后采用Sephadex G-100对超滤液进行分离，提取抗压活性肽，并测定其活性。同样地，用上述凝胶柱对超滤冻干样品配成的溶液进行分离，蒸馏水洗脱，流速为26滴/min，在280nm波长下测定抗压肽的活性。最后将具有降血压活性肽的分子用DEAE阴离子交换柱分离。取适量超滤样品用蒸馏水洗脱，用0—1 mol/L NaCl溶液线性洗脱，流速26滴/min，并测定各降血压活性肽活性。最后取活性最高的活性肽用Sephadex LH-20继续分离，洗脱液为30%的甲醇溶液，流速16滴/min，并测定各降血压活性肽活性。

由图 1可知，在底物浓度为1.0%—2.5%的范围时，随着底物浓度的增加，蛋白酶水解度也逐渐增大，而当底物浓度在2.5%—10.0%的范围时，底物浓度的上升反而使得蛋白酶水解度降低，可能的原因是，底物的增多使得蛋白酶像被包裹起来一样，与底物接触就越发变得困难，从而降低了水解度。从图 1中还可以看出，底物浓度对ACE的抑制率并没有太大的影响，同时考虑水解度和对ACE的抑制率，将底物浓度确定为2.5%。

图 1 底物浓度对水解度和ACE抑制活性的影响 Fig. 1 Influence of substrate concentration density on hydrolysis degree and ACE inhibitory activity

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反应时间为2—22h时，随着酶解时间的增加，蛋白水解度也逐渐增大(图 2)，超过22h后，随着酶解时间的延长，蛋白水解度的增加趋势有所降低，增加得更慢了; 从图 3中还可以看出，酶解时间对ACE的抑制率没有显著性的影响，同时考虑水解度和ACE的抑制率，将酶解时间确定为22h。

图 2 酶解时间对水解度和ACE抑制活性的影响 Fig. 2 Influence of enzymolysis time on hydrolysis degree and ACE inhibitory activity

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图 3 酶与底物比对水解度和ACE抑制活性的影响 Fig. 3 Influence of ratio of enzyme and the substrate on hydrolysis degree and ACE inhibitory activity

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从图 3可知，当酶与底物比在0%—2%的范围时，水解度与酶和底物比的变化呈正相关，而酶和底物比在2%—5%时，水解度随着酶和底物比的升高增加的速度有所降低，这是因为酶浓度越高，其与蛋白质接触的可能性越高，底物就越容易转化成底物肽。由图 3也可看出，ACE抑制率受酶与底物比的影响不明显，综合考虑二者，将酶与底物比确定为2%。

采用Sephadex G-100初步分离鱿鱼肝脏蛋白酶解液，出现5个峰值，如图 4所示峰值组分一、组分二、组分三、组分四、组分五。对五个组分分别进行收集、真空浓缩、冷冻干燥，并测定每个组分的抑制活性。

图 4 酶解液在Sephadex G-100上的洗脱峰值 Fig. 4 Hydrolyzate in Sephadex G-100 on the elution diagram

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如表 1所示，组分一、组分二、组分三洗脱下来的蛋白具有降血压抑制活性，其IC₅₀分别为: 2.28、

1.92、5.02mg/mL。结果表明: 分子量较大的多肽，其ACE抑制活性较好。选取粗分物中活性最高的组分(组分二)，对ACE抑制活性相关参数进行分析。

对鱿鱼肝脏蛋白用Sephadex G-50洗脱后得到的粗分物组分二的理化稳定性进行考察。图 5、图 6分别为不同温度和不同pH对组分二的ACE抑制活性的影响。结果显示，组分二的溶液在温度0—100℃、pH值1—12之间对ACE的抑制活性基本没有变化，比较稳定。

图 5 温度对组分二抑制活性影响 Fig. 5 Temperature on the inhibitory activity of Component 2

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图 6 pH对组分二的抑制活性影响 Fig. 6 pH on the inhibitory activity of Component 2

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ACE抑制肽在被人体摄入以后要经过胃肠消化道才能被吸收，因此有必要研究模拟胃肠消化对组分二的ACE抑制活性的影响。在本实验中，选择组分二的样品浓度为1.80 mg/mL，模拟消化实验，检测各酶解反应后酶解液的ACE抑制活性，结果如表 2所示。

从表 2中可以看出，粗分物组分二的ACE抑制活性在经过胃蛋白酶消化2h后，ACE抑制活性有一些提高，但总体来说，模拟胃肠消化对ACE抑制活性的影响不大，粗分物组分二经过胃肠消化后仍具有较高的ACE抑制活性。

选择用适合生物大分子等物质分离的DEAE阴离子交换柱对组分二分离纯化，洗脱得到了两个峰值，分别标注为组分六和组分七，见图 7。其中第1个峰值处显示抑制ACE的活性较高，且回收率高，标记为组分六。继续收集组分六。通过Sephadex LH-25继续分离，洗脱得到2个峰，标记为组分八和组分九，其半抑制浓度(IC₅₀)分别为1.58mg/mL和2.12mg/mL，如图 8。检测这两部分的ACE抑制活性，结果表明ACE的抑制活性大致相同。

图 7 粗分物组分二在DEAE阴离子交换柱上的洗脱图 Fig. 7 The elution diagram of crude components of Component 2 on DEAE anion exchange column

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图 8 组分六在Sephadex LH-20上的洗脱图 Fig. 8 The elution diagram of Component 6 in Sephadex LH-20

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本文对鱿鱼加工下脚料进行综合利用研究，将提取鱼油后的鱿鱼肝脏蛋白用丙酮处理除脂，选择蛋白酶进行酶解，将酶解液进行超滤处理后，跟踪其ACE抑制活性，应用凝胶过滤层析等方法分离纯化ACE抑制肽。主要结论如下:(1)将鱿鱼肝脏蛋白的酶解液经过截留分子质量为20kDa的滤膜经过超滤处理后，用Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱初步分离，洗脱得到5个洗脱峰，其中粗分物组分二的ACE抑制活性较高，其IC₅₀为1.92 mg/mL。(2)对粗分物组分二的ACE抑制活性相关参数分析，结果表明: 组分二的溶液在温度0—100℃、pH 1—12之间对ACE的抑制活性基本没有变化，比较稳定。而且模拟胃肠消化实验对粗分物组分二的ACE抑制活性的影响不大，经过胃肠消化后仍具有较高的ACE抑制活性。(3)用DEAE阴离子交换柱和Sephadex LH-20对组分六继续分离纯化，分离得到为组分八和组分九，其半抑制浓度(IC₅₀)分别为1.58mg/mL和2.12mg/mL。