随着健康养殖业的发展，有益微生物的应用越来越广泛，如在水产养殖过程中，使用光合细菌、枯草芽孢杆菌等微生物制剂改善养殖环境，降低疾病的发生，取得了较好的效果(Vanittanakom et al，1986; Burgess et al，1993; Barsby et al，2001; Vaseeharan et al，2003; 顾继锐等，2011; 张庆华等，2011; 高存川等，2012; 潘娟等，2012; 张峰峰等，2012); 通过筛选生防细菌，利用生防细菌对水产病原菌的抑制作用，寻找替代抗生素的新途径，如从高度污染的海滩污泥中，分离得到一株枯草芽孢杆菌LHB02对三种弧菌包括哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)都有很强的抑制作用(徐长安等，2011); 从不同生长阶段的对虾肠道中分离对病原菌(鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌)有拮抗作用的细菌(李海兵等，2008)。另外专家学者也开展了利用益生菌、酶制剂促进水产养殖动物的健康和提高饲料利用率方面的研究(Tamehiro et al，2002; Liu et al，2010)，并取得了很好的试验效果，如芽孢杆菌、低聚木糖、复合酶制剂及它们的配伍物可以促进异育银鲫的生长，提高饲料利用率，促进肠道有益微生物的生长和抑制有害微生物，并且能提高肝胰脏蛋白酶mRNA表达量和肠道酶活性(刘文斌等，2007); 在饲料中添加粪肠球菌能够促进罗非鱼生长，提高饲料利用率，降低血清胆固醇和甘油三酯含量以及谷丙转氨酶活性，同时增加肠道乳酸菌数量，改善肠道微环境(周晓波等，2014); 纤维素酶可降低动物胃肠内容物的粘稠度，促进内源酶的扩散，提高养分的消化吸收(胡喜峰等，2004); 饲料中添加纤维素酶，草鱼增重率提高，饵料系数降低，干物质、粗蛋白、粗脂肪和粗纤维消化率都提高，体成分没有显著变化(高春生等，2006)。

目前，同时具有产酶和抗菌性能的功能菌株筛选报道较少，本实验室在前期的功能菌筛选中，筛选到一株既产纤维素酶又具有拮抗水产病原菌的芽孢杆菌，本研究报道了该功能菌的筛选、鉴定，及对功能菌产生的纤维素酶进行耐温、耐酸碱和对紫外线的稳定性进行考察，并开展功能菌对水产常见病原菌的拮抗效果分析，初步评估该功能菌株的价值，为以后开发该菌株提供依据。

用于筛菌的样品采自福建省宁德市养殖池底泥。

LB培养基: 蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，水1000 mL，pH 7.2—7.4。

SLB培养基: 蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，琼脂20g，水1000 mL，pH 7.2—7.4。

产纤维素酶培养基: 蛋白胨 9.0 g、酵母膏 10.0 g，羧甲基纤维素钠 5.0 g，水1000 mL。

CMC-Na平板: 羧甲基纤维素钠15.0 g、硫酸铵1.0 g、酵母膏1.0 g、硫酸镁1.0 g、磷酸二氢钾1.0 g、琼脂20.0 g、水1000 mL，pH为自然值。

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，爱德华氏菌(Edwardsiella)，哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

常规玻璃器皿、电子天平、超净工作台、打孔器、移液枪、台式摇床、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱，PCR仪，核酸电泳仪，凝胶成像仪，多功能酶标仪和手提式紫外反射仪等。

取10g污泥样品，加入100mL 0.85% NaCl中，搅拌后取上层浊液置于LB培养基，37°C，180 r/min，富集培养30h后，菌液置于75°C水浴20min。水浴后的菌液进行梯度稀释及平板涂布法进行分离。

分别挑取初筛得到的目标菌，标示为: FA01、FA02、FA03、FA04、FA05、FA06、FA07、FA08、FA09、FA10等以此类推，将这些目标菌置于LB培养基中，37°C，180 r/min，活化6 h，活化好的菌液按10%接种至产纤维素酶培养基，37°C，180 r/min，发酵48h 后，10000 r/min，离心6min，弃去沉淀，得上清液，为粗酶液; 采用CMC-Na平板，打孔后，孔内添加50μL所得的上清液，之后置于37°C过夜; 反应后的平板用刚果红染色1h，接着用0.85% NaCl脱色，观察是否出现水解圈，出现水解圈的即定为功能菌。每株菌做三个重复。

参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)进行功能菌生物学特征观察和生理生化试验，并结合16S rDNA序列分析方法进行鉴定。

将功能菌接种至SLB培养基的培养皿平板，放入温度设置为37°C的恒温箱中，培养24 h，观察菌落形态特征。

进行功能菌部分生理生化试验，包括D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇的产酸试验; 接触酶、苯丙氨酸脱氨酶试验、明胶、淀粉、酪氨酸水解试验; V-P测定、吲哚产生试验、利用柠檬酸盐试验。

参照文献(徐长安等，2011)，采用磁珠法基因组DNA抽提试剂盒提取功能菌全基因组。以全DNA为模板，使用细菌16S rDNA通用引物，27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R: 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR程序为: 94°C预变性4min; 94°C 45s，55°C 45s，72°C 1 min，30个循环; 72°C 10 min修复延伸; 4°C ∞终止反应。使用SanPreP柱式DNA胶回收试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物送至上海生工测序。将测得的16S rDNA序列输入www.ncbi.nlm.nih.gov Blast进行同源性搜索，选取其中与之同源性较高的菌株，用MEGA软件进行系统发育树分析，构建进化树。

接种功能菌株至LB培养基中，37°C，180 r/min，活化6h，活化好的菌液按10% 接种至产纤维素酶培养基，37°C，180 r/min，发酵24h后，10000 r/min，离心6min，弃去沉淀，得上清液，为粗酶液。参照文献(韩铭等，2012; 于岚等，2013)，采用3，5-二硝基水杨酸比色定糖法(DNS)进行酶活测定，分别考察功能菌株所产的纤维素酶对温度、pH值和紫外线的耐受能力。

粗酶液在不同pH缓冲液(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)混合均匀，置于37°C，处理1h，测定残存酶活，以最高酶活为100%。

粗酶液分别在温度为 30、40、50、60、70、80°C的水浴锅中处理1h后，测定残存酶活，以最高酶活为100%。

粗酶液分别在紫外线波长365nm，距离10cm下照射10、20、30、40、50、60 min后，测定残存酶活，以最高酶活为100%。

选择嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌，用接种环刮下菌体接种至装有5mL LB培养基的试管中，放入温度设置为37°C，转速为180 r/min的摇床中培养16h后，取1 mL的培养液至100 mL的45—50°C的SLB培养基中，迅速摇匀倒板，待凝固后用打孔器打孔。

功能菌FA08斜面接种至装有5mL LB培养基的试管中，放入温度设置为37°C，转速为180 r/min的摇床中活化6 h后，按10%的接种量至装有50 mL LB培养基的三角瓶中，放入温度设置为37°C，转速为180 r/min的摇床中发酵17 h，10000 r/min 离心6 min，得发酵上清。

经实验发现，标识为FA08的菌株，三个重复均出现水解圈，如图 1所示，而其它菌株未出现水解圈，因此 FA08为目标功能菌。

图 1 功能菌FA08水解圈 Fig. 1 The hydrolysis circle of strain FA08

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将功能菌FA08接种至SLB培养基的培养皿平板，37°C培养24h，发现菌落白色微黄，中间凸起，表面光滑，边缘不规则，革兰氏染色为阳性，产芽孢。

功能菌FA08的部分生理生化实验结果如表 1所示。

16S rDNA测序结果显示，菌株FA08的16S rDNA序列全长为1407bp。全序列见图 2。将测得的序列输入国际核酸数据库(http: //www.ncbi.nlm.nih. gov)，用Blast进行同源序列搜索，在搜索结果中，选出同源性较高的菌株系列(表 2)，用MEGA 软件进行系统发育分析，并构建系统进化树，结果如图 3所示，通过比较可以明显看出，FA08在遗传位置上与Bacillus licheniformis(X68416)和Bacillus licheniformis(NR118959)两株地衣芽孢杆菌最近，且与Bacillus licheniformis(X68416)同源性最高达99%。结合其形态学及生理、生化特征，鉴定功能菌 FA08为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，登录号为KM892857。

图 2 功能菌FA08 16S rDNA 测序结果 Fig. 2 The 16S rDNA sequence of strain FA08

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图 3 基于16S rDNA序列的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic dendrogram based on 16S rDNA sequence

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如图 4所示，FA08所产纤维素酶在pH 4下稳定性最好，且pH 3和pH 5—10下保持较好的稳定性，相对酶活保持在85%以上，因此该酶对酸碱的耐受能力较强。

图 4 pH值对FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响 Fig. 4 The effect of pH on the stability of cellulase produced by strain FA08

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如图 5所示，FA08所产纤维素酶在30—40°C保持较好的稳定性，50—70°C相对酶活保持在75%以上，80°C下相对酶活仍能保持在70%以上，因此该酶对温度具有较好的耐受能力。

图 5 温度对FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响 Fig. 5 The effect of temperature on the stability of cellulase produced by strain FA08

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从图 6可以看出在紫外线照射的条件下FA08所产生的纤维素酶保持稳定性，酶活均接近100%，因此该纤维素酶对紫外线具有很强的耐受性。

图 6 紫外线对FA08所产生的纤维素酶稳定性的影响 Fig. 6 The effect of UV on the stability of cellulase produced by strain FA08

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拮抗试验结果表明: 如表 3所示，功能菌 FA08 对水产养殖常见致病菌: 嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用，其中对嗜水气单胞菌抑制作用最强。

地衣芽孢杆菌作为生防细菌广泛应用于植物病害防治、饲料加工、医药开发、环境污染治理等方面(唐娟等，2008)。1989年，美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了地衣芽孢杆菌是安全的微生物物种，可以直接饲用; 我国农业部也把地衣芽孢杆菌列入饲料添加剂目录(马鑫等，2011)，允许在饲料中直接添加。另外，地衣芽孢杆菌在水产养殖方面也有很好的应用价值，如地衣芽孢杆菌作为鱼饲料添加剂，不仅可以促进鱼体生长，而且益于养殖水体的保护(葛文霞等，2014); 地衣芽孢杆菌和低聚木糖，可提高鱼体中消化酶的活性，有助于维持肠道内的微生态平衡，促进动物生长(刘波等，2006); 地衣芽孢杆菌增加了肠道消化酶活性，促进了鱼体生长(刘波等，2005)。另有研究表明，地衣芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱的特性，并能产生蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶等，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，消除抗营养因子(董尚智等，2009)。本实验所筛选的功能菌FA08鉴定为地衣芽孢杆菌，且可产生纤维素酶，预示着该菌具有较好的开发与应用前景。

通过考察地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶对酸碱稳定性的影响，发现FA08产生的纤维素酶对酸碱均能保持较好的稳定性，pH3和pH 5—10下相对酶活保持在85%以上，与杨丽娜等(2012)筛选到的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物所产的纤维素酶相比，在酸性条件下的耐受能力强，具有相似性，而在中性、碱性条件下地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶更具耐受能力。水产动物大多数无胃，消化道呈中性(鲤科鱼类)或偏碱性(王仁华等，2011)，因此地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶不仅适合于有胃的动物，而且也适合应用于水产动物。另外，地衣芽孢杆菌生长条件要求低，繁殖快，能迅速定植在肠黏膜上，在短时间内成为肠道的优势菌群(张菊等，2012)，并在肠道中发挥作用，有利于开发成为内服的微生物制剂。

实验发现，地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶对温度有较好的耐受能力，耐受80°C下相对酶活仍能保持在70%以上，与葛春辉(2009)筛选到的蜡质芽孢杆菌所产的纤维素酶相比，更具有耐温特性。在饲料原料中，杂粕类的原料粗纤维含量高，存在抗营养因子，大大限制了其在饲料中的使用量，目前发酵技术的应用，可提高杂粕类原料的使用价值，降解杂粕原料中水产动物难以消化的纤维素，消除抗营养因子，提高杂粕原料的利用率。一般饲料原料的发酵温度可达60—80°C，而地衣芽孢杆菌FA08产生的纤维素酶可较好耐受发酵温度，可应用于杂粕的发酵，提高杂粕的营养价值。

地衣芽孢杆菌对有害微生物具有拮抗作用: 如地衣芽孢杆菌Wl0能产生抗菌蛋白，对多种植物病原菌有较好的抑制效果(纪兆林等，2013); 又如地衣芽孢杆菌c-4具有较广的抑菌范围，对番茄枯萎病菌、玉米弯孢叶斑病菌、胶孢炭疽病菌、棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、小麦赤霉病菌和西瓜枯萎病菌等均有抑制作用(孙正祥等，2009)。然而地衣芽孢杆菌对水产养殖病原菌的拮抗特性报道较少。本实验也探讨了地衣芽孢杆菌FA08发酵上清对水产常见病原菌的拮抗效果，发现地衣芽孢杆菌FA08对水产病原菌: 嗜水气单胞菌、爱德华氏菌、哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌均有较强的拮抗作用。由于地衣芽孢杆菌具有在水产动物肠道定植的特性，这意味着地衣芽孢杆菌FA08进入水产动物肠道后，在肠道内可产生拮抗物质，对病原菌进行抑制或杀灭作用，促进水产动物肠道健康，有着重要的意义，另外，也可利用FA08的拮抗性能，制备微生物杀菌剂。

本研究开展了地衣芽孢杆菌FA08的筛选与鉴定，考察了该菌的酶学性质和抗菌特性，初步评估该菌的开发与应用价值，下一步将进行其作为养殖动物肠道定植菌、杂粕饲料发酵菌及制备微生物杀菌剂的研究与开发，实现FA08在水产养殖中的应用价值。