牙鲆(Paralichthys olivaceus)是不可或缺的海水鱼种之一，也是鲽亚目中有关免疫研究较为集中的鱼种。近些年，由于人们对水产鱼类的需求远远大于水产品捕捞业的产量，导致了人工养殖业尤其是集约化养殖的蓬勃发展。集约化养殖有占空间小，养殖密度大，充分利用资源等优势，可以不断产生的巨大的经济效益，但也使养殖业面临着疾病传播速度快，养殖鱼短时间大量死亡的问题(王卫卫等，2010)。在导致养殖业遭受重创的疾病中，以迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)引起的腹水病最为严重。牙鲆感染了E. tarda 后，出现的症状有鱼腹部凸起，肝脏、肾脏肿大，有的鱼甚至出现肝脏局部坏死和出血，体色逐渐变暗变黑(崔青曼等，2008)。养殖厂饲养的牙鲆中因腹水病死亡的数量占到1/2 以上(袁春营等，2006)，导致了牙鲆产量的下降，给牙鲆养殖业带来了巨大损失。现今治疗鱼病的方法主要是依靠传统的抗生素，而大量使用抗生素会导致过剩药物残留于鱼体内，随着食物网的物质和能量的传递，有害物质不易排出体外，在体内造成富集现象，危害人类健康;而长久使用抗生素会产生药物耐受性以及环境污染等问题，最终会对人类生活的土壤和水环境造成恶劣影响。通过研究牙鲆免疫相关基因的功能及其调控过程，为硬骨鱼的免疫与治疗提供理论的补充与相关实验验证，为解决养殖鱼类的病害问题提供新的解决可能性。

Toll 样受体(Toll-like receptors，TLRs)在免疫中起着辨别和传递信息的作用(王德成等，2008; 范泽军等，2015)。依据TLR 识别不同PAMP 及其结构特点，鱼类中的TLR 可归为6 个亚家族，TLR21 属于TLR11亚家族，TLR11 亚家族是哺乳类所没有的，目前尚不清楚其对特定病原的识别机制，需要进一步研究。TLR11 亚家族包括TLR20、TLR21、TLR22、TLR23。TLR21 基因被发现存在于鸡、两栖动物、鱼类中，不存在于哺乳动物类中，鸡TLR21 是一种核苷酸受体，能对DNA 进行识别和响应(Keestra et al，2010)。目前，在海七鳃鳗、斜带石斑鱼、斑马鱼、牙鲆、草鱼和条石鲷等硬骨鱼类中有针对TLR21 基因的相应研究(Kasamatsu et al，2010; Li et al，2012; Yeh et al，2013;Gao et al，2013; Wang et al，2013; 路飏，2013;Priyathilaka et al，2014)。本课题组前期克隆了牙鲆TLR21 的全长cDNA，相关研究结果表明，在人工培育的头肾细胞中MyD88 抑制剂可以抑制由CpG ODN 或poly I: C 诱发的TLR21 基因的表达上调(Gao et al，2013)。TLR21 基因广泛表达在健康牙鲆体内，尤其头肾和鳃中，本文通过观察E. tarda 感染牙鲆后，观察不同时间点TLR21 在牙鲆体内mRNA 水平的定量表达特征和变化情况，对牙鲆疾病的治疗预防等方面提供数据参考。

健康牙鲆，体重范围为90—110 g，体长10.5—12 cm，购于天津市鑫永丰水产养殖场。在有供氧和过滤装置的水循环鱼缸内养殖牙鲆进行试验，在充氧一周的自来水与盐卤按比例配制而成的水环境中养殖7 d [盐度为17—18，水温为(20±2)°C]，以消除环境胁迫对牙鲆的影响(吴恋等，2013)，避免强光直射，鱼缸上方要遮光，模拟牙鲆底栖的生存条件。每日投放人工配合饲料一次。

E. tarda 由天津水产养殖病害防治中心提供。

对本课题组前期实验成果TLR21 全长序列运用Primer Premier 5.0 软件设计出实时定量荧光PCR 引物，进行相对定量表达分析。以牙鲆 β-actin 基因作为内参基因。各引物序列详见表 1。

表 1 牙鲆TLR21 基因和β-actin 基因实时定量表达引物及序列 Tab. 1 Sequences of the primers of TLR21 and β-actin used for qPCR analysis

表选项

将E. tarda 在无菌环境中接种于pH 为7 的Luriai-Bertani 培养基中，恒温培养，6000g 离心2 min收集菌体，用无菌PBS 缓冲液(NaCl₈g，KCl₀.2g，Na₂HPO₄·12H₂O₃.58g，KH₂PO₄ 0.24g)洗涤一遍，再次离心后重置于无菌PBS 缓冲液中，调整浓度为107 CFU/mL 浓度。

将48 尾鱼分成两组，第一组24 尾鱼，注射E.tarda，注射剂量为100 μL，1×10⁷ CFU/mL。相应的，另一组24 尾鱼，每尾注射PBS 100 μL。在感染后0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、6 d，随机取各组鱼3尾解剖，将各组织储存于冻存管中。除血组织外其余组织均立刻投入液氮中，放置于-80°C 冰箱中保存。血组织置于冰中，待后续操作。以上步骤都在无菌条件中操作。

取出在液氮中保存的除血以外的其它各组织，进行如下操作: 将50 —100 mg 组织立即放入玻璃匀浆器中，加1 mL Trizol，研磨彻底，4°C、12000 r/min，离心10 min。取上部液体，加200 μL氯仿，离心15 min。取上部液体，加异丙醇颠倒混合，放置于冰中，静置10 min。4°C、12000 r/min 离心10 min。弃上清，加1 mL75%乙醇洗涤。4°C、7500 r/min 离心5 min，只保留沉淀倒置空干5 min，加入20 μL 无RNA 的无酶水溶解。取血组织200 μL，4°C，9000 r/min 离心5 min。弃上清，将沉淀转入匀浆器中，加1 mL Trizol，置于冰中彻底研磨。其后操作步骤同上述操作。对提取的RNA 进行电泳检测。将提取的RNA 保存于-80°C 超低温冰箱中备用。

使用Sangon Biotech^®公司的M-MuLV 第一链cDNA 合成试剂盒，以R and om Primer p(dN)6 为反转录引物，合成cDNA 第一链。步骤如下: RNA 2 μg，随机六合引物(0.2μg/μL)1μL，RNase free ddH₂O 定容至12 μL，轻轻混匀后离心3—5 s，反应混合物在65°C温浴5 min 后，冰浴30 s，然后离心3—5 s。试管冰浴，加入如下组分: 5×Reaction Buffer 4 μL，RNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL，dNTP Mix(10 mmol/l)2 μL，M-MuLV RT(200 U/μL)1 μL。混匀后离心3—5 s。25°C 保温10 min; 42°C 保温60 min; 70°C 保温10 min后迅速放到冰上冷却。扩增体系总体积为20 μL。

以反转组织的cDNA 为模板，通过ABI 7500 荧光PCR 仪收集组织的TLR21 基因表达水平的数据，按照Promega^®公司的GoTaq^®qPCR Master Mix 推荐的方法配制qPCR 反应体系: 反应体系为24 μL，GoTaq^®qPCR Master Mix 2×10 μL，Nuclease-Free Water 9.2 μL，上游引物(10 umol/L)0.4 μL，下游引物(10 umol/L)，4 μL 稀释后的cDNA 模版。qRT-PCR 的步骤按照Promega^®公司GoTaq^®qPCR Master Mix 推荐的二步法进行操作，退火温度为55°C。同一反应重复三遍，并判断qPCR 反应特异性。相对定量分析采用2–ΔΔCT 的方法。用Origin 8 软件作图。

TLR21 广泛表达在健康牙鲆体内，尤其是在脾和鳃中。刺激E. tarda 后，最早出现TLR21 表达高峰是在头肾组织中(1 h，13.5 倍，P<0.05)，TLR21 表达量最高是在脾组织中(6 h，59.3 倍，P<0.05)，其次是在肠组织中(6 h，15.1 倍，P<0.05)。刺激6 h 后，TLR21 的表达水平达到各组织的高峰，高峰过后TLR21 表达量回落到0 h 参照量之下。在刺激后3 d、6 d 各组织中TLR21 的表达量趋于稳定，与对照组表达量相持平。在刺激E. tarda 后各组织中随着时间的变化TLR21 表达量各有变化(具体趋势见图 1—图 8)。

图 1 TLR21 在受E. tarda 刺激后在心脏中的表达量变化 Fig. 1 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in heart after infection by E. tarda

图选项

图 2 TLR21 在受E. tarda 刺激后在肝脏中的表达量变化 Fig. 2 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in liver after infection by E. tarda

图选项

图 3 TLR21 在受E. tarda 刺激后在脾脏中的表达量变化 Fig. 3 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in spleen after infection by E. tarda

图选项

图 4 TLR21 在受E. tarda 刺激后在头肾中的表达量变化 Fig. 4 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in head kidney after infection by E. tarda

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图 5 TLR21 在受E. tarda 刺激后在小肠中的表达量变化 Fig. 5 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in intestine after infection by E. tarda

图选项

图 6 TLR21 在受E. tarda 刺激后在肌肉中的表达量变化 Fig. 6 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in muscle after infection by E. tarda

图选项

图 7 TLR21 在受E. tarda 刺激后在鳃中的表达量变化 Fig. 7 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in gill after infection by E. tarda

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图 8 TLR21 在受E. tarda 刺激后在血中的表达量变化 Fig. 8 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in blood after infection by E. tarda

图选项

E. tarda 刺激后TLR21 在牙鲆各组织中的表达量变化结果见图 9。TLR21 基因在受E. tarda 刺激后，在牙鲆心脏中12 h 达到最高值，其它组织在6 h 时至最高峰，脾脏、小肠、心脏、头肾在注射E. tarda 后TLR21 表达变化趋势明显(图 9)。

图 9 受E. tarda 刺激后TLR21 在牙鲆各组织中的表达量变化 Fig. 9 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in various tissue after infection by E. tarda in different time duration

图选项

图 9 中0 h 组织的表达量只是作为参照量1，便于表明随着时间推移各组织中TLR21 表达量的倍比关系。针对0 h 时间点TLR21 的表达量对比见图 10。在0 h，TLR21 较高的表达在鳃、脾中，在头肾中最少。TLR21 广泛的分布在牙鲆体内。3 讨论目前，已经克隆出和鉴定出了很多与牙鲆免疫相关的基因，测定了这些基因在牙鲆不同组织中的表达情况，并对健康牙鲆进行病原感染的刺激试验，研究这些免疫相关基因的表达变化模式并了解其在牙鲆先天免疫中的作用。TLR21 是重要的免疫相关基因，在牙鲆体内是否响应E. tarda 的病原刺激及表达变化情况，目前没有相关研究报告。本研究就牙鲆体内各组织是否都进行TLR21 的表达及腹腔注射E.tarda 后各组织TLR21 表达量变化等问题进行试验，目的是为了获取刺激E. tarda 后TLR21 基因的表达变化模式。

图 10 TLR21 在牙鲆健康组织中的相对表达量 Fig. 10 The relative expression of P. olivaceus TLR21 in various tissue

图选项

TLR21 广泛存在于鱼体内，如河豚(Oshiumi et al，2003)、鲶鱼(Baoprasertkul et al，2007)和石斑鱼(Li et al，2012)组织中，当鲶鱼通过腹腔注射感染E. tarda后，TLR21 的转录水平在感染后6 h 有明显增长(Baoprasertkul et al，2007)，在本试验中也呈现出刺激病原体后6 h 达到表达高峰的趋势。鲶鱼中检测出TLR21 主要分布在脾、小肠、胃、肝、中肾、卵巢、脑和鳃中(Baoprasertkul et al，2007)，较少表达在头肾和皮肤中，TLR21 不存在于肌肉中。石斑鱼TLR21 较高的表达在中肾、头肾、脾、心脏、鳃、肝和胸腺中，较少表达在皮肤和后脑，TLR21 不存在于肌肉中(Li et al，2012)。斑马鱼TLR21 较高表达在脾、鳃、头肾，较少表达在肝、内脏和皮肤(Sundaram et al，2012)。这些结果都表明TLR21 广泛的分布于硬骨鱼多种健康的组织中，TLR21 表达量较高的组织集中在脾、鳃。TLR21 基因在不同部位中表达量不同，也许是鱼种差异造成的结果。

头肾在刺激E. Tarda 1 h 后，其表达量比其它组织中的表达量较早达到了第一个小高峰，可以看出头肾在刺激E. tarda 后，免疫响应较迅捷。头肾在解剖形态上显示为深红色，紧贴脊椎，富含淋巴细胞和吞噬细胞等与免疫相关的细胞，是免疫细胞的发源地(李敏等，2012)，在免疫反应方面具有特殊作用，在致病性病原体入侵后，头肾参与机体免疫过程，尤其是参与早期免疫过程。

鱼类生存在富含多种微生物(包括致病微生物)的水中，鱼类黏膜系统作为鱼类与外界水环境直接接触的界限，是第一道屏障(王俊相，2010)。本试验通过腹腔注射E. tarda 的方式对机体进行刺激，肠道直接浸浴在病菌环境中，刺激后6 h 肠内TLR21 基因的表达量为对照组的15.1 倍，在被试组织中仅次于脾组织。有研究表明，包含肠黏膜在内的鱼类黏膜系统可能相对于包含传统免疫器官如头肾、脾等的系统免疫系统在免疫过程中具有一定的独立性(唐海蓉，2006)。也有研究表明，鱼类血清中的免疫物质与黏膜系统中的免疫物质不同，而血清中的免疫物质是由系统免疫系统产生而转运到血清中的，因此从另一个角度证明了黏膜系统在免疫过程中具有一定的自主性(巩华，2006)。本实验中TLR21 基因在肠中的表达量较高，也许就是因为肠粘膜在免疫中有一定的自主性，且较早的直接接触接触病原微生物，与小肠直接参与抗病原体感染有关系。

在刺激E. Tarda 6 h 后，TLR21 表达量达到高峰后迅速降低，推测是一种免疫系统的自我保护与自我调整。TLR21 激活的免疫应答反应可以很强烈，对于病原体入侵导致的机体发炎感染等情况有很强的打击作用，如果这种强烈的免疫反应保持的时间过长，则有可能对机体带来负面影响造成负担，如产生内毒素休克(王海坤等，2006)。因此在过强的免疫反应发生后，机体进行自我保护与自我调整，会降低TLR21 在组织中的表达量。

作为一种低等的脊椎动物，鱼类有更丰富的TLRs，这些TLRs 被证实可以识别同样的PAMP，如河豚鱼TLR3、TLR22 能辨别双链核糖核酸(Matsuo et al，2008)，虹鳟鱼TLR5和TLR5s 能辨别细菌的鞭毛蛋白(Tsujita et al，2004)，在青蛙和硬骨鱼中能检测到TLR21，也能检测到TLR9(Oshiumi et al，2003;Meijer et al，2004; Ishii et al，2009)。鸡TLR21 基因功能与哺乳类TLR9 基因相似，可作为CpG ODN 的识别受体(Keestra et al，2010)，牙鲆TLR21 的功能是否也是如此，有待于今后进一步证实。