有孔虫(Foraminifera)门隶属于原生动物界，目前已知化石种约36000种，现生种约4000—6000种，大部分为海洋底栖种类(Sen Gupta，1999)。有孔虫因其壳体可长期保存在海洋水体及沉积物中，因此在古海洋学等学科研究中有重要价值(汪品先等，1980，1988)。另外在环境指示(Eichler et al，2012)、生态评估(Boucheta et al，2012)以及海洋生态系统的能量流动与物质循环中，都扮演着重要角色。

现生有孔虫有钙质玻璃壳、钙质瓷质壳、砂质壳(胶结壳)和无壳(蛋白质膜)等多种类型。其中玻璃质类底栖有孔虫Ammonia(Brünnich，1772)是中国近海重要的优势类群，常以优势种出现，在中国各海域均见报道(汪品先等，1980; 成鑫荣，1987; 李保华等，2008; 赵泉鸿等，2009; 李小艳等，2010; 类彦立等，2015)。这类有孔虫常被用来指示滨岸和低盐等海洋环境，具有重要的生态价值(郝诒纯等，1980; 汪品先等，1980)。

Ammonia是最早被确定为有孔虫的一个属，其种类之多、形态变异之大使得这类有孔虫的分类鉴定尤为困难和混乱(Holzmann et al，2000; Hayward et al，2004)，同样的困难也存在于其他类群的有孔虫。而分子技术的应用为解决这一难题提供了新的思路(Pawlowski et al，2010，2014，2013)。有孔虫分子生物学研究已经有较长的历史(Langer et al，1993)，对于Ammonia属的分子鉴定多基于对编码核糖体RNA基因的序列分析，这方面的工作在国外已经有很多报道(Pawlowski et al，1994b，1995; Hayward et al，2004)，而国内的开展尚未普及(徐美香等，2004; 李保华等，2005，2007): 技术应用的不成熟、相关数据库信息量太少等都是其限制因素。

众所周知，有孔虫很难在实验室培养并且繁殖，而且野外采样也受到时间和空间的限制。因此，如何有效保存有孔虫的DNA以用于后续研究，是有孔虫分子生物学研究能够广泛开展的前提。海洋生物常用的保存方式有冷冻、乙醇固定及福尔马林固定等。但有研究指出后两种化学固定方法并不适用于有孔虫(Holzmann et al，1996)。

本工作通过参考前人研究结果(徐美香等，2004; 李保华等，2005，2007; Pawlowski et al，1994b，1995;)，最终选出3种保存方法，即烘干法、冷冻法和裂解液法，进行了更为系统的有孔虫DNA保存方法的实验研究。另外，由于不同壳质类型的有孔虫所适用的DNA提取方法不尽相同(Pawlowski，2000)。本实验还比较了DOC裂解液法和Guanidine裂解液法对Ammonia属DNA提取效能的不同，以期筛选出最适合玻璃质壳类底栖有孔虫的DNA保存和提取方法，提供适合野外采集及实验室等不同环境下的最优方案。进而为分子生物学在这类有孔虫研究中的应用提供技术支持。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 活体有孔虫材料准备

实验所用的有孔虫材料是2014年2月份采自青岛湾潮间带的底栖优势类群，卷转虫属Ammonia spp. 经形态鉴定，主要为Ammonia aomoriensis(Asano，1951)与Ammonia beccarii(Linnaeus，1758)的混合种。把沉积物样品置于14°C左右的培养箱中孵化2天，挑选爬到沉积物表面、壳体完整、大小均一、房室呈棕黄色、体表黏附有颗粒物的Ammonia spp.，这样的有孔虫活性较好(Holzmann et al，1996; Schweizer et al，2005)。放到盛有过滤海水的培养皿中，投喂硅藻，在实验室培养1周。将有孔虫小心转移到灭菌过滤海水中，在体视显微镜下，用毛笔仔细清洗壳体表面的杂质，准备进行DNA提取和保存实验。

1.1.2 试剂准备

DOC裂解液(0.1mol/LTris-HCl pH8.5，4mmol/L EDTA pH8.0，1%DOC，0.2%TX-100); Guanidine裂解液(4mol/L Guanidinium isothiocyanate，0.05mol/L Tris-HCl pH7.6，0.01mol/L EDTA，0.068mol/L Sarkosyl=N-Lauroylsarcosine sodium salt，1%β-巯基乙醇)(Pawlowski，2000); 异丙醇; 70%乙醇; 1×TE Buffer; 琼脂糖; TAE电泳缓冲液; 2×PCR Mix(TIANGEN Golden Easy PCR System); ddH₂O; PCR引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.1.3 仪器准备

PCR仪; 凝胶成像分析系统; 电泳仪; 干燥箱; 高速冷冻离心机; -20°C、-80°C冰箱; 恒温水浴锅。

1.2 DNA提取方法

采用DOC裂解液和Guanidine裂解液两种处理方法提取Ammonia DNA，DOC裂解液法设置2个平行组，Guanidine裂解液法设置3个平行组，每个平行组均为单个样本。实验操作如下:

1.2.1 DOC裂解液法

取一只清洗过的Ammonia实验样品放置在含50μL DOC裂解液的1.5mL无菌离心管中，研磨使壳破碎。于60°C水浴孵化1h。10000 r/min离心5min，去除不溶物。所得即为基因组DNA，于-20°C保存(Holzmann et al，1996; Pawlowski，2000)。

1.2.2 Guanidine裂解液法

取一只清洗过的Ammonia实验样品放置在含50μL Guanidine裂解液的1.5mL无菌离心管中，研磨使壳破碎。60°C加热15min，或室温过夜。8000 r/min离心1min，取上清液。加入与第一步中Guanidine裂解液等量的异丙醇，混匀。在-20°C沉淀至少2h，或过夜。最大转速离心15min，移去上清液，注意不要扰动沉淀。用100μL 70%乙醇洗涤沉淀物，最大转速离心1min，移去上清液。将沉淀物真空干燥5—10min，或者室温下干燥更长时间。用15—20μL 1×TE Buffer溶解沉淀物，在4°C放置至少1h，或过夜，期间取出涡旋数次。所得即为基因组DNA，于-20°C保存(Pawlowski，2000)。

1.3 DNA保存方法

对实验样品分别进行烘干、冷冻和裂解液保存等3种方法处理。鉴于预实验以及Holzmann等(1996)的实验结果，加之实验样品数量限制，为了最大限度进行实验研究，进行如下实验设计: 烘干法共11个处理组，未设平行组; 冷冻法共4个处理组，每个处理设2个平行组; 裂解液法共6个处理组，每个处理设2个平行组。采用1.2.1中介绍的DOC法提取DNA。具体操作如下:

1.3.1 烘干保存法

取清洗好的Ammonia实验样品放置在1.5mL无菌离心管中，每管一只。分别在温度为20、30、40、50、60、70、80、90、100、110和120°C烘干30min，每个温度组烘干11只。每个温度组各取一只，立即提取DNA。其余的在室温下保存，之后每周取每个温度组的一个样本提取DNA，连续进行10周实验。每次实验均取一只活的Ammonia提取DNA作为阳性对照，另用无菌水做空白对照。

1.3.2 冷冻保存法

取清洗好的Ammonia实验样品放置在1.5mL无菌离心管中，每管一只。设以下4个冷冻组: 在无水和50μL无菌过滤海水中分别在-20°C和-80°C下冷冻。之后每周对每个冷冻组提取DNA，连续进行8周实验，提取前需要解冻并排出海水。设置阳性和空白对照。

1.3.3 裂解液保存法

为比较裂解液中是否含有EDTA对于Ammonia DNA保存效果的差异，进行如下实验。取清洗好的Ammonia实验样品放置在1.5mL无菌离心管中，每管一只。设以下6个实验组: 分别在2种裂解液(含4mmol/L EDTA的DOC以及不含EDTA的DOC)、3种温度(室温、4°C、-20°C)下对样品进行保存实验。之后每周对每个实验组提取DNA，连续进行8周实验。设置阳性和空白对照。

1.4 DNA检测方法

基于核糖体RNA(rRNA)基因大亚基(large subunit，LSU)片段的序列分析在Ammonia属种类鉴定等方面的研究中已经有很好的应用(Pawlowski et al，1994a，1995; Holzmann et al，1996，2000; Schweizer et al，2011)。

本实验运用PCR技术，对所有实验组提取的DNA，扩增其LSU rRNA基因片段(大约750bp)，取4μL扩增产物，经1.0%琼脂糖凝胶(TAE缓冲液，110V)电泳20min、EB染色10min，然后用凝胶成像分析系统拍照。通过分析电泳条带质量判断所提取的DNA质量。DNA提取方法组的比较，是直接观察电泳图条带的质量并结合后期测序结果; DNA保存方法组的比较，是在获得电泳图之后，用ImageJ软件对电泳图中目的条带的亮度进行定量分析，用“灰度值”表示定量分析的结果，PCR条带的亮度或者灰度值可用于间接反映DNA保存的质量(宋锋等，2010)。

PCR引物: 正向2TA(5CACATCAGCTCGAGT GAG3)，反向L1F(5ACTCTCTCTTTCACTCC3)。反应体系: 25μL(2×PCR Mix 12.5μL，10μmol/L的正反向引物各0.5μL，DNA模板2μL，ddH₂O₉.5μL)。反应条件: 95°C预变性60s; 94°C变性30s、52°C退火30s、72°C延伸90s，共34个循环; 72°C延伸3min。

1.5 数据统计分析

对电泳条带的亮度量化后，用SPSS19.0软件包中有关的方差分析做数据统计分析，采用LSD检验。比较Ammonia DNA的保存效果在不同处理方法、不同保存时间组之间的差异。

2 结果与结论 2.1 DNA提取方法比较

由图 1可以看出，经DOC 裂解液法和Guanidine裂解液法提取到的DNA，在PCR扩增之后都能得到整齐、单一、明亮的、与目标条带大小一致的条带，且后续测序结果证实是目标条带。证明这两种方法所提取的Ammonia属有孔虫DNA的浓度和纯度都能满足后续PCR的需求。但是DOC裂解液法比Guanidine法操作更简单，试剂更便宜，所以前者更适合Ammonia属有孔虫DNA的提取。

2.2 DNA保存方法比较 2.2.1 烘干保存法

经ImageJ软件分析各组的PCR条带所得灰度值见表 1。用SPSS19.0做单因素方差分析，采用LSD检验。结果显示20°C组和30°C显著高于40°C组(P<0.05)，从均值图看20°C组结果最好，但未与30°C组产生显著差异(图 2)。综合考虑实验的简便性和保存结果的优异性，建议20°C为最佳烘干温度。另外，比较第0、1、2周的结果发现，三组间没有显著差异(P>0.05)，表明烘干后立即提取DNA和保存一段时间之后提取的结果无显著差异。

到第10周灰度值有显著下降(P<0.05)，说明保存时间超过10周样品DNA可能会有显著降解。

2.2.2 冷冻保存法

各组的PCR条带灰度值见表 2(以均值表示)。用SPSS19.0作3因素单变量方差分析，不同时间组采用LSD检验。结果显示-80°C组均值高于-20°C组，但未达到统计上的显著水平(P>0.05)。无水组结果显著好于有水组(P<0.05)。不同保存时间之间没有显著差异，直到第8周，各组依然有较好的结果(图 3)。因此，采用-20°C或-80°C无水条件对Ammonia属有孔虫进行冷冻处理，至少8周以内其DNA都有较好的保存效果。

2.2.3 裂解液保存法

各组的PCR条带灰度值见表 2(以均值表示)。统计分析方法与“冷冻保存组”相同。均值比较结果显示4°C组效果比室温和-20°C组好，含EDTA组比不含EDTA组效果好，但都没有达到统计上的显著水平(P>0.05)。不同保存时间之间没有显著差异，直到第8周，各处理组依然有较好的结果(图 4)。因此，若采用DOC裂解液保存Ammonia属有孔虫的DNA，建议选择4°C含EDTA的裂解液，至少8周以内对DNA都有较好的保存效果。

2.2.4 三种方法总体比较

分别选取烘干法、冷冻法和裂解液法中保存效果最好的组，比较它们之间的差异。烘干法选取20°C，1—8周组; 冷冻法选取-80°C无水，1—8周组; 裂解液法选取4°C含EDTA，1—8周组。结果显示组间有显著差异: 冷冻法优于烘干法，烘干法优于裂解液法(P<0.05)。因此，最适合钙质玻璃壳底栖有孔虫的DNA保存方法为-80°C无水条件下冷冻; 若-80°C冷冻条件不可得，可用-20°C冷冻代替，但对样品的有效保存时间可能不如-80°C条件下长。

3 讨论

玻璃质类底栖有孔虫是我国近海最常见的优势有孔虫类群之一，在潮间带该类群可占整体有孔虫群落的30%—70%，其群落结构有重要的生态指示意义(Murry，1991; 李保华等，2008; 李小艳等，2010)。对有孔虫准确的分类鉴定是研究其群落结构的前提; 尤其是对Ammonia属为代表的玻璃质有孔虫，形态

鉴定较为混乱(类彦立等，2015)，分子鉴定手段的应用对弥补传统形态学分类的不足具有重要作用(Pawlowski et al，1994b，1995)。然而国内在现生有孔虫分子生物学方面的研究还几乎处于空白期。工作的一大难点在于分子技术的应用，例如DNA提取方面，由于经常有微生物与有孔虫共生等原因导致很难获得纯的有孔虫DNA(Holzmann et al，1996; Pawlowski，2000)。加之作为单细胞原生动物，有孔虫DNA拷贝量比起其他多细胞动物要小得多，使用单个样本提取出满足PCR要求的基因组DNA困难较大; 而对多样本提取DNA时很难保证所有样本是同一个种，尤其对于像Ammonia这样的形态鉴定疑难类群。研究中常常需要在对样品提取DNA的同时，借助SEM等技术进行形态鉴定。因此，干燥之后的样品还能稳定提取DNA，并且满足后续PCR扩增，对于有孔虫分子生物学研究非常重要。另外，某些有孔虫类群的rRNA基因有高度的细胞内变异，给DNA测序工作带来了一定的困难(Pawlowski，2000)。

对有孔虫DNA进行有效保存是进行后续分子鉴定的前提。Holzmann等(1996)对Ammonia的DNA保存方法进行了一些研究，但除了30°C干燥保存外，其余方法所探索的保存时间都不超过5周。国内未见有专门研究有孔虫DNA保存方法的报道。本研究进行了更多的保存方法以及更长的保存周期(8至10周)的实验探索，各种方法各有优缺点，以期满足不同保存时间以及不同条件下(如野外或实验室等)的需求。

有孔虫基因结构的一些独特之处，例如SSU rRNA和LSU rRNA基因序列不仅拥有不同寻常的长度，而且存在很大的种内变异(Pawlowski，2000)，使得一些种类的核糖体基因很难成功扩增。另外个体大小、虫体活性、有壳等因素都限制了有孔虫DNA提取的成功率。因此，即使是对新鲜样品直接提取DNA，也不一定能够成功进行PCR扩增。这也可能是导致相同实验条件下结果相差很大的原因(例如图 3中4、5号条带以及图 4中2、3号条带)。

由于本实验中使用了2TA-L1F和2TA-L7两对引物进行巢式PCR扩增(Schweizer et al，2011)，DOC裂解液法提取DNA后PCR结果出现双带(如图 1a中1、2号条带所示)。有研究显示Ammonia属LSU rRNA基因的扩增可能不需要巢式PCR(Holzmann et al，1996)。本研究通过对扩增出的双带进行测序，表明它们分别是引物2TA-L1F及2TA-L7扩增的产物，从而证实Ammonia属LSU rRNA基因的扩增不需要巢式PCR。

有报道指出EDTA对有孔虫的壳有破坏作用(Seears et al，2014)。在本实验过程中，每次提DNA之前均对样品镜检，发现用含EDTA裂解液保存的Ammonia样品的壳溶解程度比不含EDTA组的更严重; 在室温和4°C保存的Ammonia样品的壳溶解程度比-20°C组的更严重。推测随着壳的逐渐溶解，原本由壳保护着的核物质可能会受到某种影响。为了探索这种影响对Ammonia DNA保存效果造成的差异，本实验分别检验了含与不含EDTA的裂解液对于Ammonia DNA的保存效果，前者效果普遍比后者好。

综上所述，本研究以玻璃质壳类底栖有孔虫的代表类群Ammonia spp.为材料，比较了3种DNA保存方法(烘干、冷冻、DOC裂解液)以及2种DNA提取方法(DOC 裂解液法、Guanidine裂解液法)。实验结果表明:(1)烘干保存法中20°C为最佳烘干温度，保存时间超过10周样品DNA可能会有显著降解; 冷冻保存法中-20°C和-80°C冷冻保存直至第8周样品DNA依然较完好; DOC裂解液保存法中样品用含EDTA的裂解液在4°C保存效果较好，至少可以保存8周。(2)从对有孔虫DNA保存效果来看，-80°C无水条件下冷冻效果最佳; 烘干保存法使得有孔虫形态鉴定与分子鉴定可以更好地结合; 裂解液法保存则可以很方便地直接进行后续DNA提取实验，较适合短期保存。3种保存方法各有优缺点，可根据不同实验需求进行选择。(3)DOC裂解液法和Guanidine裂解液法对玻璃质类有孔虫DNA提取效果都很好，但前者更经济且操作简便。

4 结论

玻璃质壳类底栖有孔虫DNA保存和提取优化方案如下:

DNA保存:

保存法1——烘干法:

A. 设备器皿准备:

干燥箱、1.5mL无菌离心管。

B. 操作步骤:

(1) 取单只实验样品，于无菌过滤海水中洗净;

(2) 虫体置于1.5mL无菌离心管中，于20—30°C干燥30min;

(3) 在提取DNA之前于室温、密封保存。

保存法2——冷冻法:

A. 设备器皿准备:

-20°C冰箱、-80°C超低温冰箱、1.5mL无菌离心管。

B. 操作步骤:

(1) 取单只实验样品，于无菌过滤海水中洗净;

(2) 虫体置于1.5mL无菌离心管中，密封;

(3) 在提取DNA之前于-20°C或-80°C冷冻保存。

保存法3——裂解液法:

A. 设备和试剂准备:

(1) 设备器皿: 4°C冷藏箱、1.5mL无菌离心管;

(2) 试剂: DOC裂解液(Pawlowski，2000)。

组分:

TRIS 1mol/L pH 8.5 100μL

EDTA 0.5mol/L(pH 8.0)8μL

DOC(Na deoxycholate)10% 100μL

TX-100 10% 20μL

H₂O₇80μL

B. 操作步骤:

(1) 取单只实验样品，于无菌过滤海水中洗净;

(2) 虫体置于1.5mL无菌离心管中，加入含4mmol/L EDTA的DOC裂解液;

(3) 在提取DNA之前于4°C保存。

DNA提取:

A. 设备和试剂准备:

(1) 设备器皿: 水浴锅、高速离心机、1.5mL无菌离心管;

(2) 试剂: DOC裂解液，组分同“保存法3”。

B. 操作步骤:

(1) 取单只实验样品，于无菌过滤海水中洗净;

(2) 虫体置于1.5mL无菌离心管中，加入50μL DOC裂解液;

(3) 将虫体彻底研磨碎，于60°C水浴孵化1h;

(4) 10000r/min离心5min，去除不溶物;

(5) 上清液中即为提取的基因组DNA，于-20°C保存。