COⅠ条形码辅助分析雷州半岛红树林区鱼类的物种多样性

http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20160100013
中国海洋湖沼学会主办。

文章信息

张顺, 廖健, 柏琴, 陈冲, 郭昱嵩, 刘楚吾, 王中铎. 2016.

ZHANG Shun, LIAO Jian, BAI Qin, CHEN Chong, GUO Yu-Song, LIU Chu-Wu, WANG Zhong-Duo. 2016.

COⅠ BarcodE-ASSISTED Species Diversity STUDY ON Mangrove FISH IN Leizhou Peninsula

海洋与湖沼, 47(3): 663-672

Oceanologia et Limnologia Sinica, 47(3): 663-672.

http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20160100013

文章历史

收稿日期：2016-01-19

改回日期：2016-03-08

引用本文

张顺, 廖健, 柏琴, 陈冲, 郭昱嵩, 刘楚吾, 王中铎. 2016. COⅠ条形码辅助分析雷州半岛红树林区鱼类的物种多样性[J]. 海洋与湖沼, 47(3): 663-672 复制到剪切板

ZHANG Shun, LIAO Jian, BAI Qin, CHEN Chong, GUO Yu-Song, LIU Chu-Wu, WANG Zhong-Duo. 2016. COⅠ BarcodE-ASSISTED Species Diversity STUDY ON Mangrove FISH IN Leizhou Peninsula[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 47(3): 663-672. 复制到剪切板

COⅠ条形码辅助分析雷州半岛红树林区鱼类的物种多样性

张顺, 廖健, 柏琴, 陈冲, 郭昱嵩, 刘楚吾, 王中铎

广东海洋大学南海水产经济动物增养殖广东普通高校重点实验室湛江 524025

收稿日期:2016-01-19; 改回日期:2016-03-08

资助课题: 国家自然科学基金项目，31201996号；广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目，Yq2013089号。

作者简介: 张顺,硕士研究生,E-mail:zhangs0916@foxmail.com

通讯作者: 王中铎,硕士生导师,副教授,E-mail:aduofa@gmail.com

摘要：于2014年3月至2015年7月从我国雷州半岛红树林区采集成鱼和幼鱼样本共1720尾，在依据FishBase等鱼类形态分类系统进行鉴定的基础上，利用COⅠ条形码技术确认存在94个物种，分属11目33科72属。结果表明：红树林区鱼类种群极其丰富，其中鲈形目（Perciformes）鱼类物种最多，为59种，占总物种数的62.77%，其次是鲱形目（Clupeiformes）和鲻形目（Mugiliformes），分别占6.38%和5.32%。鲈形目中又以虾虎鱼科（Gobiidae）为优势类群，含29种（占30.85%）。按生态类群分：海洋洄游鱼类最多，占物种总数的32.98%，其次为海洋偶见鱼类、两侧洄游鱼类，分别占22.34%、17.02%，以虾虎鱼类物种为主的红树林定居鱼类约占11%。本研究表明红树林生态系统是许多海水、淡水和洄游性鱼类在特定生活阶段的重要栖息地和育幼场所。另外，COⅠ条形码技术可有效快捷地鉴定出红树林海域的鱼类。

关键词：红树林 COⅠ基因 DNA条形码鱼类鉴定物种多样性

COⅠ BarcodE-ASSISTED Species Diversity STUDY ON Mangrove FISH IN Leizhou Peninsula

ZHANG Shun, LIAO Jian, BAI Qin, CHEN Chong, GUO Yu-Song, LIU Chu-Wu, WANG Zhong-Duo

Fisheries College, Guangdong Ocean University Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes, Zhanjiang 524025, China

Abstract: We randomly collected 1720 young and adult fish from March 2014 to July 2015 in mangrove waters of Leizhou Peninsula during a fish survey to enrich local fish species database and the ecological and environmental status, and to test the applicability of combining the COⅠ barcode technology with FishBase and other fish morphological classification schemes. In total, 94 species were identified, belonging to 72 genera, 33 families, and 11 orders. The results show that fish species in the mangrove waters was abundant, of which Order Perciformes were the most abundant fish (59 species or 62.77% of the total species), followed by Clupeiformes (6 species, 6.38%), Mugiliformes (5 species, 5.32%), and Characiformes (2 species, 2.13%). Of the Perciformes, gobies were dominant species (29 species, 30.85%). In addition, marine migratory fish were the highest species taking 32.98%, followed by marine stragglers 22.34%, amphidromous 17.02%, and few estuarine species. In addition, 11% of major gobies inhabit the mangrove estuarine. Therefore, mangrove waters are an important habitat and nursery field for many marine, fresh, and migratory fishes. On the other hand, COⅠ barcoding has been proved practical in studying the fish biodiversity.

Key words: mangrove COⅠ gene DNA barcode fishes identification species diversity

红树林生态系统(Mangrove ecosystem)是近海三大生态系统之一，多分布于海陆交界的河口区，受潮汐影响明显，生态环境变化多样，不仅物种多样性极其丰富(Field et al，1998)，还具有净化温室气体、抵抗水污染等重要的功能(Li et al，2014)，国内外已有广泛的研究(张乔民等，2001; Castellanos-Galindo et al，2013)。红树林因其独特的根部结构以及丰富的藻类等食物资源而成为鱼类理想的栖息地(Blaber，2007; Gajdzik et al，2014)和育幼场(Kimirei et al，2013)。Nickerson(1999)研究表明，美国、印度等地区60%以上的鱼类在其一生的发育过程中与红树林密切相关。我国雷州半岛拥有红树林及其附近滩涂面积约20279hm²，是国家级红树林重点保护区之一。近些年来，人口不断增加，环境的恶化以及加上人为的过度开发，致使原本生态环境比较脆弱的红树林生态系统逐渐被破坏，近海渔业资源日渐枯竭。据“我国近海海洋综合调查与评价”显示，近半个世纪以来，我国红树林湿地丧失近73%，由55万hm²减至15万hm²(谢庆裕，2012)。通过相关学者对我国广东(Han et al，2003)、广西(黄德练等，2013)、台湾(Kuo et al，1999)等地红树林的调查结果表明，自红树林划入自然保护区后，我国红树林湿地的物种多样性有所提升，但相比鼎盛时期依然存在较大差距，需要进一步研究和保护。

近年来，世界鱼类数据库FishBase(http://fishbase.org/)已被广泛应用于鱼类形态学鉴定，由于鱼类栖息环境变化大，性状特征变异快，及各区域研究水平不一，单一的形态学分类法作为基本的分类法存在诸多的局限性。随之，DNA条形码(DNA barcodes)作为一个标准化和世界通用的物种识别系统被Hebert等(2003)提出，即通过使用短的、标准化的基因片段来进行物种鉴定，成为了传统形态学分类的辅助工具(Hajibabaei et al，2007)。Ward等(2005)用COⅠ基因(Cytochrome c oxidase subunitⅠ)中的655bp片段对澳大利亚207种海洋鱼类进行分析，发现所有物种都能被有效地区分，通过重建系统发生关系，认为COⅠ作为海洋鱼类的DNA条形码标准序列是可行的。王中铎等(2009)用COⅠ基因对南海硬骨鱼类40个物种89个样本进行了分析，结果表明COⅠ序列广泛适用于硬骨鱼类的物种鉴别，并可用于低级分类阶元的系统进化分析。DNA条形码技术应用于物种多样性的评价也有广泛的研究(Swartz et al，2008; Triantafyllidis et al，2011)。本文将形态学分类法与DNA条形码相结合应用于红树林鱼类物种的分类鉴定，分析鱼类生态类群组成的特点，以探讨红树林生态系统作为鱼类栖息地和育幼场的功能，同时进一步完善该区域鱼类的DNA条形码数据库。

1 材料与方法 1.1 实验材料与形态学鉴定

2014年3月至2015 年7月于雷州半岛红树林海域(廉江高桥(109°47′E，21°36′N)、雷州流沙湾(109°56′E，20°26′N)、霞山东海岛(110°20′E，20°6′N)、遂溪九龙山(110°17′E，20°39′N))共采集成鱼和幼鱼样本1720尾，每月采用围网、地笼、拖网以及200目的手抄网进行随机采集。依据Fish Base数据库等鱼类形态分类系统(伍汉霖等，2008)初步确认存在94个物种，最终参考《拉汉世界鱼类系统名典》(伍汉霖等，2012)和综合分类学信息系统(Integrated Taxonomic Information System，ITIS)对物种的有效名以及分类地位进行确定。取背部肌肉组织提取DNA，剩余样品用95%的乙醇固定，-40°C保存备用。

1.2 DNA的提取、PCR扩增及测序

取约0.2g鱼的肌肉经Protease K消化后，参考《分子克隆实验指南》的酚/氯仿抽提法(布鲁克等，2008)，提取DNA。COⅠ基因序列扩增引物(Ward et al，2005): Fish F: 5′-TCAACC AACCACAAAGACAA TGGCAC-3′; Fish R: 5′-TAG ACTTCTGGGTGGCC AAAGAATCA-3′。PCR反应总体积为25μL，包括2.5μL 10×Buffer，2.0μL dNTP(2.5 mmol/L)，上下游引物各1μL(5μmol/L)，0.2μL Taq DNA聚合酶(5U/μL)，0.5—2.0μL模板DNA，超纯水补齐。PCR反应的循环参数为: 94°C预变性3min; 94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸50s，共30个循环; 最后72°C延伸5min，最后，4°C下保存。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.3 物种鉴定与序列分析

利用BioEdit软件对获得的碱基序列检测后，导入NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库和BOLD(The Barcode of Life Data System)系统进行序列相似度比对，并结合鱼类形态学资料进行辅助鉴定，确保其准确性。通过MEGA6.0软件分析COⅠ基因序列特征及序列间的遗传距离。利用DNAsp5软件(Rozas et al，1999)计算种间平均核苷酸差异数(K)及单倍型分析。选用Kimura 2-parameter(K2P)计算遗传距离，邻接法(Neighbor-Joining method，NJ)构建系统进化树，经1000次重复抽样(Bootstraps)检测分子系统树分枝的置信度。

1.4 鱼类生态类群的组成分析

依据Elliott等(2007)建立的鱼类生态类群分类方法，并结合描述鱼类生活史特征的其它相关资料，将红树林鱼类分为海洋偶见鱼类(marine stragglers，MS)、海洋洄游鱼类(marine migrants，MM)、红树林定居鱼类(estuarine species，ES)、溯河洄游鱼类(anadromous，AN)、降海洄游鱼类(catadromous，CA)、淡水洄游鱼类(freshwater migrants，FM)、淡水偶见鱼类(freshwater stragglers，FS)、两侧洄游鱼类(amphidromous，AM)八类。采用SPSS 17.0软件进行数据统计和分析。

2 结果与分析 2.1 COⅠ序列特征及序列间遗传距离分析

利用COⅠ条形码辅助形态分类法进行物种鉴定，获得115条有效长度约为560bp的碱基序列，未存在插入和缺失。由表 1可得知，A+T碱基含量(54.1%)高于G+C含量(45.9%)，表现出A+T碱基组成偏向性; 第1密码子位点的G+C含量(55.1%)高于第2和第3密码子位点(42.8%和39.6%)，密码子组成也表现出一定的偏倚性。从总体来看，含有295个多态位点，约占52.7%，简约信息位点数为265个(约占47.3%)，转换/颠换之比为1.56，说明序列突变已达到饱和; 种间平均核苷酸差异数为49，约占总核苷酸数的29.17%。

表 1 94种鱼类的COⅠ基因序列碱基组成及变异情况 Tab. 1 Base composition and variation of all COⅠgene sequences of 94 fish species

密码子位点	A	T	G	C	转换/颠换比率R=S_i / S_v
1^st位点	27.2%	18.0%	29.6%	25.5%	2.79
2^nd位点	14.9%	42.0%	12.8%	30.0%	0.77
3^rd位点	30.7%	30.0%	9.9%	29.7%	1.11
全部位点	24.3%	29.8%	17.5%	28.4%	1.56

表选项

由各分类阶元K2P遗传距离(表 2)可知，种内不同个体的遗传距离平均为0.0032，而同属不同物种间的遗传距离为0.0562，约为种内遗传距离的17倍，符合Hebert等(2003)提出的“10×规则”。种间遗传距离在同科不同属间平均为0.1432，而同目不同科间为0.2115，可见，K2P遗传距离值在科以上的高级阶元的增加明显变缓。此外，虾虎鱼科与笛鲷科、鲻科和鲱科两两间平均遗传距离变化范围在0.2331—0.2534，科间的遗传距离变异较小。

表 2 各分类阶元遗传距离(K2P)统计表 Tab. 2 Genetic divergence(in K2P)within various taxonomic levels

比较范围	最大值	最小值	平均值
种内个体间	0.0060	0.0000	0.0032±0.0014
属内种间	0.0997	0.0012	0.0562±0.0073
科内属间	0.1741	0.0582	0.1432±0.0121
目内科间	0.2743	0.1168	0.2115±0.0167
虾虎鱼科-鲷科	0.2485	0.1969	0.2331±0.0166
虾虎鱼科-鲻科	0.2581	0.1840	0.2343±0.0170
虾虎鱼科-鲱科	0.2835	0.2114	0.2509±0.0167
鲷科-鲻科	0.2655	0.2309	0.2361±0.0198
鲷科-鲱科	0.2943	0.2075	0.2509±0.0187
鲻科-鲱科	0.2919	0.1231	0.2534±0.0172

表选项

2.2 物种的鉴定及有效种名的确定

经传统形态学鉴定，94个物种分属于11目33科72属，其最终的物种有效名、分类地位及生态类群见表 3。研究发现，存在多种鱼类形态变异较小，传统形态学难以鉴别，最后通过形态学鉴定到属而未能确定其物种名的有12个物种(以“”或“^**”表示)。

表 3 94种鱼类的物种名录、生态类群及相应DNA条码序列号 Tab. 3 The list of 94 fish species，ecological groups and the corresponding DNA GenBank accession numbers

分类地位	物种	生态类群	GenBank序列号
鲈形目鲷科棘鲷属Perciformes Sparidae Acanthopagrus	黑棘鲷Acanthopagrus schlegelii	MS	KT951727，KT951729
	黄鳍棘鲷Acanthopagrus latus^△	MM	KT951738
	灰鳍棘鲷 Acanthopagrus berda	MM	KT951737
鲷属Sparus	鲷属Sparus sp.^**	MM	KT951733
二长棘鲷属Parargyrops	二长棘鲷Parargyrops edita	FS	KT951789
平鲷属Rhabdosargus	平鲷Rhabdosargus sarba	MM	KT951734
笛鲷科Lutjanidae 笛鲷属Lutjanus	笛鲷属Lutjanus sp.	MS	KT951796
须鲷科Mullidae 拟绯鲤属Pseudupeneus	西非拟绯鲤Pseudupeneus prayensis^▽	MS	KT951788
慈鲷科Cichlidae 罗非鱼属Oreochromis	莫桑比克罗非鱼Oreochromis mossambicus	AM	KT951783
	尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus	AM	KT951784
狼鲈科Moronidae 花鲈属Lateolabrax	中国花鲈Lateolabrax maculatus	MM	KT951728，KT951730
石鲈科Haemulidae 胡椒鲷属Diagramma	密点少棘胡椒鲷Diagramma pictum	MS	KT951790
钻嘴鱼科Gerreidae 银鲈属Gerres	长棘银鲈Gerres filamentosus	AM	KT951731
	缘边银鲈Gerres limbatus	AM	KT951791
鲾科Leiognathidae 项鲾属Nuchequula	颈斑项鲾Nuchequula nuchalis	MM	KT951724-KT951726
沙鮻科Sillaginidae 沙鮻属Sillago	沙鮻属Sillago sp.^**	MS	KT951735
	亚洲鱚Sillago asiatica	MS	KT951736
鯻科Terapontidae 鯻属Terapon	细鳞鯻Terapon jarbua^△	MS	KT951739
鲹科Carangidae 鲳鲹属Trachinotus	卵形鲳鲹Trachinotus ovatus^△	MS	KT951782
细鲹属Selaroides	金带细鲹 Selaroides leptolepis	MM	KT951792
若鲹属Carangoides	马拉巴若鲹Carangoides malabaricus	MM	KT951793
蓝子鱼科Siganidae 蓝子鱼属Siganus	星斑蓝子鱼Siganus guttatus	MS	KT951794
	银色蓝子鱼Siganus argenteus	MS	KT951795
金钱鱼科Gerreidae 金钱鱼属Gerres	金钱鱼Scatophagus argus	MM	KT951732
双边鱼科Chandidae 双边鱼属Ambassis	玛丽双边鱼Ambassis marianus^▽	FM	KT951780，KT951781
隆头鱼科Labridae 海猪鱼属Halichoeres	云斑海猪鱼Halichoeres nigrescens	MS	EU871683
鱼衔科Callionymidae 鱼衔属Callionymus	箭鱼衔Callionymus sagitta	MS	KT951740
塘鳢科Eleotridae 脊塘鳢属Butis	脊塘鳢Butis butis^△	AM	KT951754
塘鳢属Eleotris	塘鳢属Eleotris sp.	FM	KT951755，KT951756
乌塘鳢属Bostrychus	中华乌塘鱧Bostrychus sinensis	FM	KT951786
虾虎鱼科大弹涂鱼属 Gobiidae Boleophthalmus	大弹涂鱼Boleophthalmus pectinirostris	ES	KT951741，KT951742
弹涂鱼属Periophthalmus	弹涂鱼Periophthalmus modestus^§	ES	KT951743
	大鳍弹涂鱼Periophthalmus magnuspinnatus	ES	KT951744
青弹涂鱼属Scartelaos	青弹涂鱼Scartelaos histophorus	ES	KT951745- KT951746
背眼虾虎鱼属Oxuderces	犬齿背眼虾虎鱼Oxuderces dentatus	MM	KT951747
蜂巢虾虎鱼属Favonigobius	裸项蜂巢虾虎鱼Favonigobius gymnauchen	AM	KT951748，KT951749
	雷氏蜂巢虾虎Favonigobius reichei^▽	MM	KT951761
韁虾虎鱼属Amoya	普氏韁虾虎鱼Amoya pflaumii	ES	KT951752
	舟山韁虾虎鱼Amoya chusanensis^△☆	MM	KT951753
	绿斑韁虾虎鱼Amoya chlorostigmatoides^△☆	ES	KT951774，KT951775
叉舌虾虎鱼属Glossogobius	金黄舌虾虎鱼Glossogobius aureus^△	FM	KT951787
	斑纹舌虾虎鱼Glossogobius olivaceus	AM	KT951757
	钝吻叉舌虾虎鱼Glossogobius circumspectus	FM	KT951763- KT951765
拟虾虎鱼属Pseudogobius	爪哇拟虾虎鱼Pseudogobius javanicus	AM	KT951766
	小口拟虾虎鱼Pseudogobius masago	ES	KT951767
瓢鳍虾虎鱼属Sicyopterus	瓢鳍虾虎鱼属Sicyopterus sp.	AM	KT951770
	兔头瓢鳍虾虎鱼Sicyopterus lagocephalus^▽	AM	KT951771
瓢眼虾虎鱼属Sicyopus	环带瓢眼虾虎鱼Sicyopus zosterophorum^▽	FS	KT951772
鲻虾虎鱼属Muqilogobius	阿部氏鲻虾虎鱼Mugilogobius abei	MM	KT951776
	诸氏鲻虾虎鱼Mugilogobius chulae^△	AM	KT951777
衔虾虎鱼属Istigobius	凯氏衔虾虎鱼Istigobius campbelli	MM	KT951778
缟虾虎鱼属Tridentiger	髭缟虾虎鱼Tridentiger barbatus	MM	KT951779
杯虾虎鱼属Cotylopus	杯虾虎鱼属Cotylopus sp.	FS	KT951785
复虾虎鱼属Acanthogobius	斑尾刺虾虎Acanthogobius ommaturus^△☆	MM	KT951750，KT951751
枝牙虾虎鱼属Stiphodon	枝牙虾虎鱼属Stiphodon sp.	AM	KT951773
孔鰕虎属Trypauchen	孔虾虎鱼Trypauchen vagina	ES	KT951768
吻虾虎鱼属Rhinogobius	子陵吻虾虎鱼Rhinogobius giurinus	FM	KT951769
鹦虾虎鱼属Exyrias	纵带鹦虾虎鱼Exyrias puntang	MS	KT951758- KT951760
鳍虾虎鱼属Gobiopterus	湖棲鳍虾虎Gobiopterus lacustris^△	FM	KT951762
鲤形目鲤科梅氏鳊属 Characiformes Cyprinidae Metzia	大鱗梅茨魚Metzia mesembrinum^△	FS	KT951797
脂鲤科颊齿脂鲤 Hemiodontidae Apareiodon	颊齿脂鲤属Apareiodon sp.^**	FS	KT951798
鲻形目鲻科鮻属 Mugiliformes Mugilidae Chelon	金點龟鮻Chelon parsia	MM	KT951799
	前鳞龟鮻Chelon affinis^☆	MM	KT951800
	灰鳍鮻Chelon melinoptera^☆	MM	KT951801，KT951802
	鮻属Liza sp. JDD-2011e	MM	KT951803
	绿背龟鮻Chelon subviridis^☆	MM	KT951804- KT951806
鹤鱵目鱵科下鱵属 Beloniformes Hemiramphidae Hyporhamphus	缘下鱵鱼Hyporhamphus limbatus	FM	KT951807，KT951808
异鳞鱵属 Zenarchopterus	异鳞鱵属Zenarchopterus sp.^**	FS	KT951809，KT951810
圆颌针鱼科圆颌针鱼属 Belonidae Strongylura	尾斑圆尾鶴鱵Strongylura strongylura	MS	KT951811
飞鱼科细身飞鱼属 Exocoetidae Hirundichthys	黑翼文鳐鱼Hirundichthys rondeletii	MM	KT951812
海鲢目海鲢科海鲢属 Elopiformes Elopidae Elops	夏威夷海鲢Elops hawaiensis	AM	KT951813，KT951814
	大眼海鲢Elops machnata	MM	KT951815
大海鲢科大海鲢属 Megalopidae Megalops	大海鲢Megalops cyprinoides	MM	KT951816
鲀形目四齿魨科多纪鲀属 Tetraodontiformes Tetraodontidae Takifugu	暗纹多纪鲀Takifugu porphyreus^△	AN	KT951818，KT951819
	黑点东方鲀Takifugu niphobles	MM	KT951817
	横纹多纪鲀Takifugu oblongus	MS	KT951820
拟单角鲀属 Pseudomonacanthus	庇隆氏拟单角鲀Pseudomonacanthus peroni^▽	ES	KT951821
鲱形目鯷科鯷属Clupeiformes Engraulidae Engraulis	日本鯷Engraulis japonicus^△	MM	KT951822
小公鱼属Stolephorus	小公鱼属Stolephorus sp.	MM	KT951824
鲱属Escualosa	叶鲱Escualosa thoracata	MM	KT951823
小沙丁鱼属Sardinella	黑尾小沙丁鱼Sardinella melanura	MM	KT951825
海鰶属Nematalosa	圆吻海鰶Nematalosa nasus	MM	KT951826
鰶属Konosirus	斑鰶Konosirus punctatus	ES	KT951832
鲉形目鲉科真裸皮鲉属 Scorpaeniformes Scorpaenidae Tetraroge	髭真裸皮鲉Tetraroge barbata^▽	MS	KT951827
多指鮋属Synanceia	毒鮋Synanceia sp.	MS	KT951828
菖鲉属Sebastiscus	褐菖鲉Sebastiscus marmoratus	MM	KT951829
瞳鯒属Inegocia	日本瞳鯒Inegocia japonica	MS	KT951830
鯒属Platycephalus	印度鲬Platycephalus indicus	MS	KT951831
鲶形目海鲇科海鲇属 Siluri1formes Ariidae Netuma	大头多齿海鲶Netuma thalassina^△	AM	KT951833
鳗鲡目糯鳗科尖尾鳗属 Anguilliformes Congridae Uroconger	尖尾鳗Uroconger lepturus	MS	KT951834
鳗鲡科鳗鲡属 Anguillidae Anguilla	日本鳗鲡Anguilla japonica	CA	KT951835
鲽形目鳎科鳎属 Pleuronectiformes Soleidae Solea	卵鳎 Solea ovata	MS	KT951836
箬鳎属Brachirus	东方宽箬鳎Brachirus orientalis	AM	KT951837
须鳎属Paraplagusia	长钩须鳎Paraplagusia bilineata	AM	KT951838
1)△表示形态学鉴定结果与NCBI相似度比对结果(Ident≥98%)相对应; ▽表示形态学鉴定结果与BOLD相似度比对结果(Ident≥98%)相对应; ☆NCBI或BOLD系统相似度比对出的物种命名与《拉汉世界鱼类名典》的命名存在分歧; §表示NCBI和BOLD相似度比对结果和FishBase存在差异; 表示通过形态学和分子鉴定到属的物种; *表示通过形态学鉴定到属，分子鉴定到科的物种; 2)MS表示海洋偶见鱼类，MM为海洋洄游鱼类，ES表示红树林定居鱼类，AN表示溯河洄游鱼类，CA表示降海洄游鱼类，FM表示淡水洄游鱼类，FS表示淡水偶见鱼类

表选项

由于形态学分类法存在一定的局限性，再将所获取的COⅠ基因序列导入到NCBI的GenBank数据库和BOLD系统进行序列相似度比对，其中59种鱼类形态学鉴定结果与两者比对结果相对应(Ident≥98%)。存在13种鱼类形态学鉴定结果仅与NCBI数据库相似度最高的比对结果相对应，而与BOLD系统未能高度匹配(“△”标注)，6种鱼类形态学鉴定结果仅与BOLD系统相似度最高的比对结果相对应(“▽”标注)。研究发现，数据库中与形态鉴定为弹涂鱼(P. modestus)一致性最高的序列为尾斑舌塘鳢(Parioglossus dotui)(Ident≥99%)，但后者形态特征与分布情况同该鱼种差距甚大，因此将该样本确定为弹涂鱼(“§”标注)。另外，12个物种通过形态学可鉴定到种，分子鉴定到科的有8种(以“*”表示)，分子鉴定到属的为4种(以“**”表示)，说明数据库里的物种DNA条形码不够完善，亟需补充。此外，通过综合比较物种的有效命名和分类地位，发现6个物种存在分歧，本文最终以《拉汉世界鱼类名典》和综合分类学信息系统的信息为准(“☆”标注)。

2.3 鱼类群落组成

本次于雷州半岛红树林保护区共采集到鱼类94种，其中鲈形目鱼类有59种，占总物种数的62.77%，其次是鲱形目和鲻形目分别为6种(占6.38%)和5种(占5.32%)，而鲤形目的鱼类采集到2种(占2.13%)，鲈形目中种类最多的科是虾虎鱼科，29种(占30.85%)，其次是鲷科有6种(占6.38%)。可能是由于虾虎鱼类绝大多数体型细小，更适宜于红树林湿地生态环境，成为了代表性物种。

从生态类群组成来看(图 1)，红树林海域物种数占优势的是海洋洄游鱼类，共有31种，占物种总数的32.98%，其次是海洋偶见鱼类21种(占22.34%)和两侧洄游鱼类16种(占17.02%)，而红树林定居鱼类10种，占物种总数的10.64%，其次是淡水偶见鱼类6种和淡水洄游鱼类8种，而采集到的降海洄游鱼类有1种，为日本鳗鲡(A. japonica)，溯河洄游鱼类为1种，为暗纹多纪鲀(T. porphyreus)。研究发现，四个采集点的各生态类群组成具有相似的特征，以海洋洄游鱼类为优势种群，以海洋偶见鱼类、红树林定居鱼类、两侧洄游鱼类居多。流沙湾和东海岛的海洋偶见鱼类物种数明显多于九龙山和高桥; 仅各1种的溯河洄游鱼类和降海洄游鱼类分别出现于流沙湾和东海岛; 东海岛的两侧洄游鱼类少于另外三个采样点。

图 1 雷州半岛各采样点的物种数及各生态类群的百分比组成 Fig. 1 Composition of fish species and ecological groups of each site in Leizhou Peninsula

图选项

2.4 聚类分析

基于115条COⅠ序列的101个单倍型构建系统关系树，同种鱼类的不同个体间均可各自聚为独立的一支，且属内不同物种间界限清晰(如图 2)。虾虎鱼科(Gobiidae)的弹涂鱼属(Periophthalmus)、青弹涂鱼属(Scartelaos)聚为一支，与虾虎鱼科(Gobiidae)的背眼虾虎鱼属(Oxuderces)及其它的属亲缘关系很近(以◆表示)，从而可以进一步证实经数据库相似度比

图 2 雷州半岛红树林94个物种的115条COⅠ序列构建的邻位连接树 Fig. 2 The neighbor-joining tree of 115 COⅠbarcoding sequences of 94 species in mangrove waters of Leizhou Peninsula

图选项

对高的物种并非尾斑舌塘鳢(Parioglossus dotui)，而是弹涂鱼(P. modestus)。另外，鲀形目(Tetraodontiformes)(以▲表示)及鲻科(Mugilidae)的鲻属(Chelon)(以○表示)也能各自聚为独立的一支，且置信度高。其中，庇隆氏拟单角鲀(P. peroni)与同属于四齿魨科(Tetraodontidae)的其它鱼类聚类关系较远，黑翼文鳐鱼(H. rondeletii)与同属于鹤鱵目(Beloniformes)(以□表示)的其它鱼类聚类关系较远，此外，一些目内科属间的聚类关系出现一些异常，即鲉形目(Scorpaeniformes)、鲽形目(Pleuronectiformes)(分别以■和◇表示)的物种与其它目的聚类关系比较混乱。

3 讨论

红树林同海草床和珊瑚礁海域存在相通性，是鱼类重要的栖息地和育幼场，研究其鱼类的种类对于保护物种多样性具有极其重要的作用(Honda et al，2013)。由于红树林中鱼类栖息环境变化大，性状特征变异快及存在隐存种、新物种和杂交种(Zemlak et al，2009)等问题加大了传统形态学分类鉴定的难度。本研究将COⅠ条形码应用于雷州半岛沿岸红树林鱼类的分类鉴定，提高物种鉴定的准确性及有利于推动DNA条形码数据库共享平台的建设，同时也揭示出了一些问题。

3.1 应用COⅠ条形码进行鉴定发现的问题

应用COⅠ条形码鉴别出红树林鱼类共计94种，由此可见其作为通用引物的广泛适用性及其优势。但由于DNA条形码数据库仍有欠缺，本研究的鱼类样品中仍有一些物种未能进行分子鉴定，以及由于时间久远和鉴定方法不够完善，有的后期研究结果未及时更新至数据库。建议需加强标本资料的收集及进一步完善DNA条形码数据库，推动国际数据库共享平台的建设。另有研究指出单一的COⅠ基因并非适用于所有鱼类物种的鉴别(Krück et al，2013)。水产养殖中出现了广泛培育杂交种及近海外来物种的侵袭等新的问题，加大了研究难度，新的研究工具 “多基因条形码”应加大研究和应用(Chesters et al，2015)，并及时补充低分化物种的其它相关数据(如线粒体DNA控制区等)进行更进一步的分析。

3.2 红树林对于不同生态类群鱼类的保育意义和生境危机

红树林区采集的鲤形目(Characiformes)鱼类有2种(占2.13%)与何秀玲等(2002)对雷州半岛红树林区的调查发现的鲤形目鱼类占总物种数的3.90%近似，但远低于长江口潮沟的优势类群鲤形目(占物种总数14.94%)(金斌松，2010)，这可能是由于长江口的径流量较雷州半岛红树林河口的径流量大，更适宜于鲤形目鱼类的生存。由生态类群分析来看，红树林海域的物种数占优势的是海洋洄游鱼类、海洋偶见鱼类和两侧洄游鱼类，其特征同金斌松(2010)研究的长江口盐沼潮沟鱼类的生态类群组成相似，表明红树林生态系统是许多海水、淡水和洄游性鱼类在特定生活阶段的重要栖息地和育幼场所，且与已有的红树林调查一致(Elliott et al，2007; Franco et al，2008; 黄德练等，2013)。红树林采集到的10种定居鱼类，占物种总数的10.64%，主要是虾虎鱼类，其依靠特化的生理构造，比其它类型鱼类更能适应盐度波动、潮汐涨落等复杂多变的红树林生态环境，成为了代表性物种。

3.3 COⅠ条形码在系统进化分析中的适用性和局限性

系统关系树中的同种鱼类的不同个体间均可各自聚为独立的一支，且属内不同物种间界限清晰，但对于科以上的聚类关系分析不是很清晰，如鲉形目(Scorpaeniformes)、鲽形目(Pleuronectiformes)的物种与其它目的聚类关系比较混乱，表明COⅠ条形码具备一定的低阶元系统进化分析能力，但对于高级阶元的系统进化分析准确性明显降低。究其原因，可能是COⅠ条形码序列长度仅约560bp，信息位点数目有限，科间变异较大，且在高级阶元时碱基置换趋于饱和，这与COⅠ条码序列间K2P遗传距离值在种以上的高级阶元的增加明显变缓的特征相符合。

为了获得较为准确的物种系统发生关系，构建比较客观的进化树，可以选择mtDNA不同区域的多组序列的组合比较的途径; 或选择核DNA序列和mtDNA不同区域相结合的方法; 或选择整个mtDNA全序列来进行研究的方法。近年来，这些方法也得到过验证(Rocco et al，2007; Keskin et al，2009; Catanese et al，2010)。此外，研究发现，庇隆氏拟单角鲀(P. peroni)与同属于四齿魨科(Tetraodontidae)的其它鱼类聚类关系较远，黑翼文鳐鱼(H. rondeletii)与同属于鹤鱵目(Beloniformes)的其它鱼类聚类关系较远，在一定程度上说明了这两种鱼类目前的分类地位有待进一步的商议。

综上所述，本文利用COⅠ条形码技术可有效快捷地鉴定出红树林海域的鱼类并发现物种多样性极其丰富，红树林生态系统更是许多淡水、海水和洄游性鱼类的重要栖息地和育幼场所。虽然COⅠ条形码在属内的同物种间界限清晰，但对于科以上的聚类关系分析不是很清晰，说明其具备一定的低阶元系统进化分析能力，但对于高级阶元的系统进化分析准确性有所降低，其原因与序列长度较短有关，对于高阶元系统关系分析，应该加强对“多基因条形码技术”的研究，更加准确的确定物种的系统进化关系和分类地位。由于采样方法的限制以及近海生态环境的多变，对组成生态类群的鱼类样本采集不够全面，并且加上人类的过度捕捞，导致近海渔业资源的枯竭，给研究工作带来了一定的困扰。支持Thomsen等(2012)提出的可以尝试利用DNA条形码来检测水体中的体表细胞或分泌物来研究鱼类的种群分布和活动范围，使条形码技术成为鱼类迁徙、洄游等相关研究的便利工具。

参考文献

王中铎, 郭昱嵩, 陈荣玲, 等. 2009. 南海常见硬骨鱼类COⅠ条码序列. 海洋与湖沼, 40(5): 608–614

伍汉霖, 邵广昭, 赖春福, 等. 2012. 拉汉世界鱼类系统名典. 台湾: 水产出版社, 10-550

伍汉霖, 钟俊生. 2008. 中国动物志(硬骨鱼纲): 鲈形目5(虾虎鱼亚目). 北京: 科学出版社, 164-750

何秀玲, 叶宁, 宣立强. 2003. 雷州半岛红树林海区的鱼类种类调查. 湛江海洋大学学报, 23(3): 3–10

张乔民, 隋淑珍. 2001. 中国红树林湿地资源及其保护. 自然资源学报, 16(1): 28–34

金斌松. 2010. 长江口盐沼潮沟鱼类多样性时空分布格局. 上海: 复旦大学博士论文, 12

黄德练, 吴志强, 黄亮亮, 等. 2013. 广西钦州港红树林区鱼类物种多样性分析. 海洋湖沼通报, 135–142

谢庆裕. 2012. 我国红树林半世纪来丧失73%. 南方日报, A20

萨姆布鲁克J, 拉塞尔DW编著, 黄培堂译. 2008. 分子克隆实验指南(上、下二册). 北京: 化学工业出版社, 693

Blaber S J M. 2007. Mangroves and fishes: issues of diversity, dependence, and dogma. Bulletin of Marine Science, 80(3): 457–472

Castellanos-Galindo G A, Krumme U, Rubio E A, et al. 2013. Spatial variability of mangrove fish assemblage composition in the tropical eastern Pacific Ocean. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 23 69–86

Catanese G, Manchado M, Infante C. 2010. Evolutionary relatedness of mackerels of the genus Scomber based on complete mitochondrial genomes: strong support to the recognition of Atlantic Scomber colias and Pacific Scomber japonicus as distinct species. Gene, 452(1): 35–43

Chesters D, Zheng W M, Zhu C D. 2015. A DNA Barcoding system integrating multigene sequence data. Methods in Ecology and Evolution, 6(8): 930–937

Elliott M, Whitfield A K, Potter I C, et al. 2007. The guild approach to categorizing estuarine fish assemblages: a global review. Fish and Fisheries, 8(3): 241–268

Field C B, Osborn J G, Hoffman L L, et al. 1998. Mangrove biodiversity and ecosystem function. Global Ecology and Biogeography Letters, 7(1): 3–14

Franco A M, Elliott M, Franzoi P, et al. 2008. Life strategies of fishes in European estuaries: the functional guild approach. Marine Ecology Progress Series, 354 219–228

Gajdzik L, Vanreusel A, Koedam N, et al. 2014. The mangrove forests as nursery habitats for the ichthyofauna of Mida Creek (Kenya, East Africa). Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 94(5): 865–877

Hajibabaei M, Singer G A C, Hebert P D N, et al. 2007. DNA barcoding: how it complements taxonomy, molecular phylogenetics and population genetics. Trends in Genetics, 23(4): 167–172

Han W D, Lui J K, He X L, et al. 2003. Shellfish and fish biodiversity of mangrove ecosystems in Leizhou Peninsula, China. Journal of Coastal Development, 7(1): 21–29

Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L, et al. 2003. Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 270(1512): 313–321

Honda K, Nakamura Y, Nakaoka M, et al. 2013. Habitat use by fishes in coral reefs, seagrass beds and mangrove habitats in the Philippines. PLoS One, 8(8): e65735

Keskin E, Can A. 2009. Phylogenetic relationships among four species and a sub-species of Mullidae (Actinopterygii; Perciformes) based on mitochondrial cytochrome B, 12S rRNA and cytochrome oxidase II genes. Biochemical Systematics and Ecology, 37(5): 653–661

Kimirei I A, Nagelkerken I, Mgaya Y D, et al. 2013. The mangrove nursery paradigm revisited: otolith stable isotopes support nursery-to-reef movements by indo-Pacific fishes. PLoS One, 8(6): e66320

Krück N C, Tibbetts I R, Ward R D, et al. 2013. Multi-gene barcoding to discriminate sibling species within a morphologically difficult fish genus (Sillago). Fisheries Research, 143 39–46

Kuo S R, Lin H J, Shao K T. 1999. Fish assemblages in the mangrove creeks of northern and southern estuaries Taiwan. Estuaries and Coasts, 22(4): 1004–1015

Li N, Chen P M, Qiao P P, et al. 2014. Research advances on marine ecological effect and repairing techniques of coastal mangrove wetland. Asian Agricultural Research, 6(8): 60–64

Nickerson D J. 1999. Trade-offs of mangrove area development in the Philippines. Ecological Economics, 28(2): 279–298

Rocco L, Liguori I, Costagliola D, et al. 2007. Molecular and karyological aspects of Batoidea (Chondrichthyes, Elasmobranchi) phylogeny. Gene, 389(1): 80–86

Rozas J, Rozas R. 1999. DnaSP version 3: An integrated program for molecular population genetics and molecular evolution analysis. Bioinformatics, 15(2): 174–175

Swartz E R, Mwale M, Hanner R. 2008. A role for barcoding in the study of African fish diversity and conservation. South African Journal of Science, 104(7-8): 293–298

Thomsen P F, Kielgast J, Iversen L L, et al. 2012. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS One, 7(8): e41732

Triantafyllidis A, Bobori D, Koliamitra C, et al. 2011. DNA barcoding analysis of fish species diversity in four north Greek lakes. Mitochondrial DNA: The Journal of DNA Mapping, Sequencing, and Analysis, 22(S1): 37–42

Ward R D, Zemlak T S, Innes B H, et al. 2005. DNA barcoding Australia's fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 360(1462): 1847–1857

Zemlak T S, Ward R D, Connell A D, et al. 2009. DNA barcoding reveals overlooked marine fishes. Molecular Ecology Resources, 9(S1): 237–242