青蛤(Cyclina sinensis)是我国近海重要的经济软体动物。近年来, 海水贝类养殖业中各种病害的爆发严重制约着行业的健康发展。因此, 开展软体动物先天性免疫识别路径方面的研究尤为重要, 能够为其免疫学理论及病害防治措施提供有价值的实验数据。

软体动物具有非特异性的先天免疫系统, 其Toll样受体(TLRs), 是一类很重要的模式识别受体, 能够识别细菌、真菌、原生动物以及病毒等病原体的侵染(Akira et al, 2006)。有研究表明, TLR3可以识别双链RNA(dsRNA)的类似物, 聚肌苷-脱氧胞苷酸(Poly I:C) (Yamamoto et al, 2003), TLR3缺陷型的小鼠还对巨细胞病毒呈易感性(Tabeta et al, 2004)。肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factors, TRAFs)是衔接Toll样/白细胞介素1受体(Toll/IL-1 receptor, TIR)超家族以及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor)超家族的重要分子。目前在哺乳动物中已经发现的TRAFs家族成员有7个(TRAF1-7)。Ishida等(1996)通过酵母双杂交对于CD40信号传导作用的研究时, 发现了能与CD40作用的TRAF6。其分子包括C端的指环型锌指结构, 两个TRAF型锌指结构, N端的coiled-coil结构域以及MATH(Meprin and TRAF homology)结构域。TRAF6是衔接Toll样/白细胞介素1受体(Toll/IL-1 receptor, TIR)超家族以及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor)超家族的重要分子, 在动物机体的脑、心脏、肝、骨骼肌、肾脏、脾脏等组织中均能表达。

1 材料与方法 1.1 材料

青蛤样品采于天津大港海域, 选取成体、形态无显著差异的个体[平均壳长(29.14±1.23)mm, 平均壳宽(19.12±0.57)mm, 平均壳高(29.52±1.47)mm]。实验前在通气海水中暂养, 海水密度1.02—1.04g/cm³, 水温21—24℃, pH 7.0, 投喂5‰小球藻, 一周后进行实验。

1.2 方法 1.2.1 青蛤转录组文库的构建及数据筛选

采用Trizol法提取活体青蛤各组织总RNA, 采用QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits方法进行分离纯化。采用Illumina MiSeq二代测序仪完成转录组测序。对Unigene进行Pathway通路的注释和预测(Pan et al, 2015), 从中筛选得到青蛤TRAF6(Cs TRAF6)基因的类似序列。

1.2.2 侵染实验

实验所用Poly I:C浓度为1μg/g。利用随机分组方法选取对照组和实验组, 每组设置10个平行试验。在实验组青蛤的闭壳肌内注射50μL Poly I:C悬液, 对照组注射等量灭菌海水。注射前准确称取青蛤闭壳肌、鳃、性腺、外套膜和肝脏各50mg, 迅速放入液氮中, 在预冷匀浆器中按质量体积比1︰9加入预冷生理盐水进行匀浆, 4°C, 4500r/min离心15min, 取上清备用。分别于注射后0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h提取血淋巴, 4°C, 8000r/min离心10min, 收集血细胞, 加入1mL Trizol, 于–80°C超低温冰箱冷冻备用。

1.2.3 生物信息学分析

利用筛选得到的青蛤CsTRAF6基因类似序列设计引物Cs TRAF6-S、CsTRAF6-A (表 1)并克隆, 测序后与GenBank核酸数据库进行BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比对分析; ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)预测开放阅读框(ORF); 利用ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)在线分析蛋白质性质; 使用ProtParam分析预测蛋白质的理论分子量以及等电点; SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)查找蛋白质结构域; 使用ClustalX1.83对氨基酸序列进行比对, 并根据邻接法(NJ), 使用MEGA4.1构建基因的物种进化树, 采用bootstrap1000个循环检验拓扑结构的置信度。

1.2.4 CsTRAF6基因在各组织内的表达分析

参考(魏星等, 2015)方法, 将青蛤闭壳肌、鳃、性腺、外套膜和肝脏的上清液与注射0h的血细胞分别置于1mL TRIZOL中用于提取总RNA, 根据TaKaRa公司的PrimerScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA, 以cDNA为模板, β-actin基因为内参基因进行实时荧光定量PCR。根据β-actin基因和克隆得到的CsTRAF6基因序列分别设计引物: β-actin-F, β-actin-R, CsTRAF6-F, CsTRAF6-R (表 1)。反应在iQ5荧光定量PCR仪上进行, 扩增体系20μL, 反应程序: 95°C预变性30s, 94°C变性5s, 60°C退火30s, 72°C延伸30s, 共40个循环。数据的处理采用2^-ΔΔCT法(Livak et al, 2001), 数据分析利用SPSS软件进行。

1.2.5 Poly I:C侵染后青蛤血淋巴CsTRAF6基因的时序性表达

分别在注射后0h、3h、6h、12h、24h、48h提取青蛤血淋巴细胞总RNA, 方法及引物同1.2.4。反应程序: 95°C预变性30s, 95°C变性5s, 58°C退火30s, 72°C延伸30s, 共40个循环。数据的处理采用2^−ΔΔCt法, 使用SPSS软件对相同时间点实验组及对照组, 实验组及空白组的表达量进行单因素方差分析。

2 结果 2.1 CsTRAF6基因的序列分析

青蛤CsTRAF6基因的ORF为2337bp, 能够编码出含有778个氨基酸的多肽。该多肽的估计分子量为86.59kDa, 估计等电点为6.16。通过SMART在线分析表明CsTRAF6编码的氨基酸包含RING型锌指结构(183—221aa), 两个TRAF型锌指结构(266—320aa, 320—377aa), coiled-coil结构域(592—624aa)以及MATH结构域(629—756aa)(图 1)。CsTRAF6基因在GenBank中的注册号为KP067203。

2.2 CsTRAF6基因的系统进化分析

利用BLASTP比对表明, 青蛤CsTRAF6基因的氨基酸与栉孔扇贝TRAF6基因的同源性最高, 达到60%。与霸王花青螺Lottia gigantean TRAF6 (XP_ 009051677.1)、虾夷扇贝TRAF6基因氨基酸序列同源性分别为56%和48%。利用16个物种的TRAF6基因(图 2)构建的系统树表明, 不同物种的TRAF6基因各自聚成一支, 其中哺乳动物与软体动物的TRAF6基因明显的聚在两个分支上, 青蛤CsTRAF6基因与其它软体动物的TRAF6基因聚在一支。果蝇、对虾的TRAF6基因分别独立聚成一支。刺参与文昌鱼的TRAF6基因聚在一个分支上。由此可见, 青蛤CsTRAF6基因的分子生物学特性与软体动物在分类学上的进化地位的一致性。

2.3 CsTRAF6基因在组织间的表达分析

以青蛤β-actin基因作为内参对照, 运用Real-time PCR方法检测青蛤CsTRAF6在血淋巴、闭壳肌、鳃、性腺、外套膜和肝脏中的表达量(图 3)。结果显示, CsTRAF6在青蛤的六种组织中均能够表达, 而在血淋巴中的表达水平最高, 在闭壳肌中的表达水平次之, 在肝脏的表达量最低。

2.4 CsTRAF6基因在Poly I:C刺激下的表达分析

青蛤在Poly I:C侵染后, 不同时间点的血淋巴中CsTRAF6基因相对于β-actin基因的表达变化如图 4所示。结果显示, 实验组的表达量在侵染后的3h时迅速升高; 表达量在6h时达到最大值, 与对照组相比差异显著(P < 0.05), 约为对照组的3.8倍, 并且显著高于空白组(P < 0.05)。6h后其表达量开始下降, 逐渐恢复至正常水平。

3 讨论

通过青蛤转录组文库筛选得到的青蛤CsTRAF6基因的类似序列, 经克隆及二次测序后, 通过BLAST核苷酸数据库进行比对获得了青蛤CsTRAF6的cDNA序列, 其ORF为2337bp, 能够编码778个氨基酸的蛋白质。预测的CsTRAF6蛋白估计分子量为86.59kDa, 估计等电点为6.16。通过SMART在线分析CsTRAF6基因编码的氨基酸序列包含RING型锌指结构(183—221aa), 两个TRAF型锌指结构(266—320aa, 320—377aa), coiled-coil结构域(592— 624aa)以及MATH结构域(629—756aa)。这些结构域在青蛤中是保守的, 表明它们具有与哺乳动物TRAF6s基因类似的功能。相关研究表明, N端RING型锌指结构与TRAF型锌指结构用于激活IKK (Grech et al, 2000), coiled-coil结构域的作用是自动泛素化从而激活下游NF-κB信号通路(Yang et al, 2004)。此外, MATH结构域能够与通路上游信号分子IRAK相互作用(Arch et al, 1998)。

通过BLASTP比对表明青蛤CsTRAF6的氨基酸与栉孔扇贝TRAF6的同源性最高, 达60%。与霸王花青螺、虾夷扇贝TRAF6氨基酸序列同源性为56%和48%。通过MEGA构建的系统树表明, 不同物种的TRAF6基因各自聚成一支, 青蛤CsTRAF6基因与其它软体动物的CsTRAF6基因聚在一支, 脊椎动物的TRAF6基因聚在其它分支上。黑腹果蝇的TRAF6基因氨基酸序列单独在一个分支上。结果表明, 青蛤CsTRAF6基因与软体动物TRAF6基因进化距离较近, 相反与昆虫以及脊椎动物的TRAF6基因的进化距离较远, 因此, CsTRAF6基因可能是TRAF6家族的一个新成员。

本研究中利用Real-time PCR方法检测其在各个组织中的表达情况。结果显示, 青蛤CsTRAF6基因在所有的组织中普遍表达, 表明其参与多种生物学过程。青蛤像其它双壳类软体动物一样, 有一个开放的循环系统, 其体内的血液渗透压和温度会随着环境而波动。这个开放的血液循环体系对于无脊椎动物的免疫防御有关键的作用(Bigas et al, 2006)。它们可以充当吞噬细胞以及参与体液因子的分泌。CsTRAF6基因在血淋巴中的表达量最高, 这与虾夷扇贝TRAF6的表达情况相似(He et al, 2013), 这表明CsTRAF6可能在抵御病原物质感染时发挥着重要作用。然而这与栉孔扇贝TRAF6(CfTRAF6)基因在组织中的表达情况不同, 其CfTRAF6主要在性腺中表达, 表明CfTRAF6基因在扇贝的发育过程中起着重要作用。上述结果表明CsTRAF6在青蛤体内主要起到免疫作用, 亦说明不同种类软体动物的TRAF6基因在组织中的表达模式及调节功能有明显差别。

前人相关研究认为, 低等动物血液可以直接吞噬和破坏微生物(Sun et al, 2001), 而软体动物的先天免疫系统主要依靠血淋巴的循环运转(Pipe et al, 1997; Wootton et al, 2003)。在脊椎动物中, TLR3是通过识别双链RNA以及合成类似物如Poly I:C, 随后引发MyD88非依赖性途径, 从而引起干扰素的分泌(Alexopoulou et al, 2001)。TRAF6是Toll样受体信号通路中重要的信号转导分子, 本研究中的CsTRAF6基因在Poly I:C的刺激下, 其表达量在侵染后的3h便迅速升高, 说明CsTRAF6基因参与了对于Poly I:C刺激的免疫应答反应, 并且青蛤内存在于TLR3所介导的信号通路, 有关该通路在青蛤体内所发挥的免疫功能还需进一步探索。