大黄鱼(Larimichthys crocea)属硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科、黄鱼属, 是我国“四大海水经济鱼类”之一(姚康等, 2008)。20世纪90年代人工繁育成功后, 大黄鱼成为我国人工育苗量和养殖规模最大的海洋水产养殖品种, 其经济效益显著。由于不重视种质保护和人工选育, 目前人工养殖大黄鱼在体形、生长、肉质、性成熟、抗逆性、抗病性等多钟性状上出现了衰退, 遗传多样性降低, 在一定程度上限制了其养殖业的可持续发展(Gao et al, 2010)。因此, 有必要对大黄鱼进行品质改良, 培育出具有生长快、抗病强、体型肉质好、耐低温等性状的优良品种。

DNA分子标记是根据个体间基因组DNA的多态性发展起来的一类遗传标记技术, 相比形态学标记、细胞学标记、生物化学标记具有一定的优越性(魏东旺等, 2001), 已广泛应用于水产动物遗传育种。大黄鱼遗传育种也普遍采用DNA分子标记技术。王志勇等(2002)采用AFLP技术(Amplified fragment length polymorphism)分析显示, 大黄鱼野生群体和2个养殖群体, 2个福建养殖大黄鱼群体的遗传多样性低于野生群体。李明云等(2003)采用RAPD技术(Random amplified polymorphic DNA)分析表明, 象山港网箱养殖大黄鱼群体遗传多样性水平较低。李鹏飞等(2008)采用鱼线粒体DNA的细胞色素b(Cytochrome b, Cytb)基因片段多态性可以区分大黄鱼、鲵鱼和美国红鱼。王晓清等(2008)采用AFLP和SSR技术(Simple sequence repeats)对亲本与杂交子代分析结果表明, 杂交子代与母本大黄鱼之间的遗传同质性极高, 属于异源精子诱导大黄鱼雌核发育个体。宁岳(2007)分离获得的AFLP和SSR标记应用于大黄鱼的雌性和雄性连锁图谱的构建, 同时确定了大黄鱼性别决定机制。此外, 也陆续筛选获得许多有价值的SSR标记(Guo et al, 2005; Chang et al, 2009)。早期DNA分子标记技术主要应用于大黄鱼遗传多样性检测、系谱确认、遗传连锁图谱的构建中(Ye et al, 2014)。近年来, 研究者主要致力于采用DNA分子标记技术筛选性状相关标记。刘贤德等采用微卫星标记技术对不同大黄鱼家系和群体进行分析, 筛选到与大黄鱼生长性状紧密相关的微卫星标记(刘贤德等, 2012, 2013; 叶华等, 2014)。薛良义等(2013)研究表明大黄鱼肌肉生长抑制素基因3’端非编码区微卫星序列多态性与大黄鱼体长、体质量之间的相关系数没有达到显著水平。但生长性状相关标记发掘较少, 此外是否可用于生产实践还需进一步验证, 因此还需继续筛选生长性状相关标记。

多样性芯片技术(Diversity arrays technology, DArT)是一种基于基因芯片技术的DNA指纹图谱分析方法, 可广泛用于检测和分析动物、植物和微生物的DNA差异以及构建遗传图谱、QTL定位和品种指纹图谱鉴定(Sánchez-Sevilla et al, 2015)。与常规技术相比, DArT不需要明确物种的基因组DNA序列信息, 具有高通量和低成本的显著特点, 克服了以往跑电泳凝胶为主的标记技术产量低、成本高、耗时长、自动化程度低等缺点, 只用少量成本就可进行全基因组的高通量图谱分析。目前该技术已成功用于水稻、大麦、小麦、油菜、桉树、苹果、木薯、拟南芥、木豆、大麦病原菌、沙门氏菌等生物的遗传连锁图谱以及基因定位研究中(Hackl et al, 2010; Schouten et al, 2012)。在水产动物的研究中仅见该技术应用于三疣梭子蟹地理种群多样性分析(荣晔婧等, 2014)。

本研究旨在采用DArT技术鉴定与大黄鱼体长相关的DArT标记。首先按分离群体标记关联分析法筛选“东海1号”大黄鱼体长相关的DArT标记, 后续进一步验证其相关性, 以期为大黄鱼选育和种质资源利用提供有用参考资料。

1 材料与方法 1.1 样品采集

2012年11月从宁波象山港湾水产苗种有限公司网箱养殖的“东海1号”大黄鱼(1龄)中挑选健康无损伤的大黄鱼199尾, 测量每条鱼的体长, 并在鱼鳃盖内侧较软部位植入电子标记。然后分别将其放入水泥池中暂养。使用SPSS 17.0软件统计分析, 分别建立体长的正态分布图, 取体长位于10%的高值个体记为“极端大群体”(20尾), 10%低值个体记为“极端小群体” (20尾)。

1.2 基因组代表性DNA片段文库构建

文库构建方法参照Jaccoud等(2001)描述。采用酚-氯仿法提取基因组DNA, 并将“极端大群体”和“极端小群体”的大黄鱼基因组DNA等量混合。500ng混合基因组DNA用切割频率低的限制性内切酶PstⅠ分别与切割频率高的AluⅠ、BanⅡ、Bsp1286I、BstNI、HaeⅢ、RsaⅠ和TaqⅠ组合进行酶切。在T4 DNA连接酶作用下, 纯化的DNA连接上PstⅠ特异性接头(Wenzl et al, 2004)。连接产物作为模板用于后续PCR扩增, 所用引物为DArT-PstⅠ引物(Wenzl et al, 2004), 反应程序如下: 94°C变性5min后, 以下程序重复35个循环, 94°C变性30s, 53°C复性30s, 72°C延伸1min, 循环完成后72°C延伸反应10min。扩增产物克隆至载体pMD19-T, 转化大肠杆菌TOP10F并涂布于含氨苄青霉素和X-gal的LB培养基上。

1.3 基因组DNA复杂性降低方法的优化 1.3.1 探针制备及芯片点制

从代表性基因组DNA文库中随机挑选单菌落, 利用质粒载体上的通用引物M13F-47和M13R-48对插入的DNA片段进行PCR扩增, 产物用1倍体积异丙醇沉淀。每个7种降低基因组复杂性方法基因组代表性DNA片段数为840个。在芯片中布置质控探针, 阴性对照探针, 阳性对照探针, 空白对照探针, 工作探针。每个探针包含三个重复。每张芯片包含4个点阵, 每个点阵25行、27列, 每个点的位置用“行标-列标”表示。其中1-1—1-3为质控探针, 1-19—1-21为阳性对照探针, 1-7—1-18、1-22—2-3为阴性对照探针, 2-4—25-12为工作探针, 1-4—1-6、25-13—25-27为空白对照探针。从PstⅠ/AluⅠ、PstⅠ/BanⅡ、PstⅠ/Bsp1286I、PstⅠ/BstNI、PstⅠ/HaeⅢ、PstⅠ/RsaⅠ、PstⅠ/TaqⅠ文库中获得的840个基因组代表性DNA片段依次排布在4个点阵中。采用晶芯SmartArrayer^TM 48点样仪进行点制。

1.3.2 荧光标记基因组代表性DNA片段的制备

用M13F-47和M13R-48引物对未插入外源DNA片段的载体进行PCR扩增, 该PCR产物作为reference DNA。经乙醇沉淀后, 加入20μL灭菌水溶解, 放–30°C冰箱保存备用。

采用酚-氯仿法提取大黄鱼“极端大群体”与“极端小群体”基因组DNA, 两组DNA先分别使用7组限制性内切酶(PstⅠ/AluⅠ、PstⅠ/BanⅡ、PstⅠ/Bsp1286I、PstⅠ/BstNI、PstⅠ/HaeⅢ、PstⅠ/RsaⅠ、PstⅠ/TaqⅠ)降低基因组复杂性, 再加PstⅠ特异性接头, 接着用PstⅠ引物对加接头产物进行PCR扩增, 最后扩增产物使用DNAmate沉淀浓缩10倍体积。

取150ng基因组代表性DNA片段变性后用DecaLabel DNA Labeling Kit进行Cy3标记, 加入含十碱基随机引物的5×缓冲液、MixC、Cy5-dCTP、exo-Klenow fragment共2.1μL, 37°C孵育10min后, 加入dNTPs 0.4μL, 37°C孵育30min, 加入0.1μL EDTA (pH 8.0)终止反应。取150ng reference DNA变性后用DecaLabel DNA Labeling Kit进行Cy5标记。

1.3.3 芯片杂交

Cy3和Cy5标记反应产物混合, 再加入1μL鲑精DNA(10g/L)和50μL ExpressHyb™杂交液混合后, 96°C变性3min, 冰浴骤冷1min。将上述反应产物加入预处理的DArT芯片中, 在晶芯^®杂交仪中进行杂交(65°C孵育过夜。杂交后先用0.3×SSC, 0.1% SDS清洗一次, 再用0.06×SSC清洗两次, 离心甩干。

1.3.4 芯片的扫描与数据处理

杂交后采用晶芯® LuxScan^TM 10K-A双通道激光共聚焦扫描仪进行扫描, 并用LuxScan3.0软件进行数据的提取。若对应的reference DNA杂交荧光强度较弱, 则属于坏点, 弃之。质量符合条件的探针, 其对应的荧光强度按照lg[Cy3 Target/Cy5 Reference]进行计算均一化。利用模糊C-均值聚类分析法(模糊度为1.5)将归一化后的芯片信号值分为2组聚类簇(cluster), 如果计算出的聚类簇之间方差至少大于总方差的80%, 则认为此探针具有多态性, 模糊C-均值聚类分析法可将其在不同芯片样本内分成0/1两组类别(Wenzl et al, 2004)。采用ANOVA单侧检验(one-way ANOVA)分析组差异标记。计算P值、q值和FDR, 并制作相应的散点图。

1.4 大黄鱼生长相关分子标记的筛选

从PstⅠ/RsaⅠ代表性基因组DNA文库中随机挑选3360个克隆, PCR扩增插入片段, 重新点制芯片。在芯片中布置质控探针, 阴性对照探针, 阳性对照探针, 空白对照探针, 工作探针。每个探针包含三个重复。每张芯片包含16个点阵, 每个点阵的设置同1.3.1。各取500ng基因组DNA, 分别用PstⅠ与RsaⅠ组合进行双酶切。酶切后加PstⅠ特异性接头, 用DArT-PstⅠ引物引物对酶切产物进行PCR扩增。荧光标记基因组DNA代表性片段的制备方法同1.3.2。芯片预处理、杂交、扫描、数据提取及数据初步处理方法同1.3.3和1.3.4。

1.5 大黄鱼生长相关DArT标记的验证

在后期验证实验中, 重新取177尾网箱养殖的健康、无损伤1龄“东海1号”大黄鱼。使用SPSS 17.0软件统计分析建立体长的正态分布图。这个群体每个个体基因组DNA代表性片段制备、芯片预处理、杂交、扫描、数据提取及数据初步处理方法同1.3.2— 1.3.4。筛选获得的候选DArT标记进行测序, 同时用BLAST2GO (http://www.blast2go.org)软件对鉴定的DArT标记进行基因功能注释。

2 结果 2.1 大黄鱼体长数据统计

随机选择199个大黄鱼样本测量其体长数据。实验群体中的体长最大值为16.30cm、最小值为11.50cm, 均值为13.45cm, 标准偏差1.0337。经过Shapiro-Willie过程进行正态分布检验, 峰度为0.192, 偏度为–0.210, 计算得到P=0.257, 样品符合正态分布(P > 0.05)。因而根据采用分离群体分组分析法(Bulked Segregate Analysis, BSA)建立关于体长的正态分布图(图 1), 在各群体中选取10%的高值个体即体长大于14.80 cm的记为极端大群体, 选取10%的低值个体即体长小于12.00 cm的记为极端小群体, 两组之间体长差异极显著(P < 0.01)。可用于与生长相关DArT标记的初步筛选。

2.2 大黄鱼基因组代表性DNA片段文库的构建

本研究中大黄鱼基因组DNA完整, 纯度高, 无RNA污染(图 2A)。将不同体长的大黄鱼混合后, 分别用PstⅠ/AluⅠ、PstⅠ/BanⅡ、PstⅠ/Bsp1286I、PstⅠ/ BstNI、PstⅠ/HaeⅢ、PstⅠ/RsaⅠ、PstⅠ/TaqⅠ酶切后纯化(图 2B)。在T₄ DNA连接酶作用下, 纯化的DNA酶切片段与Pst Ⅰ特异性接头连接。连接产物作为模板进行后续PCR扩增(图 2C)。PCR产物克隆至pMD19-T载体后转化大肠杆菌Top10F’, 所得7个基因组代表性DNA文库滴度≥10⁵(表 1), 阳性克隆平均插入片段长度 > 500bp(图 2D—J), 符合DArT芯片点制要求。

2.3 降低基因组复杂性方法

大黄鱼“极端大群体”与“极端小群体”样品提取基因组DNA, 分别采用7种酶切组合(PstⅠ/AluⅠ、PstⅠ/BanⅡ、PstⅠ/Bsp1286I、PstⅠ/BstNI、PstⅠ/HaeⅢ、PstⅠ/RsaⅠ、PstⅠ/TaqⅠ)降低基因组复杂性。经标记后的DNA片段分别与各自DArT芯片杂交, 杂交结果清晰可靠。7种酶切组合中, PstⅠ/RsaⅠ不仅可降低基因组复杂性, 且多态性率最高(17.62%)(表 1)。因此, 选择PstⅠ/RsaⅠ基因组代表性DNA片段文库用于大黄鱼体长相关DArT标记的筛选。

2.4 大黄鱼生长相关DArT标记的筛选

重新点制的PstⅠ/RsaⅠ DArT芯片, 其克隆数增加至3360个(图 3A)。并按照上述方法制备“极端大群体”与“极端小群体”PstⅠ/RsaⅠ大黄鱼基因组代表性DNA片段, 并加上Cy3荧光标记, reference DNA为Cy5荧光标记。杂交后进行芯片扫描(图 3A)和数据提取。每张芯片经过归一化处理后, 通过用模糊C-均值聚类分析法获得0/1矩阵。根据计算所得的p值获得散点图(图 2B)。散点图中黑色为无差异位点, 红色为差异显著位点(P≤0.05), 各位点集中在对角线附近, 偏离对角线越大越容易呈现红色。上述差异位点中只有18个DArT候选标记在“极端大群体”与“极端小群体”中聚类结果稳定, 且组间P < 0.01(表 2), 其中17个为“极端大群体”DArT候选标记, 1个“极端小群体”DArT候选标记(表 2)。

2.5 大黄鱼生长相关DArT标记的验证

为验证所筛选DArT候选标记的有效性, 又重新挑选了浙江象山港湾网箱养殖的“东海1号”F6代大黄鱼(1龄) 177尾大黄鱼, 这个群体体长经过Shapiro-Willie过程进行正态分布检验, 也符合正态分布(P > 0.05)。从检验结果可以看到, RsaⅠ1-23等8个DArT标记仍与体长性状紧密相关(P < 0.01) (表 3)。为了进一步确定筛选获得的大黄鱼DArT候选标记, 将上述候选标记进行测序, 测序结果用BLAST2GO软件进行Blastn分析。结果显示测定的序列中6个为已知序列, 2个为未知序列(表 3)。

3 讨论

传统选育需要经历多个生命周期才能分离出稳定遗传的经济性状。随着分子生物学技术的迅猛发展, 运用DNA分子标记技术进行选育, 从分子水平研究与水产动物优良经济性状相连锁的分子标记极大地缩短了选育时间(刘贤德等, 2013)。目前, SSR技术常用于寻找与生长、抗逆等性状紧密连锁或相关标记。如樊佳佳等(2009)关联分析得到7个微卫星位点与体重、体长和体高显著相关(P < 0.05)或极显著相关(P < 0.01)。Yi等(2015)从100个SSR标记中找到8个基因座上9个基因型与鳜鱼生长性状(体重、体长和体高)相关。研究者也试图通过生长、抗逆等性状紧密连锁或相关标记指导大黄鱼遗传育种实践。高国强等(2010)进行了大黄鱼耐低温标记的筛选, 找到一个标记(LYC0002)可能与耐低温有关。刘贤德等采用微卫星标记技术鉴定了LYC0088和LYC0143与大黄鱼不同家系和群体生长性状紧密相关(刘贤德等, 2012, 2013; 叶华等, 2014)。薛良义等(2008)研究表明大黄鱼肌肉生长抑制素基因3’端非编码区微卫星序列多态性与大黄鱼体长、体质量无相关性。Ni等(2012)在浙江养殖大黄鱼生长基因内含子1的196位SNP(Single nucleotide polymorphysim)与体长和体高相关, 在两个群体大黄鱼生长基因内含子2的692位SNP与体重全长显著相关。本研究中首次采用DArT技术鉴定了8个大黄鱼体长相关DArT标记, 其中7个为“极端大群体”DArT候选标记, 1个“极端小群体”DArT候选标记。

一般有两种方法筛选和鉴定水产动物目标性状相关联的分子标记, 一种是分离群体标记关联分析法, 该方法可快速获得与目的性状连锁的分子标记, 缺点是灵敏度和精确度都较低; 另一种为随机选择群体标记关联分析法, 该方法可全面分析所选用的标记, 准确度和精确度较好, 缺点是需要检测的样本量大和分析费用较高(樊佳佳等, 2009)。本研究采用分离群体标记关联析法进行初步筛选, 根据“东海1号”大黄鱼体长数据挑出“极端大群体”和“极端小群体”, 从两个群体中获得18个与体长相关DArT候选标记。随后新群体中验证确认RsaⅠ1-23等8个DArT标记仍与体长性状紧密相关。由于仍不能保证本研究中所筛选到的标记在其它群体适用, 因而在后续研究中尚需扩大群体的规模和类型, 进行多方比较进行进一步验证, 为下一步基因辅助育种、进一步提高性状选择的准确性提供依据。

4 结论

本研究从PstⅠ/RsaⅠ基因组代表DNA片段文库中扩增获得3360个基因组代表性DNA片段, 制备大黄鱼体长相关多样性芯片。杂交信号转换为0/1矩阵并进行统计分析筛选, 初步获得18个大黄鱼体长相关DArT候选标记。之后经过验证表明仍有8个DArT标记与新群体的体长相关。本研究成功应用DArT技术筛选到与体长相关标记, 该方法也可以应用于其它生长相关性状标记筛选。同时本研究成果可直接指导大黄鱼人工选育工作; 也可作为进一步研究大黄鱼生长相关的遗传连锁图谱提供基础, 并对其它水产经济动物的遗传育种的建立提供理论依据与实践参考。