太平洋双色鳗鲡(Anguilla bicolor pacifica)隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鳗鲡目(Anguilliformes)、鳗鲡科(Anguillidae)、鳗鲡属(Anguilla), 主要分布于西太平洋的赤道地区, 其中从婆罗洲东海岸、新几内亚北部到菲律宾的吕宋岛分布最多, 在我国台湾地区也有发现(Han et al, 2001)。东南亚太平洋双色鳗鲡的苗种资源丰富, 鳗苗价格较日本鳗鲡(A. japonica)和美洲鳗鲡(A. rostrata)低, 而生长速度与日本鳗鲡和美洲鳗鲡接近, 具有较高的市场潜力。近年来我国各地陆续从菲律宾和印度尼西亚等地引进了鳗鲡苗种(主要是太平洋双色鳗鲡和花鳗鲡(A. marmorata))进行养殖, 取得了一定的效果。但太平洋双色鳗鲡的养殖技术还不成熟, 成活率不高, 且病害较多。目前, 国内外还未见关于太平洋双色鳗鲡细菌性病原的鉴定和药物敏感性方面的报道。

本课题组前期对日本鳗鲡、欧洲鳗鲡(A. anguilla)和美洲鳗鲡的主要病原及防治药物进行了大量的基础研究(佟延南, 2009; 汪黎虹, 2010; 杨求华, 2012), 在此基础上针对鳗鲡养殖种类的变化, 逐步对新引进的花鳗鲡和太平洋双色鳗鲡的主要病原开展研究(杨方圆等, 2013)。

近年来, 由于中草药含具增强免疫功能的生物活性分子, 同时也有来源广泛、价格便宜和不易受生物排斥等不同于传统渔药和疫苗的优点, 其作为渔用药物已被广泛的研究(Galina et al, 2009; Bulfon et al, 2015)。目前, 中草药的体外抑菌研究已在嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、维氏气单胞菌(A. veronii)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)等常见水产病原菌中开展, 研究表明五倍子(Galla chinensis)、石榴皮(Runica Granatum)和大黄(Rheum palmatum)等中药对常见的水产病原菌具有较好的体外抑杀效果(表 1)。

2012年5月, 福清市某鳗鱼养殖厂养殖的太平洋双色鳗鲡暴发疾病, 病鳗漂浮于水面, 死亡鳗鲡主要症状为肛门有黄色粘液流出, 肠粘膜充血糜烂, 肝脏肿胀。本文对该病病原进行了分离和鉴定, 并研究了其毒力和中药敏感性, 旨在为该病的防治提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 材料和试剂

健康太平洋双色鳗鲡购于某鳗鱼养殖厂, 平均体重为(10±2) g, 暂养于集美大学水产试验场, 水温26-28℃, 溶氧 > 5mg/L。

M-H培养基(上海博微生物科技有限公司); BIOLOG专用培养基(美国BIOLOG公司); GYZ-15eV发酵型革兰氏阴性杆菌生化编码鉴定管(杭州滨和微生物试剂有限公司); 细菌基因组DNA快速提取试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。

大黄、连翘(Forsythia suspensa)、诃子(Terminalia chebula), 产地福建; 石榴皮、肉桂(Cinnamomum cassia), 产地甘肃; 生地榆(Sanguisorba officinalis)、五倍子, 产地湖北; 丁香(Eugenia caryophllata)、首乌藤(Polygonum multiflorum), 产地广西; 槟榔(Areca catechu), 产地海南。

1.2 病原菌的分离纯化和生理生化鉴定

取具有典型发病症状的病鳗鳃、体表粘液在显微镜下进行寄生虫和真菌排查, 用75%酒精棉球擦拭体表消毒, 于无菌条件下取肝脏组织, 划线接种于M-H培养基, 28℃培养24h后, 出现大量菌落, 挑取优势菌落, 经2次纯化培养后, 得到菌株AMSH1。将分离所得菌株进行革兰氏染色、芽孢染色, 根据结果, 按照产品使用说明书运用GYZ-15eV生化检测试剂盒和BIOLOG自动微生物鉴定系统对该菌株进行鉴定。

1.3 16S rDNA基因序列测定与系统发育分析

按试剂盒的说明书提取细菌基因组DNA, 以此为模板, 用通用引物27F: 5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′和1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′扩增细菌的16S rDNA基因片段。PCR反应条件为: 94℃ 5min; 94℃ 1min, 53℃ 1min, 72℃ 2min, 33个循环; 72℃ 10min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后, 送上海生工生物工程技术公司测序。

将菌株AMSH1的16S rDNA基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析, 从中选取与所获序列同源性较高的同种细菌的16S rRNA基因序列, 并从GenBank数据库中获得气单胞菌属(Aeromonas sp.), 爱德华氏菌属(Edwardsiella sp.)和弧菌属(Vibiro sp.)细菌的16S rDNA序列, 采用ClustalX 1.83软件进行多序列匹配排列, 利用MEGA 5采用邻位连接法(Neighbor-Joining, NJ)构建系统发育树, 通过自举分析进行置信度检测, 自举数集1000次。

1.4 人工感染试验

将分离纯化的AMSH1菌株接种于M-H液体培养基中37℃振荡培养24h后, 4000g离心10min沉淀菌体, 无菌生理盐水清洗3次, McFarland比浊法调节菌悬液浓度为1×10⁹CFU/mL, 用无菌生理盐水10倍梯度稀释成浓度为1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0× 10⁵CFU/mL的菌悬液。健康太平洋双色鳗鲡随机分成6组, 分5个菌悬液浓度组和1个对照组, 每组设2个试验箱, 每箱放鱼5尾, 每尾鱼腹腔注射0.1mL, 对照组注射生理盐水。试验周期为14d, 期间持续充气、定时投喂和排污换水, 水温26-28℃。观察记录各组鱼的症状和死亡情况。对死亡鱼进行解剖和病原菌再分离、鉴定。根据Reed-Muench法测定半致死量(Wardlaw, 1985)。

1.5 中药药敏试验

将中药进行冷冻超微粉碎, 加工方法参见李忠琴等(2012)。将中药超微粉以1g/mL浓度进行两倍梯度稀释, 加入M-H培养基中, 配制成不同浓度的药敏培养基, 每个药物浓度梯度设置2组平行, 空白对照组M-H培养基不加中药。将菌悬液(浓度为1×10⁷CFU/mL)接种于药敏培养基平板上, 28℃恒温培养, 观察菌落的生长情况。以24h无菌落形成的最低浓度为中药对该菌株的最低抑菌浓度(MIC), 以48h无菌落形成的最低浓度为中药对该菌株的最低杀菌浓度(MBC)。双联用部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration, FIC)指数计算: FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+ MIC乙药联合/MIC乙药单用; 三联用FIC=MIC甲药联合/MIC甲药单用+ MIC乙药联合/MIC乙药单用+ MIC丙药联合/MIC丙药单用。双联用和三联用FIC判读标准见表 2。

2 结果 2.1 菌株生理生化鉴定

从病鳗肝脏中分离得到的致病菌菌株AMSH1, 利用GYZ-15eV系统鉴定, 结果显示该菌尿素酶、磷酶、二磷酶、柠檬酸盐、产H₂S试验和V-P试验均为阴性, 鉴定结果为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides), 可信度为10.66%。利用BIOLOG自动微生物系统进行鉴定, 结果菌株AMSH1为类志贺邻单胞菌, 鉴定结果相似性为100%。该菌株能利用葡萄糖、麦芽糖、果糖、海藻糖、肌醇、天冬氨酸、L-谷氨酸和L-丝氨酸, 不能分解乳糖、蔗糖、甘露糖、岩藻糖、D-丝氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸和L-精氨酸。从人工感染死亡的太平洋双色鳗鲡再分离到的细菌的鉴定结果与菌株AMSH1的鉴定结果一致。

2.2 16S rRNA基因序列分析和系统进化树的构建

用通用引物扩增菌株AMSH1的16S rDNA, 测序获得长度为1455bp的片段。经过GenBank进行Blast同源性分析, 结果表明, AMSH1的16S rDNA与已登陆的类志贺邻单胞菌16S rDNA序列的同源性均达到99%。构建的系统进化树显示其与类志贺邻单胞菌聚为一支, 且置信度高达100%。菌株AMSH1与肠杆菌科的迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda, KC763831.1)的亲缘关系比弧菌科的弧菌属(Vibiro sp.)和气单胞菌属(Aeromonas sp.)的亲缘关系近(图 1)。

2.3 人工感染

通过腹腔注射健康的太平洋双色鳗鲡, 菌株AMSH1在1.0×10⁶CFU/mL及以下浓度时, 没有出现死亡。1.0×10⁸CFU/mL和1.0×10⁷CFU/mL浓度组在48-120h出现死亡, 累计死亡率分别为80%和30%。注射最高浓度组1.0×10⁹CFU/mL的太平洋双色鳗鲡在24h后开始出现死亡, 并在96h内全部死亡。对照组鱼未死亡(表 3)。依据人工感染试验结果, 计算出该菌对太平洋双色鳗鲡的半致死量LD₅₀=3.52×10⁵CFU/g。人工感染致死鳗鲡的症状为肛门有黄色粘液流出, 肝脏肿胀, 肠粘膜充血, 与养殖厂发病鳗鲡的症状相同(图 2)。

2.4 中药敏感性

试验结果表明, 10味中药对菌株AMSH1均有较好的抑制效果, MIC和MBC范围为2-24mg/mL。其中五倍子、丁香和生地榆的抑菌效果最好, MIC范围为2-4mg/mL (表 4)。在10味中药中选取5味效果较好的单方组合成10种双联用复方进行试验, 发现其中有7种双联用复方对菌株AMSH1具有协同抑菌作用, 含有五倍子的4种双联用复方均有协同抑菌作用(表 5)。4种三联用复方仅五倍子复方A具有协同抑菌作用, 另外3种均为相加抑菌作用(表 6)。中药敏感性试验表明五倍子的抑菌效果最显著, 含有五倍子的4种双联用复方和1种三联用复方均有协同抑菌效果。

3 讨论

本试验中, 从太平洋双色鳗鲡病鱼肝脏中分离得到的病原菌株经回归感染证实具有很强的致病性, 半致死量LD₅₀为3.2×10⁵CFU/g。运用BIOLOG自动微生物系统鉴定结果显示该菌株为类志贺邻单胞菌, 且相似性为100%。鉴定结果发现该菌株能利用葡萄糖, 不能分解蔗糖和甘露糖, 此特征与从鲟鱼(Huso husoa ♀ × Acipenser ruthenus♂) (王小亮等, 2013)和尼罗罗非鱼(Tilapia) (刘志刚等, 2015)中分离得到的类志贺邻单胞菌菌株一致。通过测序比对分析该菌株的16S rDNA基因序列与6株类志贺邻单胞菌的相似性高达99%, 同时构建的进化树也表明与这6株类志贺邻单胞菌聚合为一支, 因此可判定该菌株为类志贺邻单胞菌。

类志贺邻单胞菌是一种革兰氏阴性短杆菌, 能运动, 需氧或兼性厌氧, 曾归属于弧菌科, 后研究发现其在分子水平跟邻单胞菌和变形杆菌属更为接近, 归入肠杆菌科, 邻单胞菌属(Ruimy et al, 1994)。类志贺邻单胞菌广泛存在于自然界, 可引起人的急性腹泻和食物中毒等疾病。该菌作为病原菌可单独或混合感染水生动物, 已在日本鳗鲡等养殖鱼类中发现(Cruz et al, 1986; 陈林等, 2009; 陆文浩等, 2009; Joh et al, 2012; 王小亮等, 2013; 刘志刚等, 2015), 但目前还没有感染并导致养殖太平洋双色鳗鲡死亡的报道。

本实验室从各地鳗鱼养殖厂取样检测的结果表明, 类志贺邻单胞菌在0-100g/ind的小规格太平洋双色鳗鲡中的检测较高, 100g/ind规格以上的太平洋双色鳗鲡中未检测到该菌。同时类志贺邻单胞菌的发病具有明显的季节性, 夏季水温较高的时候发病率高于水温较低的春季和秋季。另外, 在与太平洋双色鳗鲡同池养殖的花鳗鲡中未检测到类志贺邻单胞菌。Joh等(2012)对日本鳗鲡的病原调查发现在日本鳗鲡中类志贺邻单胞菌的检出率为2.2%, 低于太平洋双色鳗鲡中的检出率。太平洋双色鳗鲡作为新的鳗鲡养殖种类, 主要分布于热带, 对其细菌性病原的研究很少。同时, 对类志贺邻单胞菌感染鱼类的报道集中在温水性鱼类(Cruz et al, 1986; 陈林等, 2009; 陆文浩等, 2009; Joh et al, 2012; 王小亮等, 2013)。因此, 研究从太平洋双色鳗鲡分离的类志贺邻单胞菌菌株的毒性及其对药物的敏感性显得更有意义。

中药敏感性试验表明, 10味中药对类志贺邻单胞菌均有抑菌和杀菌效果, MIC和MBC范围为2-24mg/mL。其中五倍子的效果最好, 其次是丁香和生地榆。五倍子对类志贺邻单胞菌的MIC为2mg/mL, 与弧菌属的致病菌较为接近(梁利国等, 2010), 但高于嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌(李忠琴等, 2011)。五倍子中鞣质可能通过与类志贺邻单胞菌体内蛋白质的结合, 凝固微生物体内原生质(Sotohy et al, 1995), 进而达到抑杀作用。鞣质在酸性条件下水解可得到没食子酸。五倍子中所含的没食子酸也具有较好的抑菌活性(郑曙明等, 2010)。丁香中的主要抑菌成分为丁香酚(南京中医药大学, 2005)。地榆的主要药用化学成分为皂苷、鞣质和黄酮类(夏红旻等, 2009), 其中皂苷有止血和造血作用(Sun et al, 2012; 邹文俊等, 2012)。

10种中药双联用复方的体外抑菌效果研究表明, 有协同作用的复方有7种。进一步研究4种中药三联用对类志贺邻单胞菌的体外抑菌效果, 其中1种三联用复方有协同的抑菌作用, 另外3种三联用复方有相加的抑菌作用。表明中药的合理联用在一定程度上可以提高药物之间的协同作用, 降低单味中药的使用量, 增加药效, 比如五倍子复方A中三味中药的剂量比单用时分别降低了87.5%, 75%和75%。双联用五倍子复方1有显著协同作用。五倍子复方1中两味中药主要抗菌成分不同, 分别为鞣质和皂苷, 它们的抗菌机理也不相同, 将这两味中药进行联用就可以多位点、多途径攻击致病细菌的细胞, 提高药物的杀伤力, 同时加快修复受损的组织和器官(李忠琴等, 2012), 这样不仅可以提高每味中药的抗菌活性, 而且在较低浓度下就能够起到抑制或杀灭细菌的作用。而三联用五倍子复方A相比双联用五倍子复方1添加了石榴皮, 石榴皮中的主要成分为鞣质, 安石榴苷甙(Punicalagin)是石榴皮鞣质的主要成分(朱静, 2009)。鞣质成分的增加, 起到了协同抑菌作用。复方不但能够有效降低单味中药的使用剂量, 降低经济成本, 而且可以达到更好的抑菌效果。中药复方相对西药具有药残小、天然、环保和不易产生耐药性等众多优点, 已成为水产养殖动物病害防治研究中的热点。同时中药的推广使用是符合目前健康养殖新形势和无公害水产品开发的要求的。

4 结论

本研究从发病的鳗鲡养殖新种类太平洋双色鳗鲡中分离得到一株优势菌AMSH1。经BIOLOG微生物鉴定系统和16S rDNA序列分析鉴定该菌株为类志贺邻单胞菌, 通过人工回归感染试验表明该菌株具有致病性, 半致死量LD₅₀为3.2×10⁵CFU/g。中药敏感性研究表明含有五倍子成分的4种中药双联用复方和1种三联用复方对类志贺邻单胞菌有较好的协同抑制作用。本研究结果可为太平洋双色鳗鲡类志贺邻单胞菌病的防治提供参考。