胰岛素样生长因子(IGFs, insulin-like growth factors)因其结构与胰岛素原相类似而得名, 它是一种单链多肽, 包括IGF-I、IGF-Ⅱ(Perks et al, 1995)和IGF-Ⅲ(Wang et al, 2008; Li et al, 2011)。IGF-I由70个氨基酸组成, 分子量约为7.5 kDa (Vong et al, 2003), 能通过选择性地促进有丝分裂发生分化以及抑制细胞凋亡, 在生长、分化和繁殖调控中起着相当大的作用(Reinecke et al, 2005)。自Rinderknecht & Humber于1978年首次阐述了IGF-I的一级结构, 很多脊椎动物的IGF-I基因序列已经被克隆得到, 同时对它们的表达模式也进行了相应的研究(Rinderknecht et al, 1978)。在鱼类中, Cao等于1989年首次从鲑(Oncorhynchus tshauytscha)中克隆到鱼类IGF-I cDNA (Cao et al, 1989), 随后, 鲤形目的鲤(Cyprinus carpio) (华益民等, 2001)、草鱼(Ctenapharyngodon idellus) (白俊杰等, 2001)、胭脂鱼(Myxocyprirms asiaticus) (郑凯迪等, 2007), 鲈形目的鲷(Sparus aurata) (Tanaka et al, 1998)、大黄鱼(Larimichthys crocea) (常抗美等, 2012)、花鲈(Lateolabrax japonicus) (钱焜等, 2014)等几十种鱼类的IGF-I基因序列相继得到研究。

银鲳(Pampus argenteus)隶属鲈形目(Perciformes), 鲳科(Stromateidae), 鲳属(Pampus), 分布范围广泛。迄今, 对银鲳的研究涉及分类、资源评估、生态和繁殖特性、人工繁殖、营养成分分析、体成分分析等诸多方面(施兆鸿等, 2009, 2011; 彭士明等, 2010, 2013; 徐善良等, 2012, 2013; 周健恺等, 2014; 王腾飞等, 2015; 闫雪梅等, 2015), 目前对银鲳分子生物学方面的研究较少, 对银鲳胰岛素样生长因子(IGF)基因的克隆, 国内外尚无文献报道。作者在本文中采用同源克隆和RACE-PCR方法, 对养殖银鲳IGF-I的cDNA全长进行克隆, 采用实时荧光定量(Real-Time PCR)技术检测其mRNA的组织表达特性和在肝脏中的表达特性和定位, 以期为研究IGF-I在银鲳生长发育中的调控机理提供基础材料。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验用银鲳取自浙江省宁波市象山鱼得水水产养殖有限公司的银鲳养殖池。选择摄食正常、无病无伤、健康的个体。在养殖的不同阶段, 分别捞取体重为1-5 g、5-15 g、15-30 g、30-50 g、50-100 g、100-150 g、 > 150 g的7种规格鱼体各15尾。立即在冰盘上用无菌解剖工具活体摘取肝脏、肌肉、肾脏、肠、垂体、心、嗅球、胃、鳃、卵巢共10种组织样品, 置于盛有RNA保护酶的冻存管中, 置于-80 ℃冰箱中保存备用。

实验期间养殖池水温25-27 ℃, pH值为8.21±0.3, 盐度为20.3±0.8。饲料为日本林傔株式会社产“鱼宝”5#饲料和新鲜马鲛鱼肉按1︰1反复绞碎制成的湿团状料。

1.2 引物设计

从GenBank中获得已注册的花鲈(Lateolabrax japonicus, JN596878.2)、鳜(Siniperca chuatsi, HM164110.1)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides, AY513719.1)、河鲈(Perca fluviatilis, AJ586907.1)和金头鲷(Sparus aurata, AY996779.2) IGF-I基因的cDNA全长, 运用ClustalX1.83软件找到IGF-I基因的保守区, 并用Primer Premier 5软件设计兼并引物IGF-I-F和IGF-I-R, 进行PCR扩增, 得到一条长度约为762bp核心片段, 根据这部分序列设计5′RACE和3′RACE特异性引物IGF-I-5′R1, IGF-I-5′R2, IGF-I-3′F1, IGF-I-3′F2, 扩增出IGF-I全长cDNA序列, 进一步设计出实时荧光定量PCR引物IGF-I-RT-F, IGF-I-RT-R。基于银鲳18S (AJ564775.1)的cDNA序列, 设计内参基因序列引物18S F和18S R。检验后, 用一对内参基因引物18S-F/R以及一对特异性引物qIGF-I-F/R来检测银鲳不同组织和肝脏不同生长发育时期IGF-I mRNA的表达情况, 测序引物用菌体自带引物M13-R、M13-47-F (表 1)。

1.3 总RNA提取以及cDNA第一链的合成

采用RNA提取试剂盒(Axygen, RNA extraction kit)对同一时期不同组织和不同生长阶段肝脏总RNA分别进行提取。采用TaKaRa反转录试剂盒对上述RNA进行反转录, 获得cDNA。经37 ℃反转录15 min, 于85 ℃灭活反转录酶5 s。将合成得到的cDNA产物保存于-20 ℃或直接用于PCR。

1.4 对IGF-I基因cDNA核心片段进行克隆

以银鲳的肝脏cDNA作为模板, 采用IGF-I-F/R简并引物, 进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL, 优化后的扩增条件如下: 94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s; 55 ℃退火30 s, 于72 ℃延伸1 min, 30个循环; 再于72 ℃延伸10 min; 在4 ℃保存。

将PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, 并切胶回收目的片段。进行连接转化培养, 再根据电泳检测菌液PCR结果, 取阳性克隆菌液, 送上海Sunny生物科技有限公司测序。

1.5 银鲳IGF-IcDNA全长获取

将测序结果在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中, 进行BlastX对比分析, 如果测序所得的IGF-I部分序列与其它物种的IGF-I同源, 即根据测得序列再设计5′RACE和3′RACE的特异性引物IGF-I-5′R1, IGF-I-5′R2, IGF-I-3′F1和IGF-I-3′F2, 用于RACE扩增。采用SMART^TM RACE cDNA试剂盒(Clontech)进行5′RACE和3′RACE, 以获得全长cDNA。

1.6 对IGF-I基因的信息学分析

采用Protparam软件(http://web.expasy.org/protparam/)对蛋白的理化特性进行预测; 并利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上的BlastX工具核酸和蛋白序列相似性进行比较分析; 采用NCBI的ORF Finder分析开放阅读框, 预测氨基酸的序列; 用ExPASy-PROSITE网站(http://prosite.expasy.org/)预测氨基酸功能域; 采用Signal P4.1 Server对信号肽进行分析; 功能域的预测则采用Smart软件; 多序列比对分析则采用ClustalW软件。构建进化树采用MEGA5.05软件中的M-L (Maximum-Likelihood)法。并采用自展法(Bootstrap)进行1000次重复检验。

1.7 实时荧光定量PCR分析

对体重大于100 g的成鱼肝脏、肌肉、肾脏、小肠、垂体、嗅球、胃、心脏、鳃、卵巢10种组织以及体重为1-5 g、5-15 g、15-30 g、30-50 g、50-100 g、100-150 g六个阶段的肝脏组织进行实时荧光定量PCR分析, 每个分析样3个重复。荧光定量PCR时, 先优化模板浓度, 将各类模板按10倍稀释5个浓度梯度, 并用引物分别扩增以确定最佳的模板浓度。并优化引物退火温度, 优化后反应条件为: 95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 59 ℃退火30 s, 40个循环; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。待反应结束, 确定Real-time PCR扩增曲线及溶解曲线, 在ABI StepOnePlus^TM Instrument上进行数据采集和处理。所得数据以平均值±标准差(M±SD)表示, 采用SPSS17.0软件对所测数据进行统计分析, 用One-Way ANOVA法进行显著性检验, 多重比较采用Duncan检验法。本文根据Livak等(2001)方法进行引物效率的检测, 结果发现PCR产物溶解曲线未出现杂峰, 表明产物的特异性较好。采用2^-DDCt法对qRT-PCR结果加以分析处理, 将ΔCt定义为:内标目的基因IGF-I Ct值与18S Ct值之间的差值。

1.8 原位杂交

根据已克隆的IGF-I cDNA序列设计探针模板引物IGF-I-S和IGF-I-A, PCR扩增得到248bp目的序列, 经电泳验证后连接至pGEM-T载体, 转化后取阳性克隆测序鉴定。测序结果比对正确后, 扩培菌液用Omega质粒抽提试剂盒抽提质粒。对重组pGEM-T质粒用限制性内切酶Nco I和Spe I分别进行单酶切, 使得质粒线性化。用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物正确后, 用PCR纯化试剂盒(AxyGen, 美国)回收线性化的模板质粒, 采用0.1%的DEPC处理水溶解。将纯化质粒作为体外转录的DNA模板, 以DIG RNA Labeling Mix为底物, 参照Riboprobe^® System (Promega)的实验程序, 用T7聚合酶和SP6聚合酶(Promega)进行体外转录合成DIG标记的正反义RNA探针。采用没有RNA酶活性DNA酶处理去除DNA模板, 再加入2.5 μL预冷的5 mol/L氯化锂(经DEPC处理)及75 μL冰预冷的无水乙醇, -20 ℃下放置过夜。用DEPC水配制的70%酒精洗沉淀, 吹干后向RNA沉淀中加入30 μL的DEPC水, 待其自然溶解后, 取5 μL进行电泳检测, 置于-80 ℃保存备用。

原位杂交步骤主要参照谢碧文(2008)和陈丽丽(2012)。具体调整方法如下:为保证细胞的完整性采用组织切片技术, 为增加细胞膜通透性采用蛋白酶K于37 ℃消化30 min, 为探针与模板最佳结合且降低非特异性染色采用60 ℃预杂交2 h, 洗掉预杂交液无酶条件干燥后滴加杂交液60 ℃过夜孵育(探针︰预杂交液=1︰100)。

2 结果与分析 2.1 银鲳IGF-I基因cDAN全长的克隆

以银鲳cDNA全长为模板, 用兼并引物IGF-I-F、IGF-I-R扩增, 获得一条762bp的单一条带, 经BlastX分析, 显示与已登录的大黄鱼(Larimichthys crocea, KKF31429.1)、石斑鱼(Epinephelus lanceolatus, ABZ10841.1)、鳜(Siniperca chuatsi, ADO14142.1)、花鲈(Dicentrarchus labrax, AAV67967.1)、军曹鱼(Rachycentron canadum, ABG57072.1) IGF-I氨基酸同源性都达到了98%以上, 表明该片段是IGF-I基因的一部分。再用特异性引物IGF-I-3'F2扩增出190bp的cDNA片段, 测序后所得序列通过比对拼接得到了一条836bp的银鲳IGF-I cDNA序列(GenBank登录号: KT210886), 见图 1。再重新设计IGF-I_CDS-F和IGF-I_CDS-R克隆IGF-I全长序列, 以验证序列的可靠性, 结果发现与拼接结果一致, 证明了cDNA克隆是成功的。将银鲳IGF-I基因的cDNA命名为Pampus argenteusinsulin-like growth factor-I。

2.2 银鲳胰岛素样生长因子IGF-I序列特征分析

银鲳IGF-I基因cDNA序列以及推导的氨基酸序列见图 1。该cDNA全长836bp, 含有128bp的5'非编码区(UTR)、605bp的开放阅读框(ORF)和92bp的3'-非编码区(UTR), 编码了201个氨基酸。IGF-I前体肽预测的理论等电点(pI)为9.72, 分子质量经计算约为22.00 kDa。据SignalP 4.1Server分析, 该多肽含有一段59个氨基酸残基的信号肽序列, 成熟肽B区31个氨基酸, A区19个, C区10个, D区7个, E区75个。成熟肽存在CysB6, CysB18, CysA6, CysA7, CysA11及CysA20等6个半胱氨酸残基。

银鲳IGF-I基因ORF中功能位点分析发现, 含有6个蛋白激酶C磷酸化位点(protein kinase C phosphorylation site); 1个N-糖基化位点(N-glycosylation site); 1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(casein kinase Ⅱ phosphorylation site); 以及1个豆蔻酰化位点(N-myristoylation site) (图 2)。

2.3 不同物种IGF-I氨基酸序列同源性分析

利用ClustalW对银鲳IGF-I和其它20种脊椎动物IGF-I的编码氨基酸序列对比发现(图 3)。在不同物种中均存在6个保守的半胱氨酸(Cys)残基。由氨基酸序列同源性分析可见, 与11种鱼类IGF-I氨基酸同源性均在70.19%以上, 其中银鲳与河鲈(P. fluviatilis)的同源最高为91.40%;与鲈形目鱼类的同源性为83.52%-91.40%;与鲽形目牙鲆(Paralichthys lethostigma)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的同源性分别为90.86%、83.96%;与鲻形目鲻鱼(Mugil cephalus)的同源性为86.02%;鲑形目大西洋鲑鱼(Salmo salar)的同源性为81.82%;与鳗鲡目日本鳗鲡(Anguilla japonica)的同源性为73.75%;与鲤形目的同源性为70.19%-71.43%;各个功能区域间对比发现, B区和A区保守性较高, C区次之, 而D区和E区保守性较差(图 3)。

通过MEGA5.05软件, 对21个物种的IGF-I氨基酸进行了分子系统进化分析, 并在构建系统发生树基础上, 研究银鲳IGF-I和其它物种的进化关系, 见图 4。由图 4可知, 所有物种聚为两大亚群, 银鲳与硬骨鱼类聚为一大亚群, 即银鲳先与河鲈(P. fluviatilis)、牙鲆(P. lethostigma)、金头鲷(S. aurata)、点带石斑鱼(E. coioides)、鳜(S. chuatsi)、加州鲈(M. salmoides)、花鲈(L. japonicus)、鲻鱼(M. cephalus)聚为一支, 然后与红鳍笛鲷(L. erythropterus)、半滑舌鳎(C. semilaevis)、尼罗罗非鱼(O. niloticus)、大西洋鲑(S. salar)聚类, 最后与鲤鱼(C. carpio)、鲫鱼(Carassius auratus)和日本鳗鲡(A. japonica)聚为一个大的亚群; 另一个亚群中, 人(Homo sapiens)、野猪(Sus scrofa)、金仓鼠(Mesocricetus auratus)三种哺乳类先聚为一支, 再与鸟类原鸡(Gallus gallus)和爬行类中华鳖(Pelodiscus sinensis)聚为一大亚群。

通过进化关系图可见, 银鲳与同一鲈形目的河鲈(P. fluviatilis)、金头鲷(S. aurata)、点带石斑鱼(E. coioides)等亲缘关系最近; 与鲽形目和鲻形目亲缘关系较近; 与鲤形目和鳗鲡目等淡水鱼类较远, 与哺乳类、鸟类和爬行类的进化距离最远。

2.4 银鲳不同组织的IGF-I mRNA的表达

采用半定量RT-PCR和Quantitative Real-time PCR方法检测了IGF-I基因在银鲳肝脏、肌肉、肾脏等10个不同组织中的表达情况(图 5)。IGF-I基因在银鲳10个不同组织中均有表达, 尤其是在肝脏中表达量最高, 显著高于其它组织(P < 0.05, n=3), 其次为肾脏、心脏、肌肉、脑等, 在嗅球和胃中表达较低。

2.5 银鲳不同生长阶段肝脏IGF-I mRNA的表达

通过半定量RT-PCR和Quantitative Real-time PCR方法检测银鲳IGF-I基因在不同生长阶段的表达情况(图 6)。银鲳幼鱼在体重小于30 g时, IGF-I表达略有下降, 在体重30-50 g时显著性增高(P <0.05), 且达最高峰值, 约为体重1-30 g阶段表达量的2.5-5倍; 到体重50-100 g时表达量显著下降(P < 0.05), 仅为体重30-50 g时表达量的1/2;此后表达量趋于平稳, 维持在中等水平。

2.6 银鲳IGF-I原位杂交结果

实验组为DIG标记的反义RNA探针, 对照组为DIG标记的正义RNA探针, 同时用H.E染色作为对照组。从图 7可见, 肝细胞呈板状排列, 血窦在肝细胞索(肝板)之间, 肝细胞索的形状呈现弯曲、分支及吻合(图 7, A1, A2, C1, C2)。肝脏原位杂交结果显示, 地高辛标记的IGF-I反义RNA阳性杂交反应信号遍布于肝细胞中, 且杂交信号主要存在于细胞质中, 靠近细胞边缘处信号较强(图 7, A3, A4);正义探针对照组(图 7, B1, B2)没有检测到IGF-I mRNA的杂交阳性信号。

3 讨论 3.1 IGF-I mRNA序列分析

本文首次克隆得到了银鲳IGF-I cDNA全长序列, 与斜带石斑鱼(Pedroso et al, 2006)、鳜(刘俊等, 2011)、花鲈(钱焜等, 2014)的IGF-I前体蛋白结构相同, 银鲳的IGF-I前体蛋白也由信号肽、成熟肽和E肽三部分组成, 而成熟肽则由B, C, A, D四个结构域组成。与人和其它脊椎动物的IGF-I一样, 银鲳IGF-I的成熟肽含6个极端保守的半胱氨酸(Cys)残基, 其中2个位于B结构域, 另外4个位于A结构域, 其参与形成的二硫键对蛋白质的正常折叠、空间结构的维持及生理作用的发挥具有重要意义(Hober et al, 1992; Magee et al, 1999)。

由氨基酸序列同源性分析可见, 银鲳IGF-I与其它鱼类氨基酸同源性在70.19%以上, 与哺乳动物的同源性在44.62%以上, 可见IGF-I在进化过程中是一个演变过程较慢的蛋白分子, 可以成为鱼类分类中的一个重要参考标记; B区和A区同源性分别为89.66%-100%和90.48%-100%, 结构域保守性很高, 它们包含与IGF-IR和IGFBPs结合的序列(Zhang et al, 1994; Magee et al, 1999), 可能与IGF-I的功能维持相关; 而C区(50.00%-100%)、D区(37.50%-100%)和E区(25.68%-97.3%)在不同物种中存在一定差异。目前已发现的IGF-I存在着4种不同的剪接体(Cao et al, 1989; Shamblott et al, 1993; Hashimoto et al, 1997), 根据E肽氨基酸大概长度分别命名为含35个氨基酸的Ea-1型, 含47个氨基酸的Ea-2型, 含62个氨基酸的Ea-3型, 以及含74个氨基酸的Ea-4型。银鲳IGF-I E肽序列长为75个氨基酸, 属于Ea-4型。Duguay等(1992)报道大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)的心、脑、肾、脾及卵巢等组织中主要表达Ea-4型的IGF-I。同样, Chen等(1998)报道黑鲷(Acathopagrus schlegeli)的肝等组织也主要表达Ea-4型的IGF-I, 而Hashimoto等(1997)的研究表明鲤鱼(C. carpio)各组织主要表达Ea-2型的IGF-I。本研究得出的系统进化树基本反映了脊椎动物的系统分类关系, 与传统的形态学和生化特征分类基本一致。

3.2 IGF-I mRNA在不同组织中的表达分析

本章采用半定量RT-PCR和quantitative real-time PCR方法检测了IGF-I基因在银鲳肝脏、肌肉、肾脏等10种组织中的表达情况, 结果与日本白鲫(Carassius cuvieri)(陶敏等, 2012)完全相同, 均在肝脏组织中的表达量最高, 这是因为IGF-I绝大部分由肝合成(Sjögren et al, 1999)。大量研究表明, IGF-I在鱼体各组织的表达呈多样性。郁建锋等(2012)采用半定量RT-PCR方法以鳡(Elopichthys bambusa)β-actin基因为内参照, 检测了IGF-I基因mRNA在鳡的6个不同组织的表达情况, 发现IGF-I基因mRNA在肝脏中表达量最高, 心脏中未见其明显表达, 肾脏、肠、心脏和肌肉中的表达量较肝脏明显偏低; 钱焜等(2014)和胡健(2012)分别检测花鲈(L. japonicus)和大菱鲆(Scophthalmus maximus) IGF-I mRNA在不同组织的表达水平, 发现肝脏IGF-I的表达水平最高, 肌肉中表达量相对较高, 在肾脏中表达量偏低; Otteson等则报道了在金鱼(Carassius auratus)视网膜中发现了IGF-I的表达(Hitchcock et al, 2001)。大量研究表明, 肝脏IGF-I mRNA表达水平不但与物种、体重、年龄、营养条件, 环境温度还有盐度有关, 也与个体所处的生长阶段有关(Duan et al, 1998; Metón et al, 2000; Larsen et al, 2001; Gabillard et al, 2003)。研究表明IGF-I在肝外组织可以分别以自分泌和旁分泌方式作用于相应器官, 发挥特定的生理功能(Reinecke et al, 1998; Roith et al, 2001)。

3.3 IGF-I mRNA在不同生长阶段的表达分析

通过半定量RT-PCR和quantitative real-time PCR检测银鲳IGF-I基因在不同生长阶段的表达情况, 银鲳幼鱼在体重小于30 g前, IGF-I表达虽稍有降低, 但变化幅度不大。至体重30-50 g时表达量显著性增高(P < 0.05), 这与此时银鲳进入快速生长阶段完全相吻合, 夏末初秋水温在23-28 ℃范围, 正是银鲳最佳的生长期。随后因银鲳进入越冬期(体重50-100 g)生长减缓, IGF-I基因表达随之下跌过半, 翌年春天银鲳体重达到100-150 g, 由于性腺发育迅速, 生长反而受到影响, 故此时呈现IGF-I基因的表达量增幅不大的现象(Wen et al, 2002)。有关IGF-I调节鱼类生长发育的研究不多, Shamblott等(1993)检测虹鳟(Oncorhynchus mykiss)成鱼和幼鱼组织IGF-I mRNA的表达水平, 发现成鱼肝组织IGF-I mRNA水平约为幼鱼表达量的两倍; 而Duan等(1998)发现银大马哈鱼肝组织IGF-I mRNA水平随着年龄的增长而显著下降。

3.4 IGF-I基因在肝脏中的定位分析

IGF-I介导生长激素(GH)的功能, 对机体组织和个体发育有非常重要的作用, 关于IGF-I的原位杂交研究主要集中在脊椎动物的整体原位杂交和组织原位杂交(李艳梅, 2008; 郭斌, 2008; Patruno et al, 2008)。本研究用DIG标记的RNA探针检测到IGF-I mRNA在肝脏细胞的细胞质中有大量表达, 与Patruno等(2008)在肝脏中的表达结果相似。Patruno等(2008)采用经DIG标记的RNA探针和荧光原位杂交技术, 检测到花鲈孵化后第一周有较强的IGF-I mRNA表达, 在幼鱼和成鱼的肝脏中也有IGF-I mRNA大量表达; 但也有学者在肝脏中并未发现IGF-I基因的表达, 如郭斌(2008)运用DIG标记的RNA探针检测IGF-I mRNA在成体文昌鱼不同组织中的表达, 发现IGF-I mRNA只在肝盲囊和后肠中表达。