谷胱甘肽硫转移酶 (Glutathione S-transferases, 简称GST) 是一类由多基因编码的具有多种生理功能的同工酶, 在细胞内能催化谷胱甘肽的巯基 (-SH) 与疏水的异源物质结合, 使亲电子化合物转变形成亲水物质, 从而增加其可溶性, 有利于将异源物质排出细胞, 在生物解毒过程中起到至关重要的作用。GST广泛存在于哺乳动物、鸟类、昆虫、植物和各种微生物等生物体中。已发现的有活性的GST主要有三种类型 (Hayes et al, 2005), 其中前两类型分别存在于细胞质及线粒体中, 为可溶性的GST蛋白, 其家族成员和原核生物的GST蛋白有相似的立体结构, 认为它们有共同的起源。第三种类型是存在于微粒体中的MGST (microsomal glutathione S-transferases), 为膜结合蛋白, 在进化上不同于前者, 被认为是独立分化出来的一类蛋白 (Bresell et al, 2005)。目前, 在模式植物拟南芥的基因组中共发现55个GST基因, 其中54个属于细胞质或线粒体型的可溶性蛋白, 只有1个微粒体GST基因, 但在其它物种中也可能含有多个微粒体GST基因 (Edwards et al, 2005)。

微粒体GST成员组成了MAPEG (membrane associated proteins in eicosanoid and glutathione metabolism) 超基因家族, 该家族成员主要参与花生四烯酸及谷胱甘肽的生物代谢过程 (Jakobsson et al, 1999a)。人类的MAPEG家族共分为三个组, 包括六个成员。第一组含有5-脂肪氧合酶激活蛋白 (5-lipoxygenase activating protein, FLAP) 和白三烯C4合酶 (leukotriene C4 synthase, LTC4)2个成员, 主要参与白三烯的生物合成 (Jakobsson et al, 1996); 第二组含前列腺素E合酶 (prostaglandin E synthase, PGES), 主要催化前列腺素E的合成 (Jakobsson et al, 1999b); 第三组包含MGST1、MGST2和MGST3, 具有谷胱甘肽转移酶及过氧化物酶活性 (Jakobsson et al, 1997; Xu et al, 2015)。

目前已经分离、纯化得到的三类MGST在结构、蛋白质分子性质、生物学功能等方面都有一定的区别 (Lee et al, 1999), 其中人类的MGST1和PGES在蛋白质序列上有38%的相似性, 形成共同的分支, 但在功能上相差很大 (Thorén et al, 2003)。同样, MGST2与FLAP和LTC4合成酶在氨基酸序列上有更近的相似关系, 而MGST3形成另外单独的分支 (Bresell et al, 2005)。MGST各成员的分子质量一般较小, 大约为17KDa, 正常情况下MGST会形成同源三聚体, 三聚体的每个亚基相互依存, 都含有一个半胱氨酸残基, 通过疏基烷化剂, 疏基/二硫键交换, 蛋白水解, 热激活以及氧化应激等方式激活后, 参与并加速毒性物质的代谢 (Jakobsson et al, 1996)。MGST是生物体内重要的解毒酶系之一, 对重金属等环境污染反应灵敏, 具有降解毒物及抗氧化等作用, 也常被作为水体污染的指示分子之一 (Guo et al, 2014)。

本研究采用RACE技术, 从条斑紫菜的丝状体中克隆获得微粒体GST (PyMGST3) 的cDNA全长序列, 分析了在重金属胁迫下该基因的表达水平。尝试将PyMGST3进行原核表达后, 验证其生物学活性和功能, 为条斑紫菜抵抗重金属毒害作用机理的研究提供实验和理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

条斑紫菜 (Pyropia yezoensis) 丝状体由辽宁省植物生物工程重点实验室藻类培养室保存, 实验前接种到PES培养液中, 置于环境温度为18℃, 光强为50μmol/(m²∙s), 光周期为14:10h的条件下扩大培养。

以PES培养液作为对照, 在PES培养液中分别添加CdCl₂及CuSO₄溶液, 使培养液中的Cd²⁺及Cu²⁺的终浓度分别达到0.5mg/L及1mg/L, 将扩大培养后的条斑紫菜的丝状体分别接种到PES培养液及含有Cd²⁺及Cu²⁺的培养液中, 分别培养1、2、4、8、12 h后取样, 每个处理做三次重复。

1.2 条斑紫菜总RNA提取及cDNA合成

采用RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue试剂盒 (TaKaRa, 大连) 进行条斑紫菜总RNA的提取, 提取过程完全参照说明书进行; 总RNA用DNaseⅠ(TaKaRa, 大连) 去除剩余的基因组DNA后, 采用Nanodrop 2000C核酸蛋白检测仪和1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA浓度及完整性; cDNA合成采用PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, 大连) 试剂盒, 按照使用说明书进行操作, 反转录后合成的cDNA保存在–20℃作为基因克隆和实时定量PCR的模板备用。

1.3 PyMGST3基因全长cDNA的克隆及测序

在NCBI的EST数据库中 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/) 搜索条斑紫菜GST基因EST序列, 将搜索结果下载存盘后, 采用Sequencher软件进行序列拼接, 获得较长的拼接EST序列, 利用NCBI的CD-search程序 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 验证该拼接片段编码的氨基酸序列是否含有GST基因编码的功能域。以含有GST功能域的cDNA序列为模板, 设计合成正反向引物PyMGST3-F及PyMGST3-R (见表 1) 进行PCR扩增。回收PCR产物进行克隆和测序。

以获得的片段为模板, 设计合成5'和3'端的outer和inner特异性引物 (见表 1), 采用Clontech公司的SMARTer^TM RACE 5'/3'Kit试剂盒, 按试剂盒的操作指南进行实验。PCR扩增获得该基因的5'及3'端的cDNA片段, 扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分离, 切胶回收目的片段, 克隆后送上海生工生物工程有限公司测序。

1.4 PyMGST3基因的序列分析

将测序获得的GST基因序列拼接后, 提交到NCBI。采用ORF Finder程序在线分析开放阅读框; 同时采用SignalP 3.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/、TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/) 软件分别进行蛋白质的信号肽、跨膜结构域和氨基酸疏水区域的分析; 利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 的Blast P程序进行相似蛋白查找, 并采用Clustal X软件对预测的氨基酸序列进行多序列比对; 采用SWISS-MODEL工作平台 (http://swissmodel.expasy.org/) 预测PyMGST3蛋白的三级结构域。

1.5 PyMGST3基因在重金属胁迫下的表达分析

根据PyMGST3基因测序结果设计荧光定量PCR引物qPyMGST3-F和qPyMGST3-R (见表 1) 扩增产物长度为142bp, 以β-actin (Accession No. AB292772.1) 为内参, 扩增产物长度为135bp。采用RT-PCR法, 分析Cd²⁺和Cu²⁺胁迫下PyMGST3基因的表达水平。反应在TaKaRa TP800 PCR仪上进行, 采用两步法进行扩增, 即95℃预变性1min, 95℃变性10s, 60℃延伸45s, 共40个循环, 设置阴性对照和无模板对照, 每个反应设置3个重复。PyMGST的相对表达量分析采用ΔΔCt的方法进行。

1.6 PyMGST3基因的原核表达及酶活性分析

将PyMGST3基因的5'端及3'端分别引入BamH I及Sal I酶切位点, 插入到pET-28a表达载体的多克隆位点中, 构建pET-28a/PyMGST3原核表达载体, 将其与空载体pET-28a分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3), 选取阳性克隆提取质粒DNA进行酶切和测序验证。将验证后的阳性转化菌株分别在LB培养基中过夜培养, 然后按1:50的比例转接到50mL的LB液体培养基中, 培养至OD₆₀₀约为0.6左右, 加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导4h后收集菌体, 进行SDS-PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况。

酶活性分析采用谷胱甘肽S-转移酶测定试剂盒KGT005(凯基生物, 南京) 进行, 具体操作完全按照说明书进行。

1.7 PyMGST3基因转化菌对重金属胁迫的耐受力分析

分别挑取重组菌 (转pET-28a/PyMGST3) 和对照菌 (转pET-28a空载体) 的单菌落, 在含有60μg/ mLAmp的新鲜LB培养液中37℃培养过夜, 按1:100的比例将培养好的菌液 (OD600值为1.0左右) 转至50mL新鲜LB培养液中扩大培养2h (至OD₆₀₀值为0.5左右), 然后加入IPTG至终浓度为1mmol/L, 同时在培养体系中分别加入终浓度为400μmol/L CdCl₂和200μmol/L的CuSO₄继续培养, 每隔1h取样测定OD₆₀₀值, 连续测定12h, 并绘制生长曲线。每个处理设3次重复, 未加入CdCl₂和CuSO₄的菌液同时培养作为对照组。

2 结果与分析 2.1 条斑紫菜PyMGST3基因的全长cDNA序列

以PyMGST3-F和PyMGST3-R为上下游引物, 以条斑紫菜的cDNA为模板进行PCR扩增, 获得了大小440bp左右的片段。在5'及3'RACE的扩增中, 分别得到172bp和375bp的片段。采用Sequencher软件将三个DNA片段拼接后得到全长为681bp的序列。将此序列提交NCBI, 运用ORF Finder程序预测开放阅读框。结果显示PyMGST3基因具有一个417bp的开放阅读框, 起始密码子ATG, 终止密码子为TGA, 编码138个氨基酸, 分子量为15.3KDa, 5'端非翻译区长度为80bp, 3'端非翻译区长度为184bp。条斑紫菜GST基因cDNA序列及其所推测的氨基酸序列如图 1所示。已经将序列提交到GenBank中, Accession Number为KX447713。

2.2 PyMGST3蛋白的跨膜结构域、疏水区域、信号肽及三级结构预测

PyMGST3作为膜结合蛋白, 一般具有一个以上的跨膜结构域, TMHMM 2.0 Server分析的结果如图 2a所示, PyMGST3蛋白存在3个跨膜结构域, 第一个跨膜区域在第10—30氨基酸处, 第二个跨膜区域在第74—96氨基酸处, 第三个跨膜区域在115—133氨基酸处。另外, 位于1—9及97—114区域内的氨基酸位于膜外侧, 位于31—73区域内的氨基酸位于膜内侧。

跨膜结构域的疏水跨膜区一般由20个左右的疏水性氨基酸残基组成, ProtScale在线分析PyMGST3蛋白的疏水区的结果如图 2b所示, PyMGST3蛋白具有3个明显的疏水区域, 与推测形成跨膜结构的氨基酸位置一致, 这也和跨膜结构域的预测结果相互印证。

SignalP 3.0 Server对PyMGST3蛋白的信号肽分析的结果表明, 在第36与37位氨基酸之间可能存在信号肽剪切位点 (图 2c), 最大切割位点概率为0.766, 可以推测PyMGST3蛋白的N端1—36个氨基酸可能为信号肽序列。PyMGST3蛋白一般定位于微粒体, 其N-端含有36个氨基酸作为跨膜信号, 在引导膜蛋白跨膜时, 由于疏水跨膜区的存在可以使膜蛋白停留在细胞膜中。

PyMGST3蛋白的三级结构预测在SWISS-MODEL平台上在线完成, 根据序列相似性共发现了26个模板, 我们选择了与PyMGST3序列相似性最高的Leukotriene C4 synthase (模板号为4jrz.1.A) 作为模板来模拟PyMGST3蛋白的三级结构 (图 2d), 其中GMQE (global model quality estimation) 值为0.61, 也说明了预测的三级结构相对准确。

2.3 PyMGST3蛋白的多序列比对

将条斑紫菜PyMGST3基因编码区推测的氨基酸序列提交到NCBI中采用Blast P程序进行相似性搜索。结果表明, 与该序列相似性高的其它物种GST均为MGST3家族成员。选择了6个相似性较高的其它藻类的MGST蛋白, 用ClustalX进行多序列比对分析。结果如图 3所示, 在所选取的序列中, 与PyMGST3蛋白相似性最高的是皱波角叉菜 (Chondrus crispus), 序列的相似性为60%, 其次为衣藻相似性为39%, 与其它藻类的相似性在25%—35%之间, 与细小微胞藻的相似性最低为25%。

2.4 PyMGST3基因在Cd²⁺和Cu²⁺胁迫条件下的表达变化

采用实时荧光定量PCR方法, 检测了条斑紫菜丝状体的PyMGST3基因在Cd²⁺和Cu²⁺胁迫下的转录水平变化。结果表明:在0.5mg/LCd²⁺(图 4a) 的条件下, PyMGST3基因的表达逐步上升, 4h表达量为对照组的3倍, 8h表达量最高, 是对照表达量的7倍, 随后下降。在1mg/LCu²⁺(图 4b) 的处理下, PyMGST3基因的表达变化趋势与0.5mg/LCd²⁺处理的表达变化类似, 不同的是在处理1h后, PyMGST3基因的表达量变化就已经是对照组的2倍以上, 8h时表达量达到最高, 是对照表达量的6倍, 随后下降。

2.5 纯化后的PyMGST3蛋白具有谷胱甘肽S-转移酶活性

含有表达载体pET-28a/PyMGST3的E. coli BL21(DE3) 菌株经IPTG诱导表达4h后, 分别取表达产物进行SDS-PAGE检测 (图 5)。结果表明, 与未诱导的对照组 (图 5中的2泳道) 比对, IPTG诱导的重组菌在20KDa左右出现一条特异的条带 (图 5中的3、4泳道), 在大约21KDa处成功表达了带有His标签的融合蛋白, 与预测的PyMGST3蛋白相对分子质量15.3KDa的结果相一致。

SDS-PAGE电泳后, 将PyMGST3蛋白进行纯化, 用试剂盒进行谷胱甘肽S-转移酶活性的测定, 结果显示, 酶活性为0.17μmol/(min·mg)。

2.6 PyMGST3基因过表达提高了重组菌株的重金属耐受性

用较高浓度的Cd²⁺和Cu²⁺两种重金属离子处理pET-28a/PyMGST3重组菌和pET-28a空载体对照菌, 探索pET-28a/PyMGST3重组菌对这两种重金属离子的耐受能力。结果表明, 培养液中不添加重金属时, 重组菌和对照菌的生长情况基本一致 (图 6a)。在加入400μmol/LCd²⁺和200μmol/LCu²⁺后, 重组菌对两种重金属胁迫响应的生长曲线基本相似。但与对照菌相比, 二者的生长出现了明显的差异, 如图 6b所示, 在IPTG诱导后的前1h内, 重组菌和对照菌生长差异不显著, 1h后, 重组菌生长速度明显高于对照菌 (P < 0.01), 差异极显著。在处理8h和9h后, 重组菌生长进入平台期, 随后生长速度缓慢下降, 对照菌在6h左右进入平台期, 生长速度开始下降, 且下降幅度更大。

3 讨论

活性GST是一种多功能酶, 主要存在细胞质、线粒体及微粒体中, 其中胞质GST的种类最多, 也是研究得最为深入的一类GST。动物细胞的胞质GST分为Alpha、Mu、Pi、Omega、和Sigma等类型, 植物细胞的胞质GST分为Lambda、Phi、Zeta、Theta、Tau和DHAR等类型, 其中Tau和Phi是植物特有的两种类型 (Hu et al, 2016)。本文通过RACE技术, 克隆得到条斑紫菜的PyMGST3基因的全长cDNA序列, 经过序列的比对分析, 并结合蛋白质的跨膜结构域及疏水性等的分析, 表明我们分离到的条斑紫菜的GST基因为一种新型的微粒体GST基因, 与其它物种的MGST3蛋白相似性很高, 因此命名该基因为PyMGST3, 有关条斑紫菜的微粒体GST3基因的序列及功能研究还未见报道。先前的研究表明, 哺乳动物及高等绿色植物中的MGST3基因的保守结构域的模式为F-N-C-[AIV]-Q-R-[AGS]-H-[AQ]-[NQ]-x (2)-E-x (2, 3)-P, 本文克隆得到的PyMGST3蛋白也具有相似的保守结构域, 但是第二及第三位的氨基酸“N”及“C”分别被“D”及“L”所取代, 以及最后一位的“P”被“W”所取代。同样的氨基酸替代现象也在微小原甲藻 (Prorocentrum minimum) 的PmMGST3序列中发现, 如第三位的“C”被“S”所替代。因此, MGST3基因保守结构域的模式应改写为F-[DN]-[CSL]-[AIV]-Q-R-[AGS]-H-[AQ]-[NQ]-x (2)-E-x (2, 3)-[PW]。

海洋生物暴露在Cd²⁺等重金属的胁迫下, 可诱导机体产生大量的诸如H₂O₂、O₂^–等活性氧自由基, 引起生物体的氧化损伤, 机体抗氧化防御系统作为活性氧自由基平衡的重要调节体系, 在减轻或解除重金属等引起的氧化胁迫中扮演着重要角色, 也常被作为监测海洋重金属污染物的候选生物标记 (陈晓聪等, 2015; Tiwari et al, 2016)。GST作为机体抗氧化防御系统的第二阶段的解毒酶一般是通过两种方式来进行污染物的解毒:一是催化还原型谷胱甘肽直接与重金属离子共价结合, 从而降低重金属离子毒性并促进重金属向液泡或质外体转运; 二是GST的过氧化物酶活性能利用还原型谷胱甘肽向氢过氧化物发动亲核攻击, 使其还原为低毒的一元醇, 从而缓解重金属胁迫产生的氧化胁迫 (Li et al, 2017)。作为抗氧化酶GST家族成员之一, MGST的主要作用也是清除氧化胁迫过程中产生的有毒物质 (Hayes et al, 2005), 且MGST多以脂溶性的亲电子化合物为底物, 比可溶性GST更易于与底物结合。此外, 凡由P-450氧化酶催化的外源性化合物都可以直接由MGST排出体外, 而可溶性GST的催化作用需要亲电子基团通过微粒体膜到胞浆才能得以实现 (Regoli et al, 2014; 郑英等, 2003), 因此, 微粒体GST相比之下可能比胞质GST去除污染物的效率更高。研究发现, 重金属胁迫下的GST基因均呈现先上升后下降的“毒物兴奋效应”的表达模式 (顾海龙等, 2013), 但不同物种中的GST家族的不同成员对于不同的氧化胁迫都有各自不同的表达模式 (Guo et al, 2014)。在本研究中, 实时荧光定量表达分析发现, Cd²⁺和Cu²⁺胁迫均能使条斑紫菜丝状体的PyMGST3基因表达水平在短时间内升高 (Cd²⁺4h, Cu²⁺1h), 且随时间的延长表达量增加, 随后下降 (Cd²⁺12h, Cu²⁺12h), 说明PyMGST3基因很可能在参与清除Cd²⁺和Cu²⁺胁迫所产生的氧化胁迫中起作用。另外, 周向红等人 (2011)用不同浓度铅处理条斑紫菜叶状体时, 发现胞质PyGST基因的转录表达也与PyMGST3基因呈现相似的结果, 推测MGST和可溶性GST协同作用来清除重金属离子等的毒害, 相信在进一步确定其调控位点后, 将为利用该基因提高藻类抵抗重金属污染的分子机制奠定基础。基于条斑紫菜PyMGST3基因对Cd²⁺和Cu²⁺的敏感性, 可以考虑将其作为环境污染指示分子之一用于环境污染的评估和监测。

GST具有催化还原型谷胱甘肽 (GSH) 与1-氯-2, 4-二硝基苯 (CDNB) 结合的能力, 在本研究中通过在大肠杆菌中表达并纯化的紫菜PyMGST蛋白的具有GST活性, 能催化GSH与CDNB的结合, 也说明了PyMGST是一个功能酶。另外, PyMGST3的重组菌株对Cd²⁺和Cu²⁺胁迫的耐受性都显著高于对照菌, 表明由于外源PyMGST3基因的诱导表达, 降低或解除了重金属离子Cd²⁺和Cu²⁺对重组菌的毒性, 使其表现出更强的重金属离子耐受能力。越来越多的研究结果表明, 超表达GST基因会增加生物体对抗重金属胁迫的能力, 如超表达水稻GST基因提高了转基因水稻抗Cd²⁺的能力 (Zhao et al, 2009)。近年来, 随着重金属对土壤及水域污染的逐渐加重, 尝试通过超表达及异位表达氧化胁迫相关基因, 如GST及过氧化氢酶 (Catalase, CAT) 等方法来增加植物体对重金属的吸收, 获得了抗重金属的转基因植物来增加对重金属离子的吸收, 以期通过生物修复的方法来减轻重金属的伤害, 但在研究中也发现在植物体获得重金属抗性的同时也会造成重金属在植物体内的大量积累, 使其应用受到了很大的限制。但最近的报道表明, 在烟草中 (Nicotiana tabacum) 超表达绿木霉 (Trichoderma virens) GST基因, 在使烟草获得了较强重金属抗性的同时, 没有增加重金属的富集 (Dixit et al, 2012)。这为利用GST基因来培育即抗重金属胁迫又没有富集的新品种提供了理论支持。

4 结论

MGST是存在于除古细菌以外的所有原核及真核生物中的高度保守的基因, 本研究从条斑紫菜的丝状体中首次克隆得到PyMGST3基因, 该基因隶属于MAPEG超基因家族, 其编码蛋白与其他物种MGST3蛋白含有相似的结构域, 具有谷胱甘肽S-转移酶活性。在Cd²⁺和Cu²⁺等重金属离子存在的环境中, PyMGST基因上调表达, 减轻由重金属离子产生的氧化胁迫, 保护细胞免受伤害。MGST在藻类及高等植物中除了参与抗氧化胁迫等生物代谢以外, 其他生物学功能的研究还有待于进一步深入。