LECT2 (leukocyte cell-derived chemotaxin 2) 为白细胞源趋化因子, 分子量为16kDa, 含三个分子内二硫键, 以持续性方式在肝中特异表达, 随后分泌到血液中(Yamagoe et al, 1996)。哺乳动物研究表明, LECT2是一种多功能的细胞因子, 它与肿瘤发生、肝损伤、脓毒血症、肾淀粉样病变及造血干细胞动员等生理病理过程紧密相关(Saito et al, 2004; Lu et al, 2013a; Lan et al, 2014; Lu et al, 2016)。据报道, LECT2在鱼类中广泛存在, 多种水产经济鱼类如鲤鱼(Fujiki et al, 2000)、虹鳟(Kokkinos et al, 2005)、大黄鱼(Li et al, 2008)和香鱼(Chen et al, 2010)等中均有鉴定报道。鱼类LECT2基因表达与病原菌感染紧密相关(Lin et al, 2007; Li et al, 2008; 施晓峰等, 2010; Chen et al, 2010; Wei et al, 2011), 揭示LECT2可能在鱼类抗菌免疫反应中具有重要的作用。我们的研究表明, 重组香鱼LECT2成熟肽(rPaLECT2m)能体外趋化香鱼头肾来源的单核巨噬细胞(monocytes/macrophages, MO/MΦ), 诱导白介素1β (interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNFα)、白介素10 (interleukin-10, IL-10) 和粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)等细胞因子及模式识别受体(pattern recognization receptor, PRR)等基因表达, 增强MO/MΦ吞噬和杀菌能力(Zhang et al, 2011; Lu et al, 2013b)。随后, 我们对鳗弧菌感染的香鱼进行腹腔注射rPaLECT2m处理, 发现感病香鱼的存活率提高、组织载菌量减少、组织病理损伤减轻, 去除MO/MΦ后, 这种促病情改善的作用被抑制, 揭示鱼类中LECT2增强机体免疫能力的作用是通过MO/MΦ介导的(Chen et al, 2014b)。

MO/MΦ能表达多种PRRs, 如Toll样受体(toll like receptor, TLR)及多类C型凝集素受体(C-type lectin receptor, CLR), 这些PRRs介导MO/MΦ识别微生物表面保守但不存在于宿主中的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP), 通过下游的信号途径, 调节各种免疫反应基因的表达从而清除病原体(Kerrigan et al, 2009)。CLR家族成员拥有一个或多个糖基识别结构域(carbohydrate-recognition domains, CRDs), 介导对病原的黏附、摄取和杀灭, 调控免疫反应(Kerrigan et al, 2009)。近年来, 鱼类CLRs基因的研究日益受到重视, 一些同源基因已被克隆和研究(Soanes et al, 2004; Lin et al, 2009; Ao et al, 2015; Yang et al, 2015; Zhang et al, 2015; Chen et al, 2016)。我们采用酵母双杂交和免疫共沉淀方法, 鉴定PaLECT2能与一种香鱼CLR (PaCLR)相互作用(Chen et al, 2010); 进一步研究揭示, PaLECT2可通过PaCLR受体介导激活静息状态下的香鱼MO/MΦ (Ma et al, 2016)。然而, 病理状态下PaLECT2/PaCLR途径是否发挥作用尚不得而知。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要组成部分, 可作为单核巨噬细胞的一种有效的激活剂(Swain et al, 2008), 本研究拟采用LPS刺激静息态香鱼MO/MΦ模拟病理状态, 阐明PaCLR是否介导PaLECT2激活病理状态下的MO/ MΦ, 揭示LECT2在鱼类炎症反应中的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验材料与试剂

健康香鱼(Plecoglossus altivelis) (40—50g)购自浙江省宁波市宁海县凫溪香鱼养殖基地, 大小均匀, 体表无伤。实验进行之前在实验室条件下(水温20±1 C, 保证溶氧量适宜及水质清洁无菌)暂养2周。引物由上海英俊生物有限公司合成; 总RNA抽提试剂RNAiso和SYBR Premix Ex Taq试剂盒均购自TaKaRa公司; 二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG)购自碧云天生物技术研究所; Ficoll购自GE公司; LPS (Escherichia coli 055: B5) 和荧光素FITC购自美国Sigma。细胞培养基RPMI 1640购自上海英俊生物有限公司。胎牛血清(FBS)、硫酸链霉素和青霉素均购自美国Gibco公司。

1.2 rPaLECT2m蛋白和PaCLR抗体制备

rPaLECT2m的制备及纯化方法参照文献(Zhang et al, 2011)。PaCLR抗体(anti-PaCLR)制备方法参照文献(Ma et al, 2016)。

1.3 香鱼头肾MO/MΦ的分离与培养

香鱼头肾MO/MΦ的分离和培养参照文献(Chen et al, 2014b)。简述如下:香鱼麻醉后尾静脉取血后取头肾。用细胞洗脱培养基Ⅰ将香鱼头肾用100μm孔径筛网研磨过滤。滤液(1:2) 铺在Ficoll表面, 2000r/min水平离心25min。吸取中间白膜层, 用细胞洗脱培养基Ⅰ重悬, 2000r/min水平离心8min。沉淀用上述的培养基Ⅱ洗一次, 1000r/min离心5min。显微镜下血球计数板计数, 最后细胞稀释至2×10⁷/mL, 平铺于35mm细胞培养皿。24 C过夜培养后将培养液换成完全培养基, 用于后续实验。

1.4 实时定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)检测香鱼MO/MФ细胞因子表达

采用qPCR检测香鱼MO/MФ中TNFα、IL-1β、IL-10和粒细胞集落刺激因子G-CSF的表达变化, 以18S rRNA为内参(Ma et al, 2016)。以10μg/mL的LPS处理香鱼MO/MФ 30min之后用PBS洗涤去除, 然后用200μg/mL anti-PaCLR封闭40min, isoIgG作为对照; 随后加入rPaLECT2m (2.5μg/mL)孵育3.5h, PBS组为对照, 收集细胞并提取总RNA合成cDNA。TNFα, IL-1β, IL-10和G-CSF的扩增引物见文献(Chen et al, 2014b; Ma et al, 2016)。qPCR程序为: 94 C 180s(预变性); 94 C 30s, 60 C 30s, 72 C 30s(扩增段, 40个循环); 94 C 30s, 72 C 60s, 95 C 30s(熔解段)。每个样品重复四次, 使用2^–ΔΔCT方法计算在不同样品基因的相对表达水平。

1.5 流式细胞术检测香鱼MO/MΦ吞噬作用

香鱼MO/MΦ吞噬实验参考文献(Ma et al, 2016)。简述如下:香鱼MO/MΦ LPS处理、anti-PaCLR封闭和PaLECT2m孵育如1.4。收集对数生长期大肠杆菌DH5α并用异硫氰酸荧光素(FITC)对其进行标记(记作E. coli-FITC)。之后(MOI=10) 加入E. coli-FITC处理30min。PBS洗涤3次, 用0.4%台盼蓝使粘附到细胞表面的荧光猝灭。流式细胞仪(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)对吞噬作用进行检测, 图像分析采用FlowJo软件。相对平均荧光强度(MFI)=处理组MFI /无细菌组MFI, 以PBS组相对MFI为100%。

1.6 平板计数法评估香鱼MO/MΦ杀菌能力

采用平板计数法评估香鱼MO/MΦ对细菌的吞噬活性。LPS处理香鱼MO/MΦ、anti-PaCLR封闭和PaLECT2m孵育如1.3。将大肠杆菌(MOI=10) 添加至香鱼MO/MΦ, 24 C培养30min。非内化的大肠杆菌用无菌PBS洗涤除去。吞噬组用1% Triton X-100溶液裂解后涂布于LB琼脂培养基。杀菌组继续培养1.5h, 然后再裂解涂布于LB琼脂培养基, 平皿置于37 C培养18h后, 进行菌落计数。细菌存活率=杀菌组/吞噬组×100%表示, 实验重复3次。

1.7 数据分析

数据以平均值±SD表示, 数据显著性分析采用SPSS 13.0软件one-way ANOVA方法进行分析, P < 0.05为显著差异。

2 结果 2.1 抗体封闭PaCLR对rPaLECT2m激活LPS刺激的香鱼MO/MΦ细胞因子表达的影响

与PBS处理组相比, 香鱼MO/MΦ经LPS刺激后, IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF基因mRNA表达上调倍数分别为12、15、1.9和5.8, 而LPS+ rPaLECT2m处理后IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF基因mRNA表达水平分别上调约为PBS处理组的350、160、12和38;用anti-PaCLR封闭细胞上的PaCLR后, LPS+rPaLECT2m再处理香鱼MO/MΦ, 其IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF基因mRNA表达上调约为PBS处理组的75、31、3.1和9.2(图 1)。

2.2 抗体封闭PaCLR对rPaLECT2m激活LPS刺激的香鱼MO/MΦ吞噬能力的影响

与PBS处理组相比, LPS处理和LPS+anti-PaCLR处理对香鱼MO/MΦ吞噬能力均无显著影响(图 2A)。与PBS处理组相比, LPS+rPaLECT2m处理显著增强香鱼MO/MΦ吞噬E.coli-FITC的能力, 其相对MFI约为PBS处理组增加了88.9%(图 2B); 用抗体封闭PaCLR后, LPS+rPaLECT2m再处理香鱼MO/MΦ, 吞噬E.coli-FITC的能力相对于PaCLR未封闭组下降了约35.6%(图 2C, 图 2D)。

2.3 抗体封闭PaCLR对rPaLECT2m激活LPS刺激的香鱼MO/MΦ杀菌能力的影响

实验分为5组, 其中PBS处理组、LPS处理组, LPS+anti-PaCLR处理组, LPS+rPaLECT2处理组和LPS+anti-PaCLR+rPaLECT2m处理组细菌存活率分别为34.0%±2.9%, 32.9%±1.5%, 36.5%±3.6%, 16.5%±2.6%和27.9%±2.9%(图 3)。与LPS处理组相比, 抗体封闭PaCLR对LPS刺激的香鱼MO/MΦ杀菌能力无显著性影响; 与LPS处理组相比, LPS+ rPaLECT2m处理显著增强了香鱼MO/MΦ的杀菌能力, 然而抗体封闭PaCLR后, rPaLECT2m对LPS刺激的香鱼MO/MΦ杀菌能力的增强效应被显著抑制。

3 讨论

LECT2是一个新近鉴定的多功能细胞因子, 它可作用于鱼类MO/MΦ, 趋化静息态的MO/MΦ, 增强其细胞因子表达、吞噬和杀菌能力(Zhang et al, 2011; Lu et al, 2013b; Ma et al, 2016)。PaCLR是PaLECT2在香鱼MO/MΦ上的受体, 并介导PaLECT2激活静息态MO/MΦ (Chen et al, 2010; Ma et al, 2016)。然而, 由于病理条件下MO/MΦ的状态往往与静息态时不同, 因此有必要针对病理状态开展研究。LPS是革兰阴性菌的胞壁主要组成成分, 在革兰氏阴性菌感染的发病机理中起着十分重要的作用(Swain et al, 2008), 前人研究表明, LPS刺激能导致免疫细胞发生形态、功能和胞内基因表达等的变化, 合成并释放一系列炎症介质, 参与机体的炎症级联反应, 从而引起感染性休克、器官损伤和系统性炎症反应综合症等(Morris et al, 2015)。本文采用LPS刺激来模拟病理状况, 研究PaCLR是否介导rPaLECT2激活LPS刺激的香鱼MO/MΦ。

小鼠中的研究表明, LECT2处理静息态小鼠MΦ后, C3、G-CSF、IFNγ、IL-10、CXCL-10、IL-1β和TNFα等基因mRNA表达均上调; 与之相比, LECT2处理LPS刺激的小鼠MΦ后, 上述基因mRNA表达水平进一步增加2—40倍不等(Lu et al, 2013a), 揭示小鼠LECT2在病理条件下能激活MΦ中多种重要免疫相关基因的表达。鱼类中研究发现, rPaLECT2m处理上调静息态香鱼MO/MΦ细胞因子IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF基因mRNA的表达, 增强MO/MΦ吞噬和杀菌能力(Zhang et al, 2011; Lu et al, 2013b; Ma et al, 2016)。本研究中, 我们发现rPaLECT2m处理LPS刺激的香鱼MO/MΦ后, IL-1β、TNFα、IL-10和G-CSF等基因mRNA表达分别为rPaLECT2m处理的静息态MO/MΦ中的1.60、1.77、1.58和1.38倍, 和小鼠中报道的变化趋势一致, 揭示, rPaLECT2处理可能也不抑制香鱼极早期的炎性反应。

新近研究表明, 哺乳动物中LECT2的受体有两个, 分别为CD209a和c-Met, 其中CD209a介导LECT2激活在小鼠MΦ, 增强保护性免疫(Lu et al, 2013a; Chen et al, 2014a)。鱼类中, PaCLR被鉴定为PaLECT2在香鱼MO/MΦ上的一个受体, 它的结构和小鼠CD209a有一定相似性(Chen et al, 2010), 它能介导LECT2激活静息态香鱼MO/MΦ功能(Ma et al, 2016)。本研究表明, 抗体封闭PaCLR后, rPaLECT2m对LPS处理的香鱼MO/MΦ细胞因子表达、吞噬和杀菌能力增强效应显著受到抑制, 揭示PaCLR介导PaLECT2对病理条件下的香鱼MO/MΦ功能。

4 结论

综上所述, rPaLECT2m激活LPS刺激香鱼MO/MΦ细胞因子表达、吞噬和杀菌功能。抗体封闭PaCLR后显著抑制上述作用, 因此, 无论在静息状态还是LPS刺激作用下PaCLR都介导了PaLECT2激活香鱼MO/MΦ功能。