争胜行为是同种动物个体相遇争斗的行为, 是一种典型的社会行为, 普遍存在于鱼类、甲壳类等水生动物中(李玉全等, 2013b)。对虾争胜行为的研究对丰富甲壳类行为学研究、合理调控对虾工厂化养殖密度具有十分重要的作用。目前, 有关对虾争胜行为的研究甚少, 仅限于生存因子、饵料、养殖密度等方面(张沛东等, 2008; 秦浩等, 2014; 李玉全, 2014; 赵玉超等, 2016), 但探究其调控机理的研究尚未见报道。生物胺(BA)广泛分布于甲壳动物的中枢神经系统和外周器官内, 可作为神经递质或激素传递各种信息, 主要参与甲壳动物体色变化, 运动、渗透调节、行为、神经内分泌调节, 是调节动物行为的一种重要物质, 目前有关于生物胺对对虾争胜行为影响的研究甚少。

多巴胺(DA)是生物胺的一种, 具有促性腺激素释放抑制因子的作用(孙迪等, 2011), 也能影响个体的运动、行为。有研究发现, 通过注射一定剂量的多巴胺, 可以改变对虾的一些生理特性(Cheng et al, 2005, 2006)。Chen等(2005)推测DA可能参与病理性的攻击行为及其他异常行为; DA的合成、降解、受体以及转运等有关过程都可能影响个体的行为(Comings et al, 2000)。5-羟色胺(5-HT)又名血清素, 属生物胺中的抑制性神经递质, 常作为神经递质或神经调质或激素物质调控许多重要的生理功能, 广泛分布在甲壳动物中枢和外周神经组织中(Sloley et al, 1995), 参与多种行为, 如睡眠、饮食、记忆和攻击性等。在无脊椎动物中, 5-HT在认知、摄食、定位、生理节律和防御行为的反应方面起重要作用(Fingerman, 1997a, b)。Fingerman等(1977)研究发现, 5-HT和多巴胺在多种机制中证明具有相反的效应。5-HT是影响攻击行为的最主要的神经递质(Lesch et al, 2000; Miczek et al, 2005; Bortolato et al, 2013), 其他的神经递质可能是先通过影响5-HT进而影响攻击行为(孔雀等, 2006)。本研究以日本囊对虾(Penaeus japonicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)为实验对象, 采用活体注射的方式, 分别注射不同浓度多巴胺和5-羟色胺, 分析争斗的总次数、优胜方的平均优势指数、对虾体内DA、5-HT含量等, 探讨注射不同浓度外源物质对对虾争胜行为的影响, 旨在初步阐明多巴胺和5-羟对对虾争胜行为的响应机制, 为对虾行为学研究提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验所用中国明对虾、凡纳滨对虾购自昌邑海丰水产养殖有限责任公司, 生物学体长分别为9.0±0.5cm、8.0±0.3cm。日本囊对虾购自即墨市对虾养殖场, 生物学体长为8.5±0.3cm。挑选健康活泼、体格健壮、体色正常, 规格一致的个体放置于50cm×40cm×35cm的塑料水槽中暂养7d, 水位30cm。所用海水为经沉淀、消毒、沙滤后的自然海水, 盐度33, 中国明对虾、日本囊对虾的养殖水温为23.0±1.0℃, 凡纳滨对虾的养殖水温为24±1.0℃, pH 8.0±0.3;自然光照, 连续充气, 日换水1/3。饵料为人工配合饲料, 饲料成分:粗蛋白43%, 粗灰分15%, 粗纤维5%, 总磷0.9%, 粗脂肪5%, 赖氨酸2.2%, 水分12%。日投喂3次(6:00, 12:00, 18:00), 投喂后2h后清理残饵及粪便。

1.2 实验方法 1.2.1 实验设计

本研究以日本囊对虾、凡纳滨对虾、中国明对虾为观察研究对象, 每种对虾均分为2个处理组: DA组、5-HT组和对照的生理盐水(0.85%)组。实验采用人工注射的方法进行, 注射量60µL, DA组与5-HT组注射液均配制有高、低两种浓度:高浓度多巴胺(HAD, 2×10^–3 mol/L)、低浓度多巴胺(LDA, 2×10^–4 mol/L)、高浓度5-羟色胺(H5-HT, 2×10^–5 mol/L)、低浓度5-羟色胺(L5-HT, 2×10^–6 mol/L)注射液用生理盐水配制, 并作灭菌处理。每处理组设3个平行组。实验在塑料水箱中进行, 实验期间与暂养期间的养殖管理相同。容器底部铺上具有5cm×5cm方格线的塑料板, 以便量化对虾的游动速度和范围等。对虾养殖密度为80尾/m², 每天上午9:00实验开始前需从暂养箱中选取1尾对虾, 用黑色标记笔在头胸甲部标记, 注射外源物后放置到各养殖箱中观察, 连续观察20min, 实验进行10d。观察时停止充气, 减轻对对虾行为观察的影响, 记录争斗次数、争斗强度等争胜行为指标, 并计算平均优势指数。观察结束后抽取对虾血液进行血清样品的制备。实验借助行为观察法和视频图像解析技术进行行为的统计分析, 记录被观察对虾争斗中的争斗发起者、获胜方、失败方、争斗次数、争斗持续时间、游动速度及距离等。统计分析争斗发起者获胜的概率、攻击次数与攻击强度的关系。攻击强度参考李玉全(2014)关于日本囊对虾争胜行为的划分, 用摄像机记录争斗过程并加以归类。

1.2.2 对虾血淋巴的采集

从每个水箱中随机选取标记对虾1尾, 用1mL一次性无菌注射器于对虾心脏处抽取对虾的血淋巴, 注射器中预先吸入预冷抗凝剂(0.51mol/L氯化钠, 0.01mol/LEDTA-2Na, 0.2mol/L柠檬酸, 0.04mol/L柠檬酸二钠, 0.1mol/L葡萄糖, pH=7.3), 使血淋巴与抗凝剂的最终比例为1 : 1, 在离心管中混匀后, 置于4℃下中保存。

1.2.3 血清的制备

取上述抗凝血淋巴的样品, 在4℃下3000r/min在高速冷冻离心机中离心10min, 取上清液, 即为血清样品, 并保存于-80℃冰箱中备用。

1.2.4 指标检测

多巴胺含量测定分析参考王怀友等(2003)方法; 参照ELISA试剂盒的方法, 检测对虾体内5-羟色胺含量。

1.3 数据处理与统计分析

平均优势指数(MD):实验过程中总获胜次数与争斗总次数(获胜次数+失败次数)的比值。

采用SPSS17.0作数据统计分析, 利用单因子方差分析(One-way ANOVA)比较分析不同处理间的差异, P < 0.05为显著水平, P < 0.01为极显著水平, 使用Excel 2010软件作图。

2 结果与分析 2.1 多巴胺浓度对平均争斗次数的影响

由图 1可知, 注射多巴胺对三种对虾争斗次数有显著性影响(P < 0.05)。在注射多巴胺后三种对虾间的争斗显著增加, 相较于对照组, 南美白对虾、日本囊对虾、中国明对虾在注射低浓度多巴胺(2×10^–4 mol/L)后, 对虾平均争斗次数分别增加了13.8%、11.1%、21.8%, 高浓度多巴胺(2×10^–3 mol/L)组分别增加了91.0%、64.0%、68.5%。同种对虾在注射不同浓度多巴胺后与对照组差异均显著(P < 0.05), 且高浓度多巴胺(2×10^–3 mol/L)组比低浓度多巴胺(2×10^–4 mol/L)组更易激发对虾间的争斗欲, 随着多巴胺浓度的升高三种对虾的争斗性呈现上升的趋势。由对照组发现, 日本囊对虾较凡纳滨对虾的平均争斗次数高38.4%, 比中国明对虾高12.6%, 表现出较强的好斗性, 且在多巴胺的作用下争斗性的增强更为明显。低浓度多巴胺组(2×10^–4 mol/L)中日本囊对虾与中国明对虾争胜行为相比较差异不显著(P > 0.05), 与凡纳滨对虾相比较差异显著(P < 0.05);对照组的各种对虾间均差异显著(P < 0.05)。

从图 2可知, 对照组中多巴胺含量以日本囊对虾最高, 显著高于凡纳滨对虾和中国明对虾(P < 0.05), 这与图 1中日本囊对虾对虾表现出较强好斗性相符, 凡纳滨对虾最低, 对虾间的争斗较少, 与凡纳滨对虾适合高密度养殖相符合。在注射低浓度多巴胺(2×10^–4 mol/L)后, 三种对虾体内的多巴胺含量均有提升, 凡纳滨对虾体内多巴胺含量变化最为明显, 升高了近3倍, 争斗结果如图 1所示, 争斗次数随之增多, 高于对照组; 日本囊对虾与中国明对虾体内多巴胺含量较高, 争斗次数也相对较多。在注射高浓度多巴胺(2×10^–3 mol/L)后, 对虾体内的多巴胺含量略微上升, 但三种对虾在高浓度的多巴胺作用下均表现出较强的争斗性。由此可见, 对虾可通过调节体内多巴胺含量来调节对虾的争胜行为, 低浓度多巴胺(2× 10^–4 mol/L)对对虾的争斗性影响较小, 而在高浓度多巴胺(2×10^–3 mol/L)的作用下对虾用于行为调控的多巴胺含量随之增多, 对虾间的争斗增多, 多巴胺含量增加幅度显著降低。

2.2 多巴胺浓度对争斗平均优势指数(MD)的影响

从图 3可以看出, 三种对虾在注射多巴胺和生理盐水后, 平均优势指数变化趋势基本一致, 随多巴胺注射浓度的升高, 对虾的平均优势指数呈现逐渐降低的趋势; 仅凡纳滨对虾在低浓度多巴胺(2× 10^–4 mol/L)作用下平均优势指数表现出较为明显的抑制作用(P < 0.05), 较对照组降低了10.9%, 在三种对虾中变化最大; 在注射高浓度多巴胺(2×10^–3 mol/L)后, 日本囊对虾和中国明对虾的平均优势指数比对照组分别降低了0.09和0.1, 降幅分别为12.5%和19.1%, 多巴胺浓度对平均优势指数影响差异显著(P < 0.05)。在对照组和实验组中日本囊对虾平均优势指数均在0.55以上, 最高值达到0.65, 均高于中国明对虾和凡纳滨对虾。

2.3 5-羟色胺对平均争斗次数的影响

由图 4可知, 注射5-羟色胺对凡纳滨对虾、日本囊对虾、中国明对虾的争斗行为影响显著(P < 0.05), 5-羟色胺有效地降低了同种对虾间的争斗, 各处理组间争斗次数均差异显著(P < 0.05);随着5-羟色胺注射浓度的升高, 平均争斗次数减少, 相较于对照组, 低浓度5-羟色胺(2×10^–6 mol/L)组比对照组降幅超过50%, 高浓度5-羟色胺组降幅超过270%以上。对照组的平均争斗次数更是高浓度5-羟色胺(2×10^–5 mol/L)组的2倍以上。对照组中日本囊对虾表现出较强的好斗性, 在注射5-羟色胺后, 对对虾争斗性的抑制作用最为显著。从图 5可以得知, 注射不同浓度5-羟色胺后日本囊对虾、中国明对虾的5-羟色胺的含量均差异显著(P < 0.05)。随着初始5-羟色胺注射浓度的升高, 对虾体内最终的5-羟色胺浓度呈现小幅上升, 与图 4中日本囊对虾、中国明对虾争斗次数减少相符合。此外, 日本囊对虾在注射不同浓度5-羟色胺和生理盐水后, 体内5-羟色胺含量变化最为显著(P < 0.05), 这也与日本囊对虾在高浓度5-羟色胺作用下争斗性降低相符合。

2.4 5-HT浓度对争斗平均优势指数(MD)的影响

从图 6可以得知, 低浓度5-羟色胺(2×10^–6 mol/L)对对虾争斗中确立优势地位的促进作用不明显, 其平均优势指数与对照组基本相同, 均在0.5—0.7。注射5-羟色胺溶液对凡纳滨对虾争斗的平均优势指数无显著影响(P > 0.05), 日本囊对虾和中国明对虾仅在注射高浓度5-羟色胺(2×10^–5 mol/L)时表现出明显的促进作用, 平均优势指数变化显著(P < 0.05), 三种对虾最终的平均优势指数差别较小, 均保在0.65—0.75。由此可知, 高浓度5-羟色胺会提升对虾的争斗性, 对虾易在争斗中获得最终的优势地位。

3 讨论 3.1 注射DA对对虾争胜行为的影响

水生动物争斗行为是一种发生在种群间和种群内的普遍行为, 其行为会受到受到神经递质及相关基因等因素的影响。Fletcher等(2009)研究发现, 水生动物的个体行为往往依赖多种复杂的化学信号。许多学者研究发现, 生物胺可作为神经递质或激素传递各种信息, 参与甲壳动物渗透调节(Mo et al, 1998; 张林娟等, 2007)、行为调控(Kravitz, 1988)、免疫应激(胡发文等, 2007)、神经内分泌(叶海辉等, 2003)等生理过程。从本实验结果来看, 多巴胺作为一种神经递质参与了对虾间的争斗行为, 对对虾争斗性的提升起到了促进作用。注射多巴胺能激发对虾的争斗性, 对虾间的争斗次数显著增加。相较于对照组, 南美白对虾、日本囊对虾、中国明对虾在注射低浓度多巴胺后, 对虾平均争斗次数分别增加了13.8%、11.1%、21.8%, 高浓度多巴胺组分别增加了91.0%、64.0%、68.5%, 随着多巴胺浓度的提高, 对虾间的争斗数量呈上升趋势。实验结果与Cheng等(2005, 2006)关于多巴胺对对虾行为的影响相同, 明确了多巴胺在争胜行为方面的影响。注射高浓度多巴胺后, 对虾体内多巴胺含量相较于注射低浓度含量呈小幅升高趋势, 作者认为高浓度多巴胺在注入对虾体内后, 会作为一种神经内分泌信号或激素, 在对虾体内完成转化或代谢, 含量随之减少, 而低浓度多巴胺的注入量相较于未注射对虾体内的多巴胺含量较小, 所能引起对虾争斗性有限。目前关于最适多巴胺注入量和多巴胺在对虾体内的转化、代谢机理等方面有待进一步研究。李玉全等(2013a)认为日本囊对虾具有较强的好斗性, 较凡纳滨对虾和中国明对虾不适合高密度养殖。本研究结果显示, 日本囊对虾在注射生理盐水组中表现出较强的争斗性, 日本囊对虾较凡纳滨对虾的平均争斗次数高38.4%, 比中国明对虾高12.6%, 这与上述的研究结果相近。此外随多巴胺注射浓度的升高, 对虾的平均优势指数呈现逐渐降低的趋势。

3.2 注射5-HT对对虾争胜行为的影响

魏鸿擎等(2015)和Kravitz(1988)关于水生生物的神经生物学机制研究认为, 5-羟色胺为重要的单胺类神经递质, 与水生动物争斗性行为关系紧密。本实验结果表明, 5-羟色胺有效地降低了同种对虾间的争斗, 降低对虾的争斗性; 随着5-羟色胺注射浓度的升高, 平均争斗次数减少; 低浓度5-羟色胺组比对照组降幅超过50%, 对照组的平均争斗次数更是高浓度5-羟色胺组的2倍以上, 变化较为显著。研究结果与Ferrari等(2005)和Summers等(2006)给脊椎动物补充5-羟色胺可以降低其攻击性相似, 可见5-羟色胺不仅对脊椎动物争斗行为有抑制作用, 也可对对虾的争斗起到明显的减弱作用, 与多巴胺作用正相反。此外, 研究发现, 低浓度5-羟色胺(2×10^–6 mol/L)对对虾争斗中确立优势地位的促进作用不明显, 其平均优势指数与对照组基本相同, 均高于0.5, 这可能与肌肉注射对对虾的刺激有关。本研究结果可为对虾高密度养殖提供理论参考, 在饵料中适当添加5-羟色胺以减弱对虾间的争胜行为、增加养殖密度的可行性有待进一步研究。

4 结论

本文研究了注射多巴胺和5-羟色胺对凡纳滨对虾、日本囊对虾和中国明对虾争胜行为的影响, 包括注射浓度与平均争斗次数、平均优势指数相关性分析、平均争斗次数与多巴胺和5-羟色胺含量变化的分析。结果显示, 多巴胺和5-羟色胺两种生物胺均能作为神经递质参与对虾争胜行为调控。注射多巴胺能显著地提高对虾间的争斗性, 随着多巴胺浓度的升高三种对虾的争斗性呈现上升的趋势, 同种对虾在注射不同浓度多巴胺后与对照组差异均显著, 高浓度多巴胺组比低浓度多巴胺组更易激发对虾间的争斗欲。此外, 随多巴胺注射浓度的升高, 对虾的平均优势指数呈现逐渐降低的趋势。5-羟色胺可以有效地降低对虾间的争斗, 随着5-羟色胺注射浓度的升高, 平均争斗次数减少, 相较于对照组, 低浓度5-羟色胺组降幅超过50%, 高浓度5-羟色胺组降幅超过270%以上。随着初始5-羟色胺注射浓度的升高, 对虾体内最终的5-羟色胺浓度呈现小幅上升。低浓度5-羟色胺对对虾争斗中确立优势地位的促进作用不明显, 其平均优势指数与对照组基本相同, 均在0.5—0.7, 高浓度5-羟色胺可提升对虾的争斗性, 利于对虾在争斗中获得优势地位。