近年来, 越来越多的天然植物被发现对水产动物的生长性能、消化机能和免疫机能具有良好的调节作用(邱小琮等, 2002; Jian et al, 2004;王吉桥等, 2006;秦志华等, 2015), 且具有毒副作用小、易分解、在环境和动物体内无残留等优点(艾春汉等, 2009)。因此, 天然植物逐渐被寄望于成为生长调节、疾病预防和替抗治疗的新型绿色功能物质。随着农业部公告1773号《饲料原料目录》指导性政策的颁发, 列明115种具有药用功效的天然植物作为允饲天然植物品种, 符合允饲要求的天然植物应用获得政策性许可, 允饲天然植物作为新型功能型饲用原料的应用开发研究受到行业的广泛重视(农业部, 2012)。然而, 由于完全符合允饲要求的单味或复方天然植物制剂的研究起步晚, 大量具有应用价值的允饲天然植物对水产动物的安全性和生长特性理论鲜有报道。因此, 以水产动物为模式动物, 围绕允饲天然植物对鱼体的安全性和生长性能研究显得十分迫切。

白芍(Radix paeoniae Alba)、杜仲(Eucommia ulmoides)和知母(Rhizoma anemarrhenae)均属于允饲天然植物。白芍具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗之功效, 具有补血功效(国家药典委员会, 2010; Jin et al, 2016), 杜仲能直接刺激网状内皮系统、增强吞噬细胞的活性, 调节细胞免疫功能(Liu et al, 2016), 其单方或复方对养殖鱼类均具有促进生长、降低饵数系数和提高免疫的机能(姚红梅等, 2005), 知母具有清热泻火、生津润燥等功效(杨丽蓉, 2002);以上三种天然植物配伍的复方制剂已经证明对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)具有良好的免疫增强作用(本数据另文发表)。然而, 与起效复方制剂对应的使用剂量在不同时节节点是否存在诱发草鱼组织损伤或生长抑制风险方面仍为理论空白。本研究以草鱼为模式动物, 采用组织形态和生长性能相关指标群, 综合评估以白芍、杜仲和知母为组分的复方制剂添加剂不同添加剂量对草鱼组织形态和生长性能的潜在影响, 以探寻受试复方制剂作为功能性饲料原料的科学应用提供可靠的理论支撑。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验试剂和仪器

甲醛、乙醇、二甲苯等均为国产分析纯; 苏木素染色液、伊红染色液(购自谷歌生物公司); 精密电子秤(购自梅特勒-托利多仪器有限公司); 其他耗材若干(如挂重辅绳、样品瓶、剪刀、镊子等)。

1.1.2 试验鱼

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)购自百容良种场, 体重规格为100±5g。

1.2 试验方法 1.2.1 含允饲植物源复方制剂的饲料颗粒配制

参考农业部公告1173号, 筛选白芍、杜仲、知母三种允饲植物为组分, 将上述三种允饲植物分别加水浸泡30min, 第一次水熬35min, 将水提物倒出, 再加水熬35min, 过滤, 将2次水提物全并浓缩成1mL (相当于1g允饲植物), 然后与豆粕(CP 43%)混合烘干, 最后将含有水提物的豆粕过80目粉碎机获得单种允饲植物微粉。按不同混合比例将三种允饲植物的超微粉配制成复方制剂A、B、C, 分别按2%、4%的比例添加于相同营养配方中(如表 1), 制成粒径为3.0mm的膨化颗粒饲料。

1.2.2 试验分组与管理

从6000尾试验草鱼中随机捞取4200尾, 每组100尾分成42个组, 各试验组投喂的饲料编号见表 2。每组试验鱼先进行5-7d的驯养, 确保各组日均投饵率达到3%时, 即可进行正式试验。正式试验期间, 每天投喂3餐, 日均投喂量为各组试验鱼体重的3%。

1.2.3 临床观察

试验开始后, 每天仔细观察试验草鱼的表现, 对鱼采食情况、发病及死亡情况等生物学行为作好详细观察与记录。试验第1、29天对各组草鱼称重, 统计并且比较体重增长情况。

1.2.4 病理学检查

在试验第7、14、21、28天, 分别从试验用途① 的各组中随机捞取5尾草鱼, 观察和记录草鱼体表特征, 然后依次剖杀各组草鱼并采集肝、脾、肾和肠组织, 波音氏液(Bouins)固定, 石蜡切片, H.E染色, 光镜下检查各组样品的组织形态。

1.2.5 生长性能测定

试验第0、29天, 分别从试验用途①、② 的各组中随机捞取10尾草鱼, 称重、测量鱼体长, 完整分离肝胰脏、脾脏和体肾, 分别称重, 同时通过离体中肠肠道挂重换算草鱼肠道承重力。最后按下列公式计算草鱼、增重率、特定生长率、饵料系数、肥满度、肝胰体比、脾体比和肾体比、和肠道承重力。

增重率(%) = (W_末－W_初)/W_初×100

特定生长率(%) = (lnW_末－lnW_初)/t(养殖天数)×100

饵料系数(%)=饲料总投喂量(g)/鱼体净增重量(g)×100

肥满度=体重(g)/体长(cm)³×100

肝胰体指数(%)=肝胰脏平均重量(g)/鱼体平均体重×100

脾体指数(%)=脾脏平均重量(g)/鱼体平均体重×100

肾体指数(%)=肾脏平均重量(g)/鱼体平均体重×100

肠道承重力(N)=肠道所挂重物重量(kg)/重力单位(10kg/N)

2 结果 2.1 允饲天然植物复方制剂对草鱼生物学行为的影响

试验期间, 1#-7#料连续投喂期间, 各组草鱼发病率和死亡率均为零; 各组草鱼的摄食行为无异常, 抢食积极, 粪便色泽和成形度无异常, 鱼体体色、鳞片光洁度、颅部表皮、颌部皮肤、腹部皮肤、各部鳍条、肛周等均无异常。

2.2 允饲天然植物源复方制剂对草鱼组织形态的影响 2.2.1 肝组织形态分析

试验期间, 1#料组、2#料组和对照组草鱼肝细胞形态、肝血窦分布、中央静脉形态正常(如图 1A1、1A2、1A7)。试验第14天时, 4#组草鱼局部肝组织出现肝细胞水泡变性, 中央静脉淤血, 随着投喂时间的延长至28天时, 草鱼肝索严重紊乱, 肝细胞发生广泛水泡变性, 肝细胞膜扩张, 肝细胞核边移(如图 1A4)。而3#料组草鱼肝组织仅在试验第28天时才明显观察到与4#料组草鱼肝组织相似的病变(如图 1A3)。5#和6#料组草鱼肝组织则分别在试验第28、21天出现明显病变, 病变特征上以肝细胞严重水泡变性, 局部细胞膜破损, 肝细胞核边移和肝血窦萎缩为主(如图 1A5、1A6)。由此说明, 以7天为投喂周期, 试验用量的复方制剂A、B、C对草鱼肝组织均具有良好的安全性; 以14、21、28天为投喂周期, 复方制剂B、C对草鱼肝组织则可诱发草鱼肝组织发生不同程度的细胞变性。

2.2.2 脾组织形态分析

试验期间, 试验组和对照组草鱼脾组织白髓和红髓的界限清晰, 脾血窦、淋巴细胞生发中心、中央鞘动脉等组织形态正常。各组草鱼脾组织均可观察到分散的含铁血黄素沉着, 被巨噬细胞吞噬形成黑素巨噬细胞中心(如图 2B1-2B7白色箭头所示), 尤其以试验第7、14天时, 1#和2#料组草鱼脾组织黑素巨噬细胞中心分布数量最多。各试验组脾组织未发现淋巴细胞异常病理坏死、红细胞浸润等现象。由此说明, 试验周期内, 试验用量的三种复方制剂不诱发草鱼脾组织产生可见的病理损伤, 其中以7天为投喂周期, 试验用量的复方制剂A可以明显的增强草鱼脾脏巨噬细胞吞噬活性。

2.2.3 肾组织形态分析

试验期间, 1#料组、2#料组和对照组草鱼肾组织形态正常(如图 3C1、3C2、3C7)。试验第21天时, 3#和4#料组草鱼肾组织局肾小管少量上皮细胞坏死、脱落, 当投喂时间延长到28天时, 3#和4#料组草鱼肾组织病变进一步发展, 病变特征上均以肾小管萎缩、肾间质水肿性增宽和淋巴样造血组织坏死为特征(如图 3C3、3C4)。5#、6#料组草鱼仅在试验第28天时肾组织间质才出现轻微水肿(如图 3C5、3C6)。由此说明, 以7天为投喂周期, 试验用量的复方制剂A、B、C对草鱼肾组织具有良好的安全性; 若以21、28天为投喂周期, 复方制剂B、C可诱发草鱼肾组织出现以间质水肿、肾小管萎缩和细胞坏死病变。

2.2.4 肠组织形态分析

试验期间, 试验组和对照组草鱼中肠段组织粘膜层中肠绒毛上皮细胞、杯状细胞、中央乳糜管和腺体细胞形态正常, 黏膜下层结缔组织无水肿, 肌层无肌纤维断裂、溶解或坏死的现象, 外膜层结缔组织和毛细血管形态均正常(如图 4, D1-D7)。版图D显示, 不同试验组草鱼肠绒毛两侧分布的杯状细胞存在蓝染与淡染的两种形态, 这种现象与杯状细胞分泌功能的亢奋程度有关。由此说明, 试验周期内, 试验用量的三种复方制剂对草鱼肠组织具有良好的安全性。

2.3 允饲天然植物源复方制剂对草鱼生长性能的影响

连续投喂28天, 1#和2#料组草鱼增重率分别达到60.22%和61.04%, 均极显著高于剩余试验组的(P < 0.05); 1#和2#料组草鱼特定生长率分别达到1.85、1.88, 均极显著高于剩余试验组的(P < 0.05); 1#和2#料组草鱼饵料系数则显著低于剩余试验组(P < 0.05)。这说明, 以2%、4%剂量在饲料中添加复方制剂A, 连续投喂28天, 对草鱼的阶段增重率、特定生长率和饵料系数均具有显著的调节作用。

表 3数据显示, 1#和2#料组草鱼肝胰体比、肾体比均显著高于对照组和剩余试验组的(P < 0.05), 而这两个试验组草鱼脾体比则与对照组的差异不显著(P < 0.05)。1#、2#、5#、6#料组草鱼肠道承重力显著高于对照组(P < 0.05), 同时1#和2#料组草鱼肠道承重力显著高于5#、6#料组(P < 0.05), 而3#、4#料组草鱼肠道承重力与对照组差异不显著(P > 0.05)。这说明, 以2%、4%剂量在饲料中添加复方制剂A, 阶段投喂后对草鱼的肝胰体比、肾体比和肠道承重力均具有显著作用。

3 讨论 3.1 允饲复方制剂对草鱼使用安全性评估的重要性

据报道, 多种具有生物活性的天然植物(单方或复方)作为饲料添加剂时符合有效性要求, 对受试水产动物的生理机能、免疫机能和生长性能具有良好的调节作用(刘华忠等, 2004;刘钢, 2005;李霞等, 2011), 这对丰富天然植物作为功能研究的理论具有重要的价值, 也为允饲天然植物作为功能饲料原料开发研究提供重要的技术借鉴。然而由于研究方法和研究目的客观差异的存在, 诸多研究报道涉及与试验条件对应的受试天然植物对试验动物的安全性的数据却近乎空白。本试验基于前期试验结果, 即以白芍、杜仲和知母配制的复方制剂对草鱼多个免疫指标均具有良好的调节作用(本数据另文发表), 通过比较相同试验条件下不同复方制剂对草鱼组织器官形态和生长性能的影响, 探索出符合预期功能的复方制剂在使用时间和使用剂量方面的使用科学性。试验结果表明, 复方制剂A、复方制剂B和复方制剂C在不同使用时间节点对草鱼的肝胰脏、脾脏、肾脏和肠道组织形态均产生不同程度的影响, 对生长性能相关的多个评估指标产生了不同程度的影响。上述发现将为复方制剂在草鱼品种上的最佳使用技术方案的输出提供更科学参考。

3.2 允饲复方制剂对草鱼组织形态的影响分析

肝胰脏是消化器官的重要组成部分。肝脏是鱼体功能最多样化的消化器官之一, 肝脏分泌的胆汁具有乳化脂肪的作用, 以增大脂肪与消化酶的接触面积, 使脂解酶较容易地发挥作用, 也具有储存糖原和脂肪及解毒等功能; 胰脏分泌胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶及麦芽糖酶等, 可促进对饲料中蛋白质、脂肪和糖类物质起消化作用。本试验中, 复方制剂A以2%、4%添加于饲料中, 试验期间对草鱼肝细胞形态、肝血窦形态及其分布、中央静脉形态等均无致病作用; 而复方制剂B、复方制剂C两个试验剂量在连续使用21天、28天, 可引起草鱼肝组织出现以肝细胞水泡变性、坏死和肝血窦腔隙萎缩等病变。由此推断, 在特定的使用周期和同等剂量条件下, 与复方制剂A相比, 复方制剂B、复方制剂C对草鱼肝组织形态具有诱发病变的风险, 从而引发草鱼肝胰脏生理机能的下降。脾脏在鱼体体液免疫反应中处于相对次要地位, 而且受抗原刺激后其增殖反应以弥散的方式发生在整个器官上, 大多数硬骨鱼类脾内均有明显的椭圆体, 具有捕集各种颗粒性和非颗粒性物质的功能。本试验中, 试验用量的三种复方制剂不诱发草鱼脾组织产生可见的病理损伤, 其中以7天为投喂周期, 复方制剂A以2%、4%添加对增强草鱼脾脏巨噬细胞吞噬活性效果更明显。由此推断, 复方制剂A对草鱼脾脏具有增强免疫活性的作用。肾脏是鱼体的“过滤器”, 当血液通过肾脏时, 其中的有毒物质、代谢产物和多余的水分滤出, 起到净化血液的作用(陶健芳等, 2007)。本试验中, 复方制剂B、复方制剂C按2%、4%添加于饲料中, 连续投喂超过14天后, 可不同程度引起草鱼肾间质水管、肾小管萎缩等病理变化, 当投喂时间延长至28天时, 复方制剂B、复方制剂C高剂量添加组诱发的草鱼肾组织病理变化呈恶化趋势。由此推断, 复方制剂B、C的使用周期不宜过长, 否则容易引起草鱼肾功能退行性障碍。肠道是鱼体消化吸收的重要器官, 也是体内最大最复杂的免疫器官, 具有容纳和运输、消化食物和营养吸收等功能, 也具有物理屏障、生物屏障、化学屏障、免疫屏障等功能(涂永锋等, 2004)。本试验中, 三种复方制剂对草鱼肠组织不诱发异常病理变化, 不同试验组草鱼肠绒毛高度、隐窝深度无异常影响, 这与其他研究中关于活性物质会促进肠绒毛生长和隐窝分化的功能表达的结果不同(伍琴等, 2015);不同组草鱼肠绒毛两侧分布的杯状细胞虽存在蓝染与淡染的差异形态, 这可能与杯状细胞生长阶段不同有关, 可认为是正常生理现象。综上所述, 本试验是以满足草鱼基础营养需要为前后, 通过添加不同复方制剂发现当连续使用时间不当或添加剂量不当时, 添加的复方制剂在产生免疫增强作用的同时, 也会对鱼体某些组织器官产生潜在的组织损伤, 该发现与某些关于营养物质缺乏引起草鱼出现进行性病变的研究结果在机理上完全不同(Xu et al, 2016a, b )。

3.3 允饲复方制剂对草鱼生长性能的影响

一种或多种天然植物全株或其部分为原料, 经物理提取或生物发酵法加工, 具有营养、促生长、提高饲料利用率和改善动物产品品质等功效。不同天然植物的配方和添加剂量对鱼类的促生长和增强免疫效果的影响也不同。饲料中添加0.15%杜仲叶提取叶可提高草鱼鱼种增重率8.58% (冷向军等, 2008)和异育银鲫增重率12.9% (石英等, 2008), 提高奥尼罗非鱼生长速率29.7% (姚红梅等, 2005)。当杜仲复配大蒜素组成的复方可有效提高草鱼的存活率和增重率, 而且两种复方以0.04%-0.08%添加在提高草鱼存活率方面具有协同作用(罗庆华等, 2007)。杜仲复配大蒜素在提高细鳞鱼最终体重和增重率也良好的效果, 其中复配物以0.10%添加使用的效果最佳(王春清等, 2014)。本试验中, 复方制剂A两个添加剂量连续使用28天对草鱼的增重率、特定生长率均显著高于其他试验组的(P < 0.05), 而对应试验组饵料系数则显著低于剩余试验组(P < 0.05)。另一方面, 复方制剂A两个添加剂量连续使用28天草鱼肝胰体比、肾体比均显著高于对照组和剩余试验组的(P < 0.05), 肠道承重力显著高于对照组和5#、6#料组(P < 0.05)。

4 结论

试验周期内, 分别以2%、4%剂量添加于草鱼饲料中的复方制剂A、B、C对试验草鱼生长性能无异常影响, 特定试验阶段内, 三种复方制剂对草鱼的阶段增重率、特定生长率、饵料系数、肝胰体比、肾体比和肠道承重力均具有良好的预期效果。然而, 不同时间节点各试验组草鱼组织器官切片分析结果显示, 复方制剂A对草鱼肝胰脏、脾脏、肾脏和肠道不存在诱发组织病变的风险, 而复方制剂B、C经连续投喂21天起, 对应剂量组草鱼肝胰脏、肾脏逐渐呈现不同程度的病变。综上所述, 即使完全符合允饲要求的天然植物品种, 天然植物产地因素稳定是前提(Yu et al, 2015), 同时也必须经过基于较可靠的评价维度试验证明具有使用安全性, 方可进一步推广应用, 否则将容易出现允饲天然植物在效果表达的同时, 间接潜在诱发组织病变的巨大风险。