氯酚类化合物(Chlorophenols, CPs)是芳香族化合物中的一类, 其用途广、毒性大、对环境造成的污染较为严重(U.S. Environmental Protection Agency, 1992; 金小伟等, 2009; 房彦军等, 2009)。五氯苯酚是此类化合物中毒性最大的, 许多国家已将其列入优先污染物和持久性有机污染物名录(许文青等, 2011)。目前, 针对五氯苯酚在环境中的残留量已经开展了很多工作, 它们在水体(do Nascimento et al, 2004; Kot-Wasik et al, 2004; Kawaguchi et al, 2005; 刘金林等, 2006; 董军等, 2009)、沉积物(张兵等, 2001; 刘金林等, 2006)和生物体(张兵等, 2001; Liu et al, 2006)中广泛存在。五氯苯酚化合物高剂量时能致生物体死亡, 低剂量可以对水生生物产生毒性效应, 如王辅明等(2009)研究了稀有鲫(Gobiocypris rarus)受五氯苯酚暴露后体内SOD、GSH和HSP70含量的变化, 房彦军等(2009)研究了稀有鲫受到三氯苯酚暴露后肝脏损伤的比较蛋白质组变化, 李伟民等(2003)研究了五氯苯酚对鲫鱼(Carassius auratus)肝脏氧化损伤的变化, 均表明氯酚类化合物是对水生生物产生毒性效应的重要因素。

转录组学技术是伴随着后基因组学发展起来的新兴科学(Lockhart et al, 2000), 它可以在分子水平上研究水产动物受污染物胁迫后相关基因的差异表达, 进一步从基因水平阐述污染物对水产动物的毒性机制(Huang et al, 2012; Bougas et al, 2013; Guo et al, 2013; Elran et al, 2014; Hook et al, 2014; Hussainzada et al, 2014; 潘泳嘉等, 2016), 该技术已经成为研究生物应激生理、生长发育、抗病免疫等作用机制的有力工具(罗辉等, 2015)。花鲈(Lateolabrax japonicus)是肉食性鱼类, 肉质细嫩、营养丰富, 在对杭州湾新区南岸生物体氯代苯酚风险评估的研究发现, 花鲈等水产品的非致癌风险和致癌风险指数值均高于其他海域(邱纪时等, 2016)。目前, 关于复杂环境因素对花鲈的动态影响过程研究, 污染物分子毒性、过程和原理研究, 以及对五氯苯酚暴露致鱼类肝脏损伤的转录组研究, 尚未见报道。

本文通过对五氯苯酚暴露致花鲈肝脏损伤的转录组研究, 探究花鲈在五氯苯酚暴露环境下机体生物化学变化过程和生物体的应激反应, 研究成果可以为氯代苯酚类化合物生物体监测、环境监测以及水产种质资源保护提供支撑资料。

1 材料与方法 1.1 实验材料

花鲈取自宁波市奉化双山网箱养殖区, 在水泥池中暂养7d以上, 充气, 每天投喂2次(颗粒饲料, 早晚各一次)。实验时, 将花鲈用丁香酚麻醉后转入实验水槽中, 水槽的体积为1m³, 24h后开始实验。实验水体温度20℃左右, pH值为7.8±0.7, 期间充气, 每天投喂颗粒饲料1次。挑选健康无病和规格较为一致的个体作为实验样本, 规格为368±15g。

1.2 暴露实验方法

设置对照组0μg/L (CVST0)和四个浓度胁迫组0.1μg/L (CVST0.1)、1.0μg/L (CVST1.0)、10μg/L (CVST10)和100μg/L (CVST100), 每个浓度组设置3个平行, 每个平行放花鲈15尾。

通风条件下称取适量的五氯苯酚, 放置入100mL的三角瓶中, 充分溶解后, 缓慢倒入不同浓度组的实验水槽中。期间每日换水1次, 换水1/2, 换水后及时加入足量海水, 并添加五氯苯酚溶液维持实验浓度。实验5天后, 将鱼麻醉、处死后, 在低温条件下解剖, 取出肝脏, 迅速置入液氮中冷冻4h, 后转入–80℃超低温冰箱中保存, 备用。

1.3 RNA提取、文库构建

肝脏RNA提取、制备文库和测序, 均利用Illumina公司提供的标准步骤执行。转录组的测序工作由杭州联川生物科技有限公司完成。

1.4 转录组组装

原始数据通过去除截断后长度小于100bp的序列和截断后N的含量在5%以上的序列成为清洁数据(Clean Data)。同时计算Q20、Q30、GC含量和重复序列水平, 后续分析均在清洁数据基础上进行。测序数据利用Trinity软件进行拼接。

1.5 基因功能注释

运用NCBI Nr数据库、Swiss-Prot数据库、KEGG pathway数据库、Pfam数据库和KOG数据库, 使用BLAST软件比对, 得到组装拼接后的unigenes不同数据库的注释描述。

2 结果与分析 2.1 转录组序列分析和组装

花鲈肝脏cDNA提取样本经Illumina测序后, 每个样本的测序量均获得超过6.00G的数据量。利用Trinity软件进行序列组装, 得到clean reads共247914284条, 获得53716条基因, 其N50长度为1189bp。组装后得到转录本71258条, 其N50长度为1559bp。Genes GC含量与Transcripts GC含量均呈正态分布, 数据组装效果理想。

2.2 重复相关性检验

本文实验样本之间基因表达水平的相关系数较高, 仅10组样本之间的相关系数小于0.500。不同受试实验组的PCA分析见图 1, 转录组基因长度分布见图 2, 由图可以看出, 实验样本选取具有代表性, 生物学重复性较好。

2.3 显著性差异基因表达分析

不同暴露浓度组与对照组之间的显著性差异基因表达分析结果见图 3, 四个浓度暴露组分别获得了1447、730、1592、2044个差异性表达基因。其中, 4个浓度暴露组的共有差异性表达基因为135个, 特异性的差异基因数分别为661、127、819和1116个。

2.4 GO功能注释

拼接获得genes后, 与5个公共数据库进行比对, 取阈值e≤1e^–10, 进行功能注释(表 2)。通过设定BLAST参数E-value值, 共有21594条unigenes获得成功注释, 占总基因数的40.20%。Swiss-prot数据库中注释了21459条unigenes, 占39.95%; Nr数据库注释到26464条unigenes, 占49.27%; Pfam数据库注释到18896条unigenes, 占35.18%; KEGG数据库注释到12403条unigenes, 占23.09%; KOG数据库注释到17262条unigenes, 占32.14%; GO数据库注释到19159条unigenes, 占35.67%。

GO功能注释结果分别反映了生物过程(biological process)、细胞组分(cellular component)和分子功能(molecular function)。本文中富集到的与生物学过程有关的unigenes的前25类主要涉及到转录、DNA依赖(transcription, DNA-dependent), 转录调控、DNA依赖(regulation of transcription, DNA-dependent); 与细胞组分有关的前15类主要涉及膜的组成(integral to membrane)、细胞质(cytoplasm), 细胞核(nucleus)和细胞质膜(plasma membrane); 分与子功能有关的前10类主要涉及ATP结合(ATP binding)、锌离子结合(zinc ion binding)、蛋白质结合(protein binding)、DNA结合(DNA binding)和金属离子结合(metal ion binding)等, 上述GO功能过程的占比均超过了33%(图 4)。

2.5 KEGG注释分类

使用KEGG注释系统进行unigenes代谢途径分析(图 5), 15239条unigenes基因分别富集到141条通路, 涉及6类:组织系统、基础代谢、人类疾病、遗传信息进程、环境信息进程和细胞进程。其中1000条unigenes以上的通路有信号转导(Signal transduction), 1410条(9.25%), 免疫系统(Immune system), 1090条(7.15%); 含有500—1000条unigenes的通路有细胞通讯(cell communication), 963条(6.32%), 转运和分解代谢(transport and catabolism), 950条(6.23%), 内分泌系统(Endocrine system)、706条(4.63%), 癌症(cancers), 697条(4.57%), 碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism), 672条(4.41%), 神经变性疾病(neurodegenerative disease), 637条(4.18%), 传染病(infectious disease), 635条(4.17%), 细胞生长和凋亡(cell growth and death), 559条(3.67%), 信号分子与相互作用(signaling molecules and interaction), 554条(3.64%), 氨基酸代谢(Amino acid metabolism), 521条(3.42%); 其中低于100条unigenes的通路有感官系统(sensory system), 85条(0.56%), 环境适应(environmental adaptation), 70条(0.46%), 萜类化合物和聚酮化合物的代谢(metabolism of terpenoids and polyketides), 69条(0.45%), 其他次生代谢物的生物合成(biosynthesis of other secondary metabolites), 77条(0.50%); 其他通路的unigenes数量在100—500条之间。

2.6 KOG注释分类

此外, 所有unigenes经过KOG数据库功能预测和分类, 共有16571条基因被划分为25类(图 6)。其中信号传导机制(Signal transduction mechanisms)和一般功能(general function prediction only)数量最多, 分别有2600条(15.69%)和2595条(15.66%), 然后是参与翻译后修饰、蛋白质转换、分子伴侣(Posttranslational modification, protein turnover, chaperones)的有1392条(8.40%), 参与转录(Transcription)的有1137条(6.86%), 参与细胞内运输, 分泌和水泡运输(Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport)的有997条(6.02%), 参与骨架(Cytoskeleton)、RNA加工和修饰(RNA processing and modification)、翻译, 核糖体结构和生物发生(Translation, ribosomal structure and biogenesis)、碳水化合物运输和代谢(Carbohydrate transport and metabolism)、细胞周期控制、细胞分裂和染色体分区(Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning)的依次有748条(4.51%)、653条(3.94%)、652条(3.93%)、505条(3.05%)、497条(3.00%)。此外, 功能未知的(Function unknown)的有1185条(7.15%)。其他unigenes数量均少于500条, 其中细胞运动(cell motility)的数量最少, 仅有34条(0.21%)。

2.7 SSR多态性分析

由表 3可见, 花鲈肝脏转录组SSR种类较丰富, 以重复6次的频率最高, 有1586个, 占总SSR总数的15.12%, 其次是重复7次和重复5次, 分别有1195个和1101个, 占SSR总数的11.40%和10.50%。SSR的长度影响其多态性高低的重要因素, Temnykh等(2001)研究表明SSR长度小于12bp的多态性极低, 因此本文将SSR长度低于12bp的剔除。经过筛选花鲈SSR的总数为9951条, 其长度范围为12—220bp:其中长度在12—20bp之间的有8256条(占82.97%), 长度大于20bp的达到1695条(占17.03%), 而长度大于20bp的SSR具有较高的多态性。

本文被识别的SSR总数为10486条, 其中二碱基重复SSR最多, 有4176条, 占39.82%;单碱基重复SSR次之, 有3993条, 占37.51%;三碱基重复SSR有1992条, 占19.00%;四碱基重复SSR有234条, 占2.23%;五碱基重复和六碱基重复SSR分别有95条和56条, 分别占0.91%和0.53%。

3 讨论

氯酚类化合物是一类毒性较强的芳香族化合物, 不易降解, 容易在环境和生物体内蓄积(张文生等, 1995), 能对人体健康造成严重威胁(杨淑贞等, 2005)。房彦军等(2009)研究三氯酚暴露对稀有鲫肝脏的损伤, 发现在三氯酚暴露后鱼体肝脏内与氧化应激及氧化磷酸化相关的蛋白发生显著了变化。同时, 低浓度的五氯苯酚暴露后, 随着浓度的升高和暴露时间的延长, 稀有鲫体内SOD活性分别表现为先抑制后激活和先激活后抑制的趋势, 而GSH和HSP70的变化不明显(王辅明等, 2009), 因此推断氯苯酚类化合物胁迫后, 生物体内的超氧化物歧化酶首先发生应激应答。这种应激后的应答, 在鲫鱼中也有发现(李伟民等, 2003), 受到PCP暴露后, 鲫鱼体内的SOD活性下降, GSH含量降低, MDA含量提高, 从而造成了肝脏的损伤, 同样的损伤现象在鲫鱼的血液淋巴细胞中也有发现, 张民等(2005)年研究了五氯苯酚对鲫鱼血液淋巴细胞的毒性, 发现乳酸脱氢酶(LDH)显著增加。本文研究发现, 受到五氯苯酚胁迫后, 不同受试浓度组共有的差异性表达基因135个, 特异性的差异基因数分别有127—819个不等。因此本文就五氯苯酚对生物体造成的毒性效应得到了进一步证实。

随着基因组学技术的发展, 转录组学被广泛应用于生物受到污染物暴露后的水生动物毒理学研究中, 其中在重金属元素的毒性暴露研究中开展的较多。不同浓度的氯化镍、氯化钴和重铬酸钠暴露雄性斑马鱼后, 斑马鱼(Brachydanio rerio)差异表达基因分别有287个、461个和696个, 其中共有的差异表达基因106条, 进一步分析发现重金属污染物扰乱了多种生物学过程, 主要表现在与核糖体生物合成、蛋白酶体降解和p53信号级联放大相关, 同时抑制与氨基酸和脂类代谢相关的氧气产生途径(Hussainzada et al, 2014)。不同浓度的镍和镉分别造成了黄金鲈(Perca flavescens)转录组谱的变化, 其中共有的差异性表达基因有106条, 这些差异主要影响与铁代谢、转录和转化过程、维生素代谢、血液凝结和钙转运相关基因的转录的过程(Bougas et al, 2013)。本文在没有参考测序数据的情况下, 每个实验组均获得了超过6.0G的原始数据, 经Trinity软件进行序列组装后获得了53716条clean基因, 组装后获得71258条转录本。不同实验样本之间的基因表达水平相关系数仅10组样本小于0.500, 另有14组样本的相关系数大于0.900, 进一步应用PCA分析发现, 样本的代表性较好、生物学重复也良好。同时研究五氯苯酚胁迫后花鲈肝脏转录组的变化后, 发现不同浓度组的差异性表达基因数目分别为1447、730、1592和2044个, 差异蛋白表达数量随着受试浓度的升高呈上升的趋势。表明转录组学技术能较好地反映花鲈受五氯苯酚胁迫后机体的生物学变化。

逆境胁迫影响生物的基本代谢过程, 已经得到研究者的证实(Cadigan et al, 1997; 曹莹, 2005; Pilon et al, 2006; 吴兆毅等, 2009)。氯苯酚类化合物显著影响生物体的生理生化过程, GO功能分析结果显示, 受到五氯苯酚胁迫后, 花鲈肝脏内参与转录、DNA依赖, 转录调控的生物学过程有显著变化, 影响分子功能主要是体现在ATP结合、DNA结合和重金属离子结合有关的基因, 影响的细胞组分主要是涉及膜的组成。在KEGG代谢通路中, 其中与环境信息进行相关的信号传导和与组织系统相关的免疫系统变化最为显著, 富集最明显的是MAPK信号通路(466个), 其次是钙信号通路(238个)和Wnt信号通路(259个), 另外差异蛋白的也同时富集在磷脂酰肌醇信号系统(181个)和TGF-β信号通路(171个)中。在MAPK信号通路中主要影响了乙酰辅酶AC乙酰转移酶、谷氨酰胺合成酶、糖磷酸盐传感蛋白UhpC、丝裂原活化蛋白激酶激酶等酶的活性; 而在钙信号通路中主要影响了钙离子运输ATP酶、肌钙蛋白C、钙/钙调素依赖性蛋白激酶(CaM激酶)Ⅱ、钙调蛋白以及不同磷脂酶C的活性。分析发现, 在受到五氯苯酚类物质暴露后, 花鲈体内的信号传导系统首先发生响应, 导致机体的三羧酸代谢途径发生变化, 以应对外界胁迫。钙离子运输ATP酶是一类联系依赖Ca²⁺的ATP水解活性和Ca²⁺转运出红细胞的蛋白质, 可以调控Ca²⁺的时空分布, 从而协助Ca²⁺参与多种生命过程(卫涛涛, 2012), 本文中钙离子运输ATP酶发生了明显的富集, 推测花鲈是为了更好地应对外界的胁迫应激。如上述, 当五氯苯酚暴露后, 花鲈肝脏内的Wnt信号通路发生了明显富集, 这在斑马鱼的胚胎发育过程期也有发现(吴兆毅等, 2009), 当斑马鱼胚胎受到五氯苯酚的暴露后, 机体的Wnt信号通路中重要的调控基因fzd2、fzd10、gsk3b、axin2、PLC-γ的表达均发生了显著变化, 包括成纤维生长因子信号通路(FGF)可激活络氨酸蛋白激酶(RTK)活性, 活化的RTK又进一步激活了PLC-γ, 从而导致机体的胚胎发育异常(曹莹, 2005; Pilon et al, 2006; 吴兆毅等, 2009), 此外, 对胚胎发育具有重要Wnt信号通路除调节作用外, 它还与肿瘤的发生有密切关系(Cadigan et al, 1997), 所以本文推测, 成年花鲈Wnt代谢通路发生变化后, 虽然不会对其胚胎发育造成影响, 但能造成生物的致癌、致畸风险。

4 结论

五氯苯酚暴露后, 致使花鲈肝脏发生了明显的变化, 经Trinity软件拼接, 共获得了53716条基因。不同浓度组的共差异表达基因135个, 特异性的差异基因分别有127—819个不等。在受到五氯苯酚暴露胁迫后, 花鲈体内多条代谢通路发生变化, 其中以信号传导的通路变化尤为明显。但是, 生命有机体在应对外界的污染物暴露后, 会表现出复杂的应激反应过程或现象, 目前难以用统一的代谢通路来进行表述, 或者说这个复杂的过程并不是简单地表现为一种形式, 这也是生命复杂性的重要表现。因此, 在后续研究中需要继续深入开展数据的挖掘, 以便揭示受污染物暴露后机体的应对机制。