单条胶黏藻Dumontia simplex Cotton隶属于红藻门Rhodophyta, 杉藻目Gigartinales, 胶黏藻科Dumontiaceae, 胶黏藻属Dumontia Lamouroux, 广泛分布于辽宁大连、长海县, 山东青岛、烟台与威海等地, 生长在潮间带石沼中或岩石上(夏邦美, 2004)。对于单条胶黏藻的研究源于20世纪60年代, Tokida等(1964)对其外部形态和生殖结构进行了研究, 发现单条胶黏藻的四分孢子体在形态上大于配子体。夏邦美(2004)与曾呈奎(2008)对其外部形态、营养结构与生殖结构进行了研究。Su等(2004)对单条胶黏藻的营养成分进行了研究, 发现其富含较多的蛋白质和多糖, 具有较高的营养价值, 可用于食品加工与药物研发。Saunders(2005)对产自美国的单条胶黏藻细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ (COI)基因序列进行了分析, Saunders等(2011)又对其核酮糖1, 5-二磷酸羧化酶/氧化酶大亚基(rbcL)基因和核糖体大亚基(LSUrRNA)基因序列进行了分析。姜朋等(2016)对单条胶黏藻孢子早期发育及其生活史进行了研究, 发现单条胶黏藻果孢子发育的最适条件为温度9℃、光强160μmol/(m²·s)和盐度30, 四分孢子发育的最适条件为温度9—12℃、光强160—200μmol/(m²·s)和盐度30, 生活史为典型的同型世代交替。

近年来, 黄、渤海沿岸海洋资源的过度开发, 陆源污染严重, 围填海的出现使得近岸污染整体上严重, 潮间带生态系统退化与海水富营养化形势不断加剧, 潮间带海洋生物赖以生存的环境不断恶化, 环境的剧烈变化导致如浒苔Enteromorpha prolifera (罗民波等, 2015)、孔石莼Ulva pertusa (王健, 2010)、强壮硬毛藻Chaetomorpha valida (邓蕴彦等, 2011)等一些藻类大规模暴发, 引发的绿潮灾害迅速扩散, 造成一系列严重的海洋环境问题, 且强壮硬毛藻Chaetomorpha valida在海参养殖池中大量繁殖, 生长盛期可将海参缠绕致死, 严重影响海参养殖业的发展, 带来了巨大危害和经济损失(迟永雪等, 2009)。与此同时, 笔者在标本的采集调查时发现一些常见海藻由于栖息地的减少、遭到破坏等因素的影响迅速减少, 甚至消失, 如海萝Gloiopeltis furcata、亮管藻Hyalosiphonia caespitosa、黏管藻Gloiosiphonia capillaris、叉开网翼藻Dictyopteris divaricate、幅叶藻Petalonia fascia等。因此有必要对黄、渤海沿岸海藻的种类、分布及生物量等进行详细调查与评估。单条胶黏藻作为大型经济海藻, 在黄、渤海沿岸广泛分布、生物量较大, 除了具有食用、药用价值外, 我们也推测其在生长过程中能大量吸收碳、氮、磷等营养物质和重金属, 能缓解海水富营养化及在海洋生态修复过程中具有重要作用。但关于其在黄、渤海沿岸的详细分布、生长状态与分子分析方面的研究未见报道。本研究将对单条胶黏藻的详细分布、形态结构、生物量、成熟个体比例与成熟个体生物量/总生物量(R/T指数)的变化、温度性质等进行详细研究, 并通过rbcL、COI基因序列分析结合形态结构对其进行准确的鉴定。研究结果将明确单条胶黏藻在黄、渤海沿岸的详细分布、资源现状; 确定其生长周期与繁殖盛期, 为其自身物种的保护和繁育提供理论依据; 确定单条胶黏藻在海洋生态系统修复过程中的作用和地位, 为海洋生态系统的修复提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 采集地点的布设

本研究样本采自黄、渤海沿岸礁石较多且生态环境保护较好的海域。共布设了10个采集地点, 分别位于山东省的青岛、威海与烟台, 河北省的山海关, 辽宁省的兴城、大连。

采集地点的布设如图 1中1—10所示, 分别位于山东省青岛市鲁迅公园(120°21′04.3"E, 36°03′02.9"N)、荣成市楮岛(122°34′11.1"E, 37°02′23.9"N)、烟台市养马岛(121°37′38.0"E, 37°28′26.5"N)、河北省山海关老龙头(119°47′55.61″E, 39°58′36.98″N)、辽宁省兴城市菊花岛(120°47′54.83″E, 40°29′39.02″N)、大连市旅顺黄金山(121°16′2.81″E, 38°47′38.96″N)、大连市黑石礁(121°33′0.68″E, 38°52′17.49″N)、大连市付家庄(121°38′12.04"E, 38°52′10.32″N)、大连市金石滩(121°59′40.83″E, 39°04′26.37″N)与大连市长海县獐子岛(122°44′11.10″E, 39°01′56.04″N)。

1.2 样本的采集与处理

根据海洋生物调查规范(中国国家标准化管理委员会, 2007), 2015年12月至2017年6月每个月大潮期间进行样本采集, 包括定性采集与定量采集。

定性采集:单条胶黏藻生长在潮间带的岩石或石沼中(图 2a), 选择结构完整并且带有生殖器官的藻体进行采集, 采集完成后将藻体在解剖镜下去除藻体表面泥沙及附生藻类, 清理干净后部分新鲜藻体用于制作冰冻切片, 使用光学显微镜(Olympus BH2)观察藻体的形态结构, 用Nikon HFX-ⅡA照相机拍摄照片记录结果。另一部分制作成硅胶干燥标本, 用于rbcL、COI基因序列分析, 结构保存完整的藻体制作成腊叶标本并编号, 并保存于辽宁师范大学生命科学学院植物标本馆(LNU)。

定量采集:在每个采集地点藻体生长旺盛的区域布设2个25cm×25cm的样方(图 2b), 将样方内的单条胶黏藻带回实验室, 用吸水纸吸干藻体表面水分, 并放置在65℃的烘干箱中干燥24小时, 待藻体完全干燥后称重, 记录每个样方内单条胶黏藻的生物量。统计每个样方内成熟个体数目及雌雄配子体和四分孢子体的数目, 并计算成熟个体比例与R/T指数(Hasegawa et al, 1955), R/T指数为成熟个体生物量/总生物量。

1.3 DNA提取与PCR扩增

使用北京天根公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒提取藻体DNA, 将提取到的DNA进行PCR扩增。引物设计参照姜朋的方法(姜朋, 2016), 引物组合如表 1所示, 均由上海生工生物公司合成。rbcL与COI基因的PCR反应程序参照姜朋的方法(姜朋, 2016), 检测后的样品均由上海生工生物公司纯化和测序。

1.4 rbcL、COI基因序列分析

从每个采集地点中选取3个单条胶黏藻样本分别获得30条rbcL序列与30条COI序列。从GenBank获取了3个种的rbcL、COI序列(表 2), 包括产自美国的单条胶黏藻、产自加拿大的胶黏藻属的Dumontia contorta, 作为外群种的蜈蚣藻属Grateloupia的带形蜈蚣藻Grateloupia turuturu。应用软件Clustalx(1.83)进行序列比对。使用最大似然法Maximum likelihood (ML)法、临近法Neighbor joining (NJ)法和最大简约法Maximum parsimony (MP)法构建系统发育树, 使用MEGA6.0软件用于进行碱基差异度的分析以及构建系统树, 计算遗传距离模型为Number of differences和Kimura 2-Parameter, Bootstrap重复1000次(李芳, 2016)。

2 结果 2.1 单条胶黏藻个体形态的变化

10个采集地点的单条胶黏藻藻体均直立、扁平或螺旋状, 质地胶质黏滑, 颜色均为红色或紫红色, 但不同采集地点的藻体的长度和宽度存在差异, 采自大连黑石礁与付家庄的藻体在长度和宽度上明显高于其他8个采集地点(表 3)。

成熟雌雄配子体与成熟四分孢子体长度接近, 但四分孢子体更宽, 雌雄配子体宽0.8—1.5cm, 四分孢子体宽1.5—2.5cm。12月初, 雌雄配子体幼苗开始出现, 长度小于1cm, 在12月中旬, 藻体长度达到1—2cm, 12月下旬, 藻体长度达到5—6cm。1月, 藻体快速生长, 长度达到10—13cm。2月, 藻体长度达到15—17cm; 2月末, 四分孢子体幼苗开始出现, 长度小于1cm(图 3a)。3月初, 藻体长度达到2—3cm(图 3b), 3月中旬, 藻体长度达到7—8cm(图 3c), 3月下旬, 藻体长度达到11—14cm(图 3d)。4月, 藻体长度达到16—19cm(图 3e), 其中最大长度可达32cm(图 3f)。5—6月, 当单条胶黏藻的四分孢子释放完成后, 藻体颜色逐渐变浅, 腐烂消失。

2.2 单条胶黏藻的营养结构与生殖结构

营养结构:藻体由皮层与髓部组成, 厚度为85—160μm。皮层由4—8层细胞组成。外皮层由2—3层细胞组成, 细胞小, 排列紧密。内皮层细胞稍大, 由4—6层不规则的方形或卵形细胞组成。髓部排列着疏松的根丝细胞, 长24—63μm, 宽2—3μm (图 4a—c)。

生殖结构:果胞枝生长于一个支持细胞, 由4—6个细胞组成(图 4d, e), 辅助细胞枝生于内皮层细胞上, 由3—7个细胞组成(图 4f)。囊果散生, 包埋于皮层内, 刚发育的囊果较小, 色淡(图 4g), 随着藻体生长囊果变大, 颜色加深(图 4h)。成熟藻体囊果数量较多、分布较密, 成熟囊果的果孢子数量为12—20个, 果孢子直径在8—18μm之间(图 4i)。四分孢子囊侧生在内皮层细胞上, 排列较密, 四分孢子囊母细胞近球形(图 4j), 经过减数第一次分裂形成二分体(图 5k), 减数分裂完成后形成四分孢子囊, 成熟的四分孢子囊呈十字形分裂(图 4l), 四分孢子呈不规则方形, 直径24—32μm。

2.3 单条胶黏藻生物量、成熟个体比例与R/T指数的变化

通过统计12月至次年6月每个采集地点每个样方内的数据发现, 12月至次年4月, 单条胶黏藻的平均生物量一直在增大, 其中雌雄配子体于1月快速生长, 四分孢子体于3月快速生长, 4月平均生物量达到顶峰, 平均生物量为4.384g/m²(表 4), 其中黑石礁和付家庄采集点的单条胶黏藻的平均生物量最高, 分别为4.729和4.583g/m², 5—6月随着海水温度升高, 平均生物量逐渐减小, 7—11月未采集到单条胶黏藻个体。

当单条胶黏藻的雌雄配子体上出现生殖器官果胞与精子囊, 四分孢子体上出现四分孢子囊时藻体即成熟。12月下旬单条胶黏藻雌雄配子体上出现生殖器官果胞和精子囊, 样方内成熟个体比例为10%(表 5), R/T指数为8%(表 6)。1月下旬囊果集中成熟, 成熟个体比例为54%, R/T指数为47%。2月下旬果孢子完全释放, 成熟个体比例为72%, R/T指数为68%。3月下旬观察到四分孢子囊, 成熟个体比例为81%, R/T指数为82%。4月四分孢子囊大部分成熟, 四分孢子体比例逐渐增大, 成熟个体比例为88%, R/T指数为82%。5月未观察到雌雄配子体, 藻体均为四分孢子体, 成熟个体比例为95%, R/T指数为89%。6月成熟个体比例与R/T指数均为100%。

2.4 单条胶黏藻的温度性质分析

海藻的温度性质是海藻区系性质中最主要的一项。关于海藻区系的温度性质, 可分为寒带区系(＜0—5℃)、亚寒带区系(5—10℃)、温带区系(10—20℃)、亚热带区系(20—30℃)和热带区系(25—30℃或以上)。单条胶黏藻主要分布在黄、渤海沿岸, 且单条胶黏藻的生长周期为12月至次年6月, 属于一年生海藻, 而大连市在纬度上位于本研究设置的采样地点的中部, 故以大连市为例, 根据大连市12月至次年6月的海水温度变化分析单条胶黏藻的温度性质。12月至次年1月, 海水温度从10.5℃降至6.3℃, 这段时间单条胶黏藻雌雄配子体快速生长, 平均生物量迅速增大。2—4月海水温度从4.6℃升至8.1℃, 这段时间单条胶黏藻四分孢子体快速生长, 平均生物量迅速增大。5—6月海水温度从10.6℃升至15.3℃, 单条胶黏藻生物量逐渐减少, 并且7—11月未采集到单条胶黏藻个体。综上所述, 单条胶黏藻的适宜生长温度在4.6—10.6℃, 故单条胶黏藻的温度性质属于亚寒带性。

2.5 rbcL、COI基因序列分析 2.5.1 rbcL基因序列分析

本研究共获得30条rbcL序列, 但每个采集地点所测得序列完全相同, 故从每个采集地点选取1条rbcL序列提交到GenBank中, 所获得登录号为: MG195956、MG195957、MG195958、MG195959、MG195960、MG195961、MG195962、MG195963、MG195964、MG195965。比对序列共13条, 序列矩阵长度为1220bp。基于ML法、NJ法和MP法构建了rbcL序列的系统发育树, 三种方法所构建的发育树拓扑结构比较相似, 故均以ML法所构建系统发育树的拓扑结构显示。序列比对结果如图 5所示, 本研究的30个样本之间无碱基差异, 与产自美国的单条胶黏藻在系统树中聚在一个分支中, 无碱基差异, 确定为单条胶黏藻。与胶黏藻属内的Dumontia contorta (Gmelin) Ruprecht碱基序列差异为90bp (8.34%)。与外群种蜈蚣藻属Grateloupia的带形蜈蚣藻G. turuturu的碱基差异为174bp (11.67%)。

2.5.2 COI基因序列分析

本研究共获得30条COI序列, 但每个采集地点所测得序列完全相同, 故从每个采集地点选取1条COI序列提交到GenBank中, 所获得登录号为: MG200060、MG200061、MG200062、MG200063、MG200064、MG200065、MG200066、MG200067、MG200068、MG200069, 比对序列共13条, 序列矩阵长度为663bp。基于ML法、NJ法和MP法构建了COI序列的系统发育树, 三种方法所构建的发育树拓扑结构比较相似, 故均以ML法所构建系统发育树的拓扑结构显示。序列比对结果如图 6所示, 本研究的30个样本之间无碱基差异, 与产自美国的单条胶黏藻在系统树中聚在一个分支中, 碱基差异为2bp (1.30%), 确定为单条胶黏藻, 与胶黏藻属内Dumontia contorta碱基序列差异为75bp (6.88%)。与外群种蜈蚣藻属Grateloupia的带形蜈蚣藻G. turuturu的碱基差异为117bp (8.12%)。

3 讨论

本文通过观察单条胶黏藻的生长周期, 发现单条胶黏藻属于一年生海藻, 生活史为典型的同型世代交替, 这与姜朋等(2016)在研究单条胶黏藻孢子早期发育及生活史时得到的结论一致。12月初单条胶黏藻幼苗出现, 而这些小的个体可能是四分孢子在夏天和初秋阶段休眠, 进入11月后海水温度大幅降低开始发育形成。囊果在1月下旬集中成熟, 四分孢子囊在4月大部分成熟, 这与曾呈奎(2009)在中国黄渤海海藻中描述的单条胶黏藻囊果12月至次年1月成熟, 四分孢子囊冬季至春季成熟结论一致。曾呈奎等(1960)在研究海藻区系性质时认为适宜生长温度在5—10℃的海藻的温度性质为亚寒带性, 本次研究发现单条胶黏藻的适宜生长温度在4.6—10.6℃之间, 其温度性质属于亚寒带性, 故单条胶黏藻主要分布在黄、渤海沿岸的山东与辽宁大连, 同时发现单条胶黏藻在辽宁省兴城市与河北省山海关均有分布, 研究结果丰富了单条胶黏藻在中国的分布范围。

Tokida等(1964)研究了单条胶黏藻的外部形态, 认为四分孢子体在形态上大于配子体, 本研究通过测量四分孢子体与配子体的长度和宽度发现, 二者在长度上接近, 但四分孢子体更宽。12月至次年2月雌雄配子体快速生长, 导致生物量迅速增大, 囊果于2月全部成熟并完全释放果孢子, 所以2月下旬至4月雌配子观察到的雌雄配子体均为成熟个体, 四分孢子体于3月快速生长, 导致生物量再一次迅速增大。四分孢子囊在4月集中成熟, 所以成熟个体比例与R/T指数于4月开始迅速增大, 随着海水温度升高, 配子体于4月开始腐烂消失, 四分孢子体于5—6月颜色开始变浅, 腐烂消失。

十个采集地点的单条胶黏藻在外部形态、营养结构与生殖结构上与夏邦美(2004)与曾呈奎(2009)的描述一致。根据rbcL序列所构建的ML系统发育树(图 5)中, 本研究中的30个样本与产自美国的单条胶黏藻聚在一起, 形成一个独立的分支, 自展值为99, 区别于其他种, 验证了本研究的30个样本为单条胶黏藻。根据COI序列所构建的ML系统发育树(图 6)显示, 本研究的30个样本聚集在一起, 形成一个独立的分支, 与产自美国的单条胶黏藻聚在一起, 自展值为100, 区别于其他种, 验证了本研究的30个样本为单条胶黏藻, 但本研究的30个样本与产自美国的单条胶黏藻存在2bp (1.30%)碱基差异, Le Gall等(2010)研究了DNA条形码技术对于研究海藻种类多样性的作用, 认为海藻序列碱基差异小于2%属于种内差异, 所以本研究的30个样本与产自美国的单条胶黏藻属于同一物种, 确定为单条胶黏藻。

杨国峰等(2003)进行大型海藻对富营养化海水养殖区生物修复的研究与展望时, 发现海带、龙须菜、条斑紫菜等大型海藻, 生产力很高, 在生长过程中可大量吸收碳、氮、磷等生源要素, 在水生态系统碳循环和减缓富营养化方面有很重要的作用。林贞贤等(2006)描述了大型海藻对富营养化海湾生物修复的研究进展, 发现紫菜、海带、裙带菜等大型海藻生物量大, 生产力高, 在生长过程中能大量吸收碳、氮、磷等营养物质, 能缓解海水富营养化问题。本研究发现大连黑石礁与付家庄的单条胶黏藻在外部形态与平均生物量上均明显大于其他采集地点。通过观察, 这两处采集地点附近均存在污水处理管道将污水直接排入海中, 海水富营养化问题较其他采集地点严重, 所以我们推测单条胶黏藻在生长过程中也能大量吸收碳、氮、磷等营养物质和重金属, 能缓解海水富营养化, 对海洋生态系统的保护与修复具有重要的作用。

4 结论

基于形态结构观察与rbcL、COI基因序列分析, 本研究的30个样本均为单条胶黏藻。单条胶黏藻分布在黄、渤海的沿岸的山东省青岛、烟台与威海, 河北省的山海关, 辽宁省的大连与兴城。单条胶黏藻生长周期为12月至次年6月, 属于一年生海藻。其中配子体繁殖盛期为1—2月, 四分孢子体繁殖盛期为4月。单条胶黏藻的温度性质属于亚寒带性。推测单条胶黏藻能缓解海水富营养化, 对于潮间带生态系统的保护与修复具有重要意义。