硬骨鱼类的精子结构一般由头部、中段和尾部(鞭毛)三部分组成。精子头部因鱼的种类不同, 呈圆形、卵圆形、椭圆形及长椭圆形等(Mattei, 1991; Fürböck et al, 2009)。多数硬骨鱼类精子无顶体, 头部主要由细胞核组成, 核的后端有一凹窝为植入窝, 不同种鱼类精子核的外形及核内染色的形态及致密程度、植入窝的深浅等特征存在差异(刘雪珠等, 2002; 尹洪滨等, 2005); 精子中段的主要结构为中心粒复合体及袖套, 中心粒复合体一般由近端和远端中心粒组成, 袖套为圆筒状结构, 内部有线粒体, 不同种硬骨鱼类近、远端中心粒的有无及排列方式、袖套的形状和发达程度、线粒体的形态和数目等存在种属差异(刘雪珠等, 2002; Fürböck et al, 2009); 尾部为鞭毛结构, 由轴丝外包质膜组成, 鞭毛侧鳍的有无及发达程度存在种间差异(Mattei, 1988; 尹洪滨等, 2008; Fürböck et al, 2009)。对鱼类精子超微结构的详细了解有助于受精机制的深入研究, 也可为系统分类提供有价值的信息。迄今为止, 鲤形目鱼类精子超微结构的研究报道较多, 如鲤科鱼类(Baccetti et al, 1984; 尤永隆等, 1996; Lee et al, 1998; Hu et al, 2005; Rutaisire et al, 2006; Fürböck et al, 2009; 梁健等, 2013; Fu et al, 2016; Bhatt et al, 2017)、鳅科鱼类(王志坚等, 2009; 李飞等, 2011; 胡雨等, 2016)、胭脂鱼科鱼类(李飞等, 2009)。鲑形目鱼类精子超微结构研究已见川陕哲罗鲑(Hucho bleekeri)(郭威等, 2016)、虹鳟(Salmo gairdneri)(谷伟等, 2014)、白斑红点鲑(Salvelinus leucomaenis)(张永泉等, 2011)、大麻哈鱼(Oncorhynchus keta)(尹洪滨等, 2005)、樱花钩吻鲑(Oncorhynchus masou)(Gwo et al, 1996)、哲罗鱼(Hucho taimen)(尹洪滨等, 2008)等鲑科鱼类中研究报道。

香鱼(P. altivelis)属鲑形目(Salmoniformes)、胡瓜鱼亚目(Osmeroidei)、香鱼科(Plecoglossidae), 国内分布广, 日本、朝鲜也有分布。香鱼作为名贵的经济鱼类及增养殖种类, 其基础研究备受重视, 如遗传多样性(闫松松等, 2014; 宋娜等, 2014)、营养生理(Lee et al, 2002; Yamamoto et al, 2016)、基因(杨智景等, 2015; 赵桐等, 2015)与免疫(Lu et al, 2017; Nie et al, 2017; Chen et al, 2018)等方面的研究均有涉及。香鱼为卵生、体外受精类型, 一年性成熟, 雄鱼性成熟早于雌鱼, 秋季在河口咸淡水交汇处繁殖, 大量亲鱼集群产卵, 一尾雌鱼常有多尾雄鱼追逐, 性比可达10:1以上, 繁殖完成后绝大多数鱼死亡(曹克驹等, 1982)。从香鱼的繁殖特点猜测其精子结构可能具有特异性。本研究采用扫描和透射电镜技术, 观察了香鱼成熟精子的形态与结构, 并与鲤形目、鲑形目等淡水鱼类精子结构进行比较, 旨在了解香鱼精子结构的特点, 积累鱼类精子结构比较研究基础资料。

1 材料与方法 1.1 材料

实验用性成熟雄性香鱼于2016年10月取自浙江省宁海大佳河香鱼养殖场, 共10尾, 个体重80—100g, 暂养于水泥池中, 供采精用。

1.2 方法 1.2.1 精液采集及固定

轻压鱼腹精液能自然流出者用于采精, 用洁净的注射器将挤出的精液移入离心管中, 用预冷(4℃的2.5%戊二醛固定过夜, 用于后续实验。

1.2.2 扫描电镜样品制备及观察

将固定的样品用0.1mol/L PBS漂洗三次, 梯度酒精脱水, 叔丁醇置换, 冷冻干燥, 喷金, 日立S-3400N型扫描电镜观察并拍照。

1.2.3 透射电镜样品制备及观察

将固定的样品用0.1mol/L PBS漂洗三次, 用1%锇酸固定1—2h, 0.1mol/L PBS漂洗三次后梯度酒精脱水, 环氧树脂(Epon-812)渗透、包埋, 超薄切片机(LKB-Ⅱ)切片, 醋酸铀及柠檬酸铅双重染色, 日立H-7650型透射电镜观察并拍照。

2 结果 2.1 扫描电镜下香鱼精子的形态结构

扫描电镜观察表明, 香鱼精子为典型的鞭毛型, 全长约23.5μm。从前往后由头部、中段和尾部三部分组成(图 1-1)。头部似弹头形, 长约1.8μm, 宽约0.8μm(图 1-1, 2, 3, 4, 5), 其后端中央可见凹窝, 即核后窝(nuclear fossa)或植入窝(implantation fossa)(图 1-4)。中段较短, 长约0.5μm, 为“半袖套”结构, 内部为线粒体(图 1-2, 3, 4, 5), 其外观似“半套筒”, 形状不甚规则(图 1-2, 3, 4)。尾部为从植入窝处延伸出的细长鞭毛, 直径约0.2μm(图 1-1, 4)。香鱼精子结构上十分灵巧, 利于快速运动及在受精过程入卵。

2.2 透射电镜下香鱼精子的形态结构 2.2.1 头部

精子头部的主要结构为细胞核, 核的前端无顶体(图 2-1, 2); 纵切面观显示, 核从后端中央向前深凹至近前端, 形成植入窝, 使核呈倒U字形; 核内染色质呈团块状, 核前端染色质分布较稀疏, 后端分布较密集(图 2-1, 2), 质膜呈波纹状包裹在核膜外, 质膜与核膜之间的细胞质很少(图 2-1)。植入窝内有中心粒复合体及小段起始的鞭毛, 中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒(基体)组成, 两者之间的夹角约135°(图 2-1, 3, 4); 近端中心粒位于植入窝的顶端(图 2-1, 3, 4), 远端中心粒在近端中心粒之后, 由其向后延伸出轴丝(图 2-5, 6)。香鱼精子核的形态呈倒U字形, 植入窝极深, 这种特殊形态的核在硬骨鱼类精子中较少见。

2.2.2 中段

精子中段结构较为简单, 由质膜包被线粒体形成半包绕鞭毛的“半袖套”结构(图 2-1, 2, 8, 9); 线粒体体积大, 数量只有1个, 呈不太规则的“半套筒”形, 这一大而形态较为特殊的线粒体可能是精子形成过程中数个线粒体相合融合后形变而形成的, 线粒体的內嵴明显可见(图 2-1, 9); 线粒体是精子运动的动力源, 为精子排放到水中后快速运动提供能量。香鱼精子线粒数目单个与多数硬骨鱼类精子至少有数个线粒体不同。

2.2.3 尾部

尾部为精子的运动器官, 香鱼精子的尾部为一细长的鞭毛, 由轴丝及外包轴丝的质膜组成, 轴丝由9组外周二联微管和1对中央微管构成, 是典型的“9+2”微管结构(图 2-7, 10)。鞭毛两侧有质膜向外突起形成的侧鳍, 可能在精子运动过程中起一定的平衡作用(图 2-10)。

3 讨论 3.1 香鱼与鲤形目鱼类精子超微结构的比较

鲤形目鱼类精子结构研究已涉及较多种类。我们选取部分具有代表性的鲤形目鱼类, 对其精子结构的主要特征进行列表比较(表 1), 并绘制精子结构模式图(图 3-1, 2, 3a, 3b)。

从图 3可见, 鲤形目鱼类精子由头部、中段及尾部组成。胭脂鱼科鱼类胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)精子结构对称, 细胞核呈浅U形, 尾部鞭毛具侧鳍(李飞等, 2009)(图 3-1)。鲤科是鲤形目鱼类中的典型代表, 其精子结构总体不对称, 头部和细胞核呈圆形或卵圆形, 核内染色质非常致密, 近端与远端中心粒之间的夹角在90°—140°之间, 绝大多数无侧鳍; 除此之外, 多数鲤科鱼类精子核内常含有空泡, 袖套及鞭毛内也常有囊泡分布, 袖套内线粒体常集中于一侧(表 1)(图 3-3a, 3b); 鲤科鱼类精子也有特殊类型, 如青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)(梁健等, 2013), 其头部及细胞核呈椭圆形, 尾部鞭毛起始端明显偏于细胞核一侧, 且尾部鞭毛有侧鳍分布(图 3-2)。鳅科鱼类精子结构与大多数鲤科鱼类相似(表 1), 其精子结构模式图也可以图 3-3a及3b表示。

本研究的香鱼精子的U形细胞核与胭脂鱼(李飞等, 2009)精子的浅U形细胞核相似, 但两种鱼精子头部形态、袖套结构、线粒体的形态及数目等存在差异(表 1, 图 3); 香鱼精子的弹头形头部及倒U形细胞核与鲤科及鳅科鱼类精子圆形或卵圆形头部及细胞核相比明显不同, 核内染色质致密程度不及鲤科及鳅科鱼类精子; 香鱼精子两中心粒之间的夹角为钝角, 这与多数鲤科及鳅科鱼类精子相似; 香鱼精子中段袖套为较简单的“半袖套”结构, 内只含1个大的“半套筒”形线粒体, 鲤科及鳅科鱼类精子中段袖套结构较为发达, 如玫瑰无须魮(Puntius conchonius) (Hu et al, 2005)精子袖套内含有丰富的线粒体、糖原颗粒等物质, 细胞质较多; 香鱼精子尾部鞭毛轴丝呈典型的“9+2”微管结构, 鲤科及鳅科鱼类精子也是如此, 但香鱼精子的鞭毛具有对称分布的侧鳍, 与多数鲤科及鳅科鱼类精子鞭毛无侧鳍不同(表 1, 图 3)。

3.2 香鱼与其他鲑形目鱼类精子超微结构的比较

为比较香鱼与其他鲑形目鱼类精子结构的异同, 将其超微特征进行列表分析(表 2), 并绘制了精子结构的模式图(图 3)。

香鱼精子头部似弹头形, 细胞核呈倒U形, 植入窝极深, 而其他6种鲑形目鱼类精子的头部多呈卵圆形或椭球形, 细胞核呈马蹄形或浅U形, 植入窝相对较浅; 香鱼精子核前后端染色质分布不均, 该特点和樱花钩吻鲑(Gwo et al, 1996)较为相似, 而其他5种鲑形目鱼类精子核内染色质致密均布; 虹鳟(谷伟等, 2014)、白斑红点鲑(张永泉等, 2011)及大麻哈鱼(尹洪滨等, 2005)精子核内有空泡分布, 香鱼、川陕哲罗鲑(郭威等, 2016)、樱花钩吻鲑(Gwo et al, 1996)及哲罗鱼(尹洪滨等, 2008)精子核内无空泡结构; 香鱼精子两中心粒之间的角度约135°, 而其他6种鲑形目鱼类中大麻哈鱼(尹洪滨等, 2005)精子两中心粒相互平行, 其余5种鱼均为相互垂直。香鱼精子中段“半袖套”结构及“半套筒”形线粒体较特殊, 其他6种鲑形目鱼类精子中段的袖套结构完整, 内部线粒体多为圆球形或椭球形, 也有的呈圆环形或C字形; 香鱼及樱花钩吻鲑(Gwo et al, 1996)线粒体单个, 其他5种鲑形目鱼类线粒体均在两个或两个以上(表 2)。香鱼和其他6种鲑形目鱼类精子尾部的差异主要体现在侧鳍的大小及对称性上, 大麻哈鱼(尹洪滨等, 2005)的侧鳍发达, 向两侧延伸较长, 香鱼及其他5种鲑形目鱼类侧鳍相对较小, 哲罗鱼(尹洪滨等, 2008)及虹鳟(谷伟等, 2014)精子鞭毛两侧的侧鳍不等大, 有背腹之分; 侧鳍能够增加精子的运动能力(Maricchiolo et al, 2004; Psenicka et al, 2007), 并且侧鳍越大发挥的作用可能越强(Mattei, 1988)。

4 结论

香鱼精子头部呈弹头形, 核呈倒U字形, 植入窝极深, 两中心粒之间呈135°夹角; 中段“半袖套”结构内含“半套筒”形线粒体; 尾部轴丝呈典型的“9+2”微管结构, 侧鳍对称分布, 大小相同。香鱼精子与典型的鲤形目鱼类精子卵圆形或圆球形头部及细胞核、不对称的袖套及尾部鞭毛无侧鳍等结构特征不同。香鱼精子与鲑形目鱼类精子卵圆形或椭圆形头部及马蹄形或浅U形细胞核、两中心粒相互平行或垂直、袖套结构完整等结构特征不同。香鱼精子结构具有种的特异性。