2018, Vol. 49
中国海洋湖沼学会主办。
文章信息
- 任倩妍, 张木子, 黎明, 王日昕, 石戈. 2018.
- REN Qian-Yan, ZHANG Mu-Zi, LI Ming, WNAG Ri-Xin, SHI Ge. 2018.
- 急性缺氧对大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)肝脏中缺氧应答相关基因表达、蛋白含量及酶活性的影响
- DIFFERENTIAL INDUCTION OF GENE EXPRESSIONS, PROTEIN CONTENTS AND ENZYME ACTIVITIES INVOLVED IN HYPOXIC RESPONSIVE IN LIVER TISSUES OF MUDSKIPPER BOLEOPHTHALMUS PECTINIROSTRIS EXPOSED TO ACUTE HYPOXIA
- 海洋与湖沼, 49(4): 889-896
- Oceanologia et Limnologia Sinica, 49(4): 889-896.
- http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20171100301
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文章历史
- 收稿日期：2017-11-30
- 收修改稿日期：2018-04-12
2. 宁波大学海洋学院 宁波 315211
2. School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China
溶解氧(Dissolved Oxygen, DO)是集约化养殖系统中限制水体质量的重要因素之一, 缺氧会导致养殖鱼类大量死亡。在应对缺氧胁迫时, 不同鱼类表现出的生理适应性策略具有一定的差异, 例如:通过调节血红细胞增殖来增加氧的携带能力, 抑制血红细胞的凋亡, 刺激血管生成并减少氧的消耗, 增加对能量的需求等(Sun et al, 2016), 而这些与缺氧相关的生物学过程是通过缺氧诱导因子(Hypoxia inducible factor, HIF)信号通路中相关基因的表达来介导的(Zhu et al, 2013), 如:脯氨酰羟化酶(Prolyl-4- hydroxylase, PHD)、葡萄糖转运体(Glucose transporter, GLUT)、Bcl2/腺癌E1B19KD交互蛋白3 (Bcl-2/adenocarcinoma E1B19KD interacting protein 3, BNIP3)和肿瘤抑制蛋白p53 (Tumour suppressor protein p53, p53)等。迄今, HIF信号通路在鱼类缺氧研究中是一个热点领域, 例如:胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus) (Chen et al, 2012)、印度鲶鱼(Clarias batrachus) (Mohindra et al, 2013)、斑点叉尾
大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)栖息于河口咸淡水水域、潮间带滩涂上, 其构建的洞穴含水量较低, 水环境中经常出现缺氧和高碳酸含量(Aguilar et al, 2000), 由于其特殊的生理特性, 使其成为研究缺氧胁迫较为合适的动物模型。此外, 大弹涂鱼是商业上重要的养殖品种, 在我国福建、浙江、江苏、台湾等地分布较为广泛(Jing et al, 2017)。然而, 目前的报道针对缺氧胁迫下大弹涂鱼生理调节机制的研究较少, 导致在养殖及运输过程中, 由于缺氧造成死亡的现象屡有发生, 因此, 弄清大弹涂鱼缺氧胁迫生理调节的分子机制显得尤为迫切。本研究拟通过评估急性缺氧条件下大弹涂鱼肝脏中缺氧应答相关基因的表达、蛋白含量(HIF, GLUT, PHD, BNIP3和p53)及酶活性(GCK, LDH, CS, PK和PFK)的变化, 探究大弹涂鱼应对缺氧胁迫的生理调节机制。
1 材料与方法 1.1 实验设计大弹涂鱼捕自浙江三门沿岸滩涂, 于实验室环境中暂养14d。随机挑选健康活泼、体表无损伤的实验鱼180尾(平均体重12.58±0.12g), 置于6个65L塑料桶中, 每桶30尾。实验共设置2个处理组:对照组(5.67±0.13mg/L)和缺氧组(大弹涂鱼的窒息点为1.5±0.11mg/L; 曹伏君等, 2011), 急性胁迫为期6h。缺氧组通过向水中充入氮气, 使得水体溶解氧在3h内达到缺氧水平, 之后通过YSI水质测量仪(YSI Inc., Ohio, USA)监测水中溶氧情况; 对照组采用气泵维持常氧条件。整个实验过程中, 水温22—24℃, 保持自然光照。
1.2 取样分别于1h、3h、6h取样, 每次每桶随机挑选3尾鱼, MS-222麻醉后解剖获得肝脏, 分成2份, 一份保存于–20℃用于酶活分析; 另一份液氮冷冻, 保存于–80℃用于基因表达和蛋白含量分析, 所有实验在一个月内完成。
1.3 基因表达分析基于大弹涂鱼HIF、PHD、GLUT、BNIP3和p53序列, 以β-肌动蛋白为内参基因(β-actin), 采用Primer 5.0软件设计引物, 引物序列见表 1, 所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用Takara RNAiso试剂提取大弹涂鱼肝组织的总RNA(大连宝生物工程有限公司, 大连, 中国), 并采用Trans试剂进行反转得到用于实时荧光定量的模板(北京全式金生物技术有限公司, 北京, 中国)。实时荧光定量PCR反应体系(20μL): 10μL TransStart Tip Green qPCR SuperMix、0.4μL正向引物、0.4μL反向引物、0.4μLcDNA模板、8.8μL无菌水。热循环系统反应条件包括95℃, 5min; 95℃, 20s, 40个循环; 57℃, 25s; 72℃, 25s, 每个反应进行三次重复。将cDNA模板以5为单位进行6个梯度的稀释, 用于制作目的基因和内参基因的标准曲线。目的基因的mRNA表达通过“delta–delta Ct”方法计算(Schmittgen et al, 2008)。
| 引物名称 | 正向引物序列(5′—3′) | 反向引物序列(5′—3′) | 片段大小(bp) |
| HIF | GCGACTTATGTGTGCGTGAC | TGGACAACGCTCTGCTTCTA | 206 |
| GLUT | AGCGAAGACGAAGATGAAGC | TCCATCAGCTTGGCATTGTA | 116 |
| PHD | CTACAACAGAAGCGCAGCAG | GGTCCACCGTGCTACCTAAC | 100 |
| BNIP3 | TAACAATGACGCAACGTGGT | AGCCTGACGTGTTCCTGAAG | 109 |
| p53 | ATGTCACTTCCTGCGGAGAC | GATTGGTCCGTGTGTGAGTG | 126 |
| β-actin | GAGCGTGGCTACTCTTTCA | GGAGGCAGCAGTGTTCAT | 200 |
| 注: HIF:缺氧诱导因子1; GLUT:葡萄糖蛋白体: PHD:脯氨酰羟化酶; BNIP3: Bcl2/腺癌E1B19KD交互蛋白3; p53:肿瘤抑制蛋白p53 | |||
取20mg肝脏组织在200μL预冰的生理盐水中匀浆, 匀浆液3000r/min, 4℃离心10min, 取上清。HIF、GLUT、PHD、BNIP3和p53蛋白含量的测定采用ELISA检测手段, 以斑马鱼蛋白作为抗体。步骤简述如下:每个测试均设置标准检测孔、样品检测孔和空白检测孔。标准检测孔加入50μL标准品; 样本检测孔分别加入待测样本10μL及样本稀释液40μL; 除空白检测孔外, 向每个检测孔中加入100μL的HRP-阻断液, 37℃孵育60min; 向每个检测孔中加入洗涤液, 重复洗涤五次; 向每个检测孔中加入终止液50μL终止反应; 450nm波长处测定各孔吸光值。GCK、LDH、CS、PK和PFK活性的测定采用ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司, 上海, 中国), 操作步骤严格按照说明书进行。
1.5 统计分析不同缺氧处理组之间的差异采用t检验进行统计学处理; 不同取样时间之间的差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA), 如果F检验呈显著性, 随后采用邓肯多重比较进行差异分析, 差异显着性设置P < 0.05。所有分析均采用SPSS 18.0.0 (Chicago, USA)在Windows操作系统中进行。
2 结果对照处理组实验鱼肝脏中HIF、GLUT、PHD、BNIP3和p53基因mRNA表达量在不同时间点之间无显著性差异(P > 0.05; 图 1); 缺氧处理组实验鱼肝脏中HIF、PHD、BNIP3和GLUT基因mRNA表达量, 伴随缺氧时间的延长呈显著上升趋势, 而p53基因mRNA表达量呈下降趋势(P < 0.05), 但缺氧3h后无显著性差异(P > 0.05);整个急性缺氧期间, 缺氧处理组实验鱼肝脏中HIF、PHD和GLUT基因mRNA表达量显著高于对照组, 而BNIP3和p53基因mRNA表达量显著低于对照组(P > 0.05)。
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| 图 1 缺氧对大弹涂鱼肝脏HIF、GLUT、PHD、BNIP3和p53基因表达的影响 Fig. 1 Effects of hypoxia on mRNA expression of HIF, GLUT, PHD, BNIP3 and p53 in liver of mudskipper 注: *表示缺氧差异显著, 不同字母表示差异显著(P < 0.05), 相同字母表示无显著差异(P > 0.05), 下同 |
对照组实验鱼肝脏中HIF、GLUT、PHD、BNIP3和p53蛋白含量在不同时间点之间无显著性差异(P > 0.05; 图 2); 缺氧处理组实验鱼肝脏中HIF、GLUT、PHD和BNIP3蛋白含量伴随缺氧时间的延长呈显著上升趋势(P < 0.05), 但3h后无显著性差异(P > 0.05);相反, p53蛋白含量伴随缺氧时间的延长呈显著下降趋势(P < 0.05);整个急性缺氧期间, 缺氧处理组实验鱼肝脏中HIF、GLUT、PHD和BNIP3蛋白含量显著高于对照组, 而p53蛋白含量显著低于对照组(P > 0.05)。
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| 图 2 缺氧对大弹涂鱼肝脏HIF、GLUT、PHD、BNIP3和p53蛋白含量的影响 Fig. 2 Effects of hypoxia on protein contents of HIF, GLUT, PHD, BNIP3 and p53 in liver of mudskipper |
对照组实验鱼肝脏中GCK、LDH、CS、PK和PFK酶活性在不同时间点之间无显著性差异(P > 0.05; 表 2); 缺氧处理组实验鱼肝脏中GCK和PFK活性在3h时显著升高, 之后逐渐减少, 在6h时达到最低(P < 0.05);肝脏中LDH、CS和PK酶活性伴随缺氧时间的延长呈显著下降趋势, 在6h时达到最低(P < 0.05)。整个急性缺氧期间, 缺氧处理组实验鱼肝脏中GCK、LDH、CS、PK和PFK酶活性显著高于对照组(P > 0.05)。
| 酶 | 组别 | 不同处理时间下酶的活性 | ||
| 1h | 3h | 6h | ||
| GCK | 对照组 | 8.17±1.35 | 8.25±1.00 | 8.27±1.64 |
| 缺氧组 | 10.23±0.69b* | 11.81±0.67c* | 6.57±0.34a* | |
| LDH | 对照组 | 35.86±0.83 | 35.45±1.20 | 35.22±0.98 |
| 缺氧组 | 47.26±1.15c* | 43.74±1.09b* | 36.48±0.06a* | |
| CS | 对照组 | 112.19±0.77 | 113.02±2.75 | 111.82±0.57 |
| 缺氧组 | 175.81±5.46c* | 160.25±4.04b* | 127.31±1.41a* | |
| PK | 对照组 | 2.39±0.28 | 2.46±0.52 | 2.36±0.15 |
| 缺氧组 | 3.55±0.06b | 3.27±0.03b | 2.45±0.29a | |
| PFK | 对照组 | 74.05±1.73 | 75.31±3.88 | 75.76±3.32 |
| 缺氧组 | 126.27±1.93b* | 137.06±1.54c* | 77.56±1.35a* | |
| 注: *GCK:葡萄糖激酶; LDH:乳酸脱氢酶; CS:柠檬酸合酶; PK:丙酮酸激酶; PFK:磷酸果糖激酶 | ||||
本研究评估了急性缺氧对大弹涂鱼肝脏中缺氧应答相关基因表达、蛋白含量及酶活性的影响。研究发现, 缺氧处理组实验鱼肝脏中HIF基因的mRNA表达量及蛋白含量伴随缺氧时间的延长显著增加, 这个结果与Zhang等(2017)的报道一致, 他们发现急性缺氧胁迫会导致黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)肝脏中HIF基因的mRNA表达量的增加。同样, Chen等(2012)报道, 胭脂鱼暴露在缺氧环境中24h会上调HIF基因的mRNA表达量; Mohindra等(2013)发现缺氧应激会引起印度鲶鱼脑、肝和头肾中HIF基因的转录显著增加; 类似的发现在其他鱼类中也屡见报道, 例如:斑马鱼(Danio rerio) (Ton et al, 2003)、鲈鱼(Dicentrarchus labrax) (Terova et al, 2008)、石首鱼(Micropogonias undulates) (Rahman et al, 2007)、石斑鱼(Sebastes schlegelii) (Mu et al, 2015)和眼斑星丽鱼(Astronotus ocellatus) (Baptista et al, 2016)等。结果提示, 缺氧诱导因子信号通路在缺氧应答中被激活。
缺氧诱导因子是氧稳态的主要调节器, 在常氧条件下, HIF通过VHL依赖的泛素蛋白酶体通路快速被降解, 但在缺氧条件下却会导致HIF蛋白积累(Ivan et al, 2001)。HIF上调能够激活下游靶基因的表达, 如GLUT(Shen et al, 2012)。Yang等(2017)报道, 在缺氧状态下, 由于缺乏足够的氧气来维持正常的生理或行为功能, 鱼类为了适应低氧环境将启动一系列生理调节活动, 从而导致细胞膜上的葡萄糖转运蛋白数量增加, 而这种从有氧氧化到糖酵解途径的代谢转变, 是增加葡萄糖摄取以促进低氧适应的一种有效策略(Ton et al, 2003)。GLUT能够在缺氧敏感的细胞中表达, 将有利于葡萄糖的转运(Semenza, 2003)。作者在本研究中发现, 缺氧胁迫导致实验鱼肝脏中GLUT基因的mRNA表达量和蛋白含量显著增加, 该结果与前人在鲤鱼(Cyprinus carpio)和大口黑鲈(Micropterus salmoides)中的发现是一致的, 他们认为鱼类暴露于急性缺氧环境中, 能够有效的增加葡萄糖摄取以维持能量的需求(Lardon et al, 2013; Yang et al, 2017)。Wang等(2015)研究发现, 12h急性缺氧胁迫过程中, 团头鲂肝脏中PHD2和HIF基因的mRNA表达量呈先升高后降低的趋势。然而, 本研究发现, 实验鱼肝脏中PHD和HIF基因的mRNA表达量和蛋白含量呈现持续升高的趋势。Zhang等(2017)提出, 在缺氧条件下, 黄颡鱼大脑和肝脏中PHD基因的mRNA表达量水平显著增加, 表明脯氨酸羟基化可能在低氧适应中发挥作用。
Shimizu等(1996)报道, 缺氧诱导的细胞凋亡是消除应激细胞的一种缺氧适应机制。在缺氧胁迫下, HIF通过启动Bcl-2家族成员来激活参与厌氧代谢的基因, 包括: BNIP3和p53 (Semenza, 2000; Denko et al, 2003)。BNIP3进入线粒体外膜, 继而加速自由基(ROS)的生成, 诱导细胞坏死、凋亡或自噬参与细胞死亡(Regula et al, 2002)。在本研究中, BNIP3基因的mRNA表达量和蛋白含量伴随缺氧时间的延长逐渐升高, 该结果与在斑点叉尾
生物体通过降低代谢率以应对低氧应激的生理适应能力通常有所不同(Zhang et al, 2016)。Butler等(1997)提出, 潜水鸟和哺乳动物可以通过增加糖酵解来弥补缺氧造成的能量损失, 而鱼类则通过利用无氧代谢来应付缺氧状态下的能量需求, 如:斑马鱼(Barrionuevo et al, 2010)、甲鲶鱼(Liposarcus pardalis) (Maccormack et al, 2006)、金鱼(Carassius auratus)和黄颡鱼(Zhang et al, 2017)等。已有研究报道, LDH指示无氧代谢的程度(Maes et al, 2016), CS是三羧酸循环的关键酶, 受到PDK(Cai et al, 2010)和GCK、PK和PFK调控(Wegener et al, 2002), 其中GCK、PK和PFK是糖酵解限速酶。在本实验研究中, LDH和CS活性伴随缺氧时间的延长而逐渐下降, 尽管GCK和PFK活性在缺氧3h时表现出上升趋势, 但此后均表现出显著降低趋势。结果表明, 缺氧条件下鱼类有氧代谢能力受到了抑制(Nativ et al, 2014)。
4 结论综上, HIF信号通路在缺氧应答中被激活; 大弹涂鱼缺氧应激缓释策略可能与p53的表达有关; 缺氧抑制了大弹涂鱼需氧代谢的生理过程。
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