细胞色素P450酶(CYP450)是生物体内广泛存在的一种重要的代谢酶, 可作为毒理学指标应用于低剂量环境污染物对机体的潜在危害研究, 从而预防慢性中毒(Goksøyr et al, 1992)。CYP1A是细胞色素P450家族中的一员, 普遍存在于鱼类体内, 也是鱼类中研究最多的一个家族, 对多环芳烃类污染的指示表现出较好的特异性, 敏感性和专一性, 对有机污染物的代谢和脱毒起重要作用, 可作为污染造成个体、种群和生态系统危害的监测预警工具。鱼类CYP1A包括CYP1A1和CYP1A2两种亚型。CYP1A1表达的诱导机制属于芳香烃受体介导型, 芳烃化合物通过与芳香烃受体结合对CYP1A1产生诱导作用(Fent, 2004; Chen et al, 2007)。

苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene, BaP)是广泛存在的一类多环芳烃, 经生物转化后具有较强的致畸、致突变和致癌作用(Conney, 1982)。作为典型的多环芳烃, BaP常被用来进行化学污染物毒性效应评价方面的研究(Yang et al, 1996; Uno et al, 2001; Liu et al, 2008)。

褐菖鲉(Sebasticus marmoratus Cuvier 1929)隶属鲉形目、鲉科、菖鲉属, 为暖温性底层鱼类, 主要分布于日本、韩国和中国东海岩礁地带, 定居性强, 喜欢居住在洞穴以及礁石间隙, 性情凶猛, 对入侵的敌害或同类有防御行为。其活动范围小, 是常见的钓捕鱼类。因其取材方便、价格便宜, 具较强的抗病能力和高成活率, 一直是实验室研究选择的实验鱼类(吴常文等, 1997; 谢伟, 2015)。

BaP在化学性质上并没有太大的活性, 必须经过多种代谢酶的作用被活化后, 才能转化为在化学性质上活泼的化合物并对机体发挥多种毒害作用。本研究主要通过最佳浓度的BaP对褐菖鲉进行注射染毒, 不同时间后测定褐菖鲉活体EROD活性和蛋白表达变化情况(孙竹筠等, 2005), 并采用实时荧光定量PCR技术对其CYP1A1基因mRNA表达量进行测定(陈君慧, 2006), 将三者相结合, 探讨BaP对CYP1A1的影响及作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂与仪器

BaP(纯度W≥96%)、玉米油和TEMED为Sigma公司产品; 30% Acr-Bis (29:1)和抗体稀释液购自康为世纪生物公司; 1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8)和1mol/L Tris-HCl (pH 6.8)购自碧云天; DAB购自Fluka公司; PBS、Tris、Glycine和奶粉购自BIO-RAD; 其他试剂均是国产分析纯; 普通PCR试剂盒、SYBR Premix Ex Taq^TM Ⅱ (Tli RNaseH Plus)购自TaKaRa公司; 总RNA提取试剂盒购自Omega公司; APS和反转录试剂盒购自Thermo公司; 用于检测EROD酶活性的荧光定量检测试剂盒和蛋白质质量浓度试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司; 其他ABI7500实时荧光定量PCR仪, 美国ABI公司; 核酸蛋白测定仪; 上海标模高速均质机; 美国Beckman普通台式离心机和超速离心机; 美国BioTek多功能酶标仪; 美国BIO-RAD公司垂直蛋白电泳仪, Trans-Blot SD半干转印槽。

1.1.2 实验动物

供试褐菖鲉(Sebasticus marmoratus)幼体购自浙江舟山普陀区东河菜场, 大小体重较为一致, 平均体重25g, 体长10cm, 健康无病。所有的鱼在染毒实验之前都在520cm×700cm× 200cm的塑料牛筋水箱中驯养2周, 且全程不喂食, 保持自然光周期。实验时用次氯酸钠消毒曝气48h以上的海水, 水温(24±1)℃, 盐度22—24, 每天检测记录水温、pH值等常规水质指标, 并及时换水及清理排泄物。

1.1.3 引物

根据已有褐菖鲉CYP1A cDNA序列和内参β-actin基因, 以Premier 5.0软件设计特异性扩增引物, 引物合成和cDNA序列测定均委托华大基因完成。

1.2 实验方法 1.2.1 实验设计

(1) 最佳浓度筛选

剂量-效应实验, 将70尾褐菖鲉随机分为6组, 设5个不同质量浓度的BaP注射组(0.1, 1, 10, 20, 50mg/kg鱼体重量)和一个对照组(0mg/kg), 采用腹腔注射方式(邱郁春, 1992), BaP溶解于玉米油中作为载体溶液, 用医用一次性注射器将此悬浊液注射到褐菖鲉腹腔中, 在染毒1d后每组随机抽取3条活力好的褐菖鲉(Levine et al, 1999), 在冰上迅速活体解剖, 避开胆囊, 取肝脏组织, 将一部分样品放入装有RNA保存液的冻存管中, 做好标记, 迅速放入液氮中速冻4d, 而后取出放入–80℃冰箱中保存。通过后续的提取RNA、反转录和荧光定量PCR实验, 测定出CYP1A1基因RNA相对表达量变化最显著的组别, 筛选出最佳浓度, 即后续时间-效应实验中, 每组褐菖鲉BaP的注射浓度。实验结果(图 1)表明, 20mg/kg为BaP注射的最佳浓度, 即后续的时间-效应实验中, 每组褐菖鲉注射的BaP质量浓度都为此浓度。

(2) 时间-效应实验

采用腹腔注射方式, 设置BaP注射的质量浓度为20mg/kg鱼体重, BaP溶解于玉米油中作为载体溶液, 用医用一次性注射器将此悬浊液注射到褐菖鲉腹腔中。将80尾褐菖鲉随机分为7组, 分别为0h、6h、12h、1d、3d、7d (7d组分两部分, 一部分注射20mg/kg的BaP, 另一部分注射等量的玉米油, 作为溶剂对照组), 分别在0h、6h、12h、1d、3d、7d时每组随机抽取3条活力较好的褐菖鲉, 在冰上迅速活体解剖, 避开胆囊, 取肝脏组织, 并将样品分为两部分, 一部分放入装有RNA保存液的冻存管中, 另一部分直接放入冻存管, 用于肝脏匀浆液的制备, 以测定酶活和蛋白, 做好标记, 迅速放入液氮中速冻4d, 而后取出放入–80℃冰箱中保存。

1.2.2 肝脏匀浆的制备

参照Bente M. Nilsen, Karin Berg的方法, 并做适当修饰(Bente et al, 1998)。将保存于–80℃冰箱中的肝脏从冻存管中取出, 放入50mL离心管中, 每管加7mL Extraction Buffer (0.1mol/L Tris-acetate buffer), 做好标记, 在冰水中用高速分散均质机匀浆。匀浆完毕后配平, 放入离心机匀速6000g, 4℃离心50min, 取10mL上清液于超速离心管中, 配平后放入超速离心机中, 在100000g, 32000r/min离心50min。离心完毕, 用phosphate buffer清洗溶解, 并收集沉淀物质, 做好标记, 分装保存在–80℃冰箱中备用。

1.2.3 蛋白浓度的测定

蛋白质质量浓度测定采用Bradford法, 用杰美基因GENMED-Bradford蛋白质浓度定量试剂盒通过比色测定其最大吸收转换来定量蛋白质浓度。试剂盒分为标准液、补充液和反应液三部分。首先按照试剂盒的要求建立标准样品曲线, 求得线性回归方程。将待测样本稀释10倍, 取稀释后样本100μL, 其余同标准曲线制备步骤, 依据线性回归方程计算待测样本中蛋白含量。

1.2.4 细胞色素P450亚酶1A1(EROD)活性测定

采用GENMED细胞色素P450亚酶1A1活性荧光定量检测试剂盒荧光法测定酶活性。

(1) 标准曲线的制备

试剂盒分为缓冲液、反应液、底物液和标准液四部分。首先按照试剂盒步骤建立标准曲线。反应在黑色96孔酶标板中进行, 激发和发射波长分别为530nm和590nm。以标准羟异吩噁唑酮浓度(nmol/L)为横坐标, 相对荧光单位(RFU)为纵坐标, 绘制RF标准曲线。

(2) EROD活性测定

按试剂盒要求, 加好标准样品和待测样品, 并做好标记, 轻轻摇动混匀。在37℃温度下孵育10min后, 放入荧光酶标仪获得相对荧光单位。根据标准曲线计算RF浓度, 计算EROD活性[pmol/(min·mg)]。

1.2.5 RNA的提取和cDNA第一链的合成

在RNA保存液中保存的肝脏组织按照Total RNA kit Ⅰ试剂盒(OMEGA)推荐的方法提取总RNA, 用2%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。根据Thermo反转录试剂盒要求取1μg总RNA用于反转录合成cDNA第一链, 反转录产物保存于–20℃冰箱中。

1.2.6 荧光定量PCR

荧光定量PCR在ABI7500型实时荧光定量PCR仪上进行, 以1.2.5中合成的cDNA为模板, 扩增体系为20μL: 10μL SYBR PremixEx Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(2×), 0.4μL ROX Reference Dye Ⅱ, 0.8μL PCR forward primer, 0.8μL PCR reverse primer, 2μL cDNA, 6μL ddH₂O (An et al, 2011)。

反应采用两步法, 扩增条件为: 95℃预变性10s, 94℃变性5s, 60℃退火和延伸34s, 40个循环, 在60℃进行荧光信号采集, 反应结束后对扩增产物进行溶解曲线分析, 以确保特异性扩增。样本和内参分别设3个平行, ROX作为校正荧光, β-actin为内参。采用相对ΔΔCT法(2^–ΔΔCT)进行CYP1A1基因在褐菖鲉体内的表达分析(刘春等, 2013)。

1.2.7 CYP1A1表达的蛋白印迹法(Western blot)分析

参照Celander等(1991)的方法, 以Western blot方法检测CYP1A1蛋白表达量, 一抗为Abcam公司小鼠抗鱼P450 1A1+1A2单克隆抗体【C10-7】, 稀释浓度为1:100;二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG(Solarbio), 稀释浓度为1:1000, 进行DAB显色。

此部分蛋白质质量浓度测定仍采用杰美基因GENMED-Bradford蛋白质浓度定量试剂盒Bradford法。Bradford法进行蛋白质测定, 加入蛋白上样缓冲液和PBS, 沸水浴10min煮沸变性, 取20μg蛋白经过SDS-PAGE电泳分离, 经过转膜, 再用加入PBS的脱脂奶粉在常温下轻微摇动封闭1h, 4℃避光过夜孵育一抗, PBST洗膜3次, 室温1h孵育二抗, PBST洗膜3次(李晗等, 2016), DAB显色(用DAB、30% H₂O₂、PBS和0.05%的CoCl₂配制显色液), 待条带清晰呈现出后放于清水中终止反应, 取出拍照, 用凝胶分析软件Quantity One计算灰度值。

1.2.8 统计分析

数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析, 用Origin 8.0软件作图, 比较对照组与染毒组之间的差异, 实验数据采用x±s表示, P < 0.05表示差异有统计学意义。Western blot结果采用Bio-rad公司的1D凝胶分析软件Quantity One分析电泳结果。

2 结果与分析 2.1 肝脏中CYP1A1基因表达水平 2.1.1 最佳浓度筛选

由图 1可知, 不同质量浓度的BaP对褐菖鲉CYP1A1 mRNA的表达具有明显的诱导作用, 各实验组的表达水平均高于空白对照组, 总体呈现先上升后下降的趋势, 从0—20mg/kg的浓度范围内mRNA持续稳定上升, 上升幅度明显, 并在20mg/kg时达到最高值, 50mg/kg时又开始下降, 这说明褐菖鲉体内苯并芘的注射浓度为20mg/kg时, CYP1A1 mRNA的表达达到最高水平, 为最佳的质量浓度, 随着苯并芘不断的在褐菖鲉体内富集, CYP1A1mRNA的表达水平在50mg/kg的高浓度下开始出现反弹下调趋势, 但仍远高于空白对照组。

2.1.2 时间-剂量效应

由图 2可见, 同一浓度, 不同染毒时间的苯并芘, 能够引起各实验组褐菖鲉CYP1A1基因mRNA表达发生明显的变化, 其中, 6h和12h组与对照组相比CYP1A1 mRNA表达量明显增加, 并在12h时达到最高值。随着苯并芘在褐菖鲉体内不断积蓄, 苯并芘对褐菖鲉CYP1A1 mRNA表达量的抑制不断增加, 1d后mRNA表达量迅速下降, 3d后又开始回升, 7d时略微下降, 溶剂对照组则达到最低水平。由此可知, 各实验组的CYP1A1表达水平随染毒时间的增加呈现先上升后下降再上升的趋势, 存在良好的时间-效应关系, 苯并芘对褐菖鲉肝CYP1A1基因表达先诱导后抑制。

2.2 酶活性的测定结果 2.2.1 标准曲线

以蛋白质含量(微克)为横坐标, 吸光值OD₅₉₅为纵坐标, 得到标准曲线的线性回归方程为Y=0.07197X+0.5257, R²=0.9698。

由图 3标准曲线可知, 采用Bradford法测定蛋白质含量时, 蛋白质含量与吸光值成正相关。

以吸光值OD₅₉₅为纵坐标, 蛋白质含量(μg)为横坐标绘制标准曲线, 其线性回归方程为Y=0.7197X+ 0.5257, R²=0.9698。

由图 4线性回归方程可知, 相对荧光单位与标准羟异吩噁唑酮浓度呈正相关。

以相对荧光单位(RFU)为纵坐标, 标准羟基异吩噁唑酮浓度(nmol/L)为横坐标绘制标准曲线, 其线性回归方程为Y=73.917X+1005.55833, R²=0.98282。

2.2.2 不同作用时间对褐菖鲉EROD酶活性的影响

由图 5可知, 各实验组中BaP对EROD酶活性的影响与作用时间有关, 其中, 6h、12h和1d组的EROD活性随着时间的延长持续稳定上升, 染毒3d后EROD活性明显下降, 与对照组相比没有明显变化, 但7d后溶剂对照组与染毒组的EROD活性均显著上升。此结果表明, BaP对褐菖鲉EROD酶具有诱导作用, 且这种诱导作用与染毒时间有关, 呈现先上升后下降再上升的趋势, 这与前面BaP对CYP1A1 mRNA表达的影响结果基本一致。

2.3 CYP1A1蛋白表达情况(蛋白印迹杂交Western blot法) 2.3.1 Western blot对应的蛋白质标准曲线

由图 6标准曲线可知, 采用Bradford法测定蛋白质含量时, 蛋白质含量与吸光值呈正相关。

以相吸光值OD₅₉₅为纵坐标, 蛋白质含量(μg)为横坐标绘制标准曲线, 其线性回归方程为Y= 0.07063X+0.54184, R²=0.96702。

2.3.2 Western blot结果

由图 6可知, 注射过苯并芘6h后, 褐菖鲉的蛋白表达量开始明显升高, 在12h时达到最高水平, 1天后下降, 与对照组基本一致, 3天到7天持续上升, 呈现先上升后下降的趋势。这表明苯并芘对褐菖鲉的蛋白表达有显著的诱导作用, 并呈现先诱导后抑制的趋势, 这与前面苯并芘对褐菖鲉mRNA的表达变化基本一致。

3 讨论

BaP在化学性质上并没有太大的活性, 必须经过多种代谢酶的作用被活化后, 才能转化为在化学性质上活泼的化合物并对机体发挥多种毒害作用。BaP经过多种代谢酶的作用被活化后, 转化为化学性质活泼的化合物并对机体发挥多种毒害作用(刘春等, 2013)。CYP1A1是BaP活化最重要的代谢酶, 它在生物体内一般呈低水平表达, 但在BaP诱导下, 其表达水平可高度增加, 不同种属、不同组织CYP1A1被BaP诱导的水平不尽相同, 而且, 研究发现即使在体内能被BaP等物质诱导合成CYP1A1的细胞, 一旦离体培养, 可能也会马上失去这种特性(杨进波等, 2003)。

褐菖鲉是我国海域广泛分布的一种小型底栖穴居鱼类, 是BaP等有机污染物的监测和毒性效应研究适宜的生物材料。肝脏是褐菖鲉体内重要的解毒和代谢器官及场所, 也是褐菖鲉CYP1A1基因表达的重要场所和BaP诱导敏感组织。

本实验室前期的浓度筛选实验结果表明, 不同质量浓度的BaP (0.1, 1, 10, 20, 50mg/kg鱼体重量)对褐菖鲉的CYP1A1基因表达量引起显著诱导作用, 其中BaP体内注射浓度为20mg/kg时, 诱导作用最大。基于此, 本实验中, 每组褐菖鲉的BaP注射浓度均设定为20mg/kg。

本实验用一定剂量的BaP注射于褐菖鲉体内, 分别在0h、6h、12h、1d、3d和7d后对褐菖鲉活体EROD活性进行测定采用Western blot方法对蛋白表达量进行测定, 同时采用实时荧光定量PCR技术对其CYP1A1基因mRNA表达量进行检测。结果发现, 染毒不同时间后褐菖鲉的EROD活性、CYP1A1基因mRNA表达和蛋白表达水平均有显著性升高, 且三者变化趋势基本一致, 都呈现先上升后下降的趋势。这说明苯并芘对褐菖鲉的基因、蛋白及酶活性先诱导后抑制, 由此可推测BaP对褐菖鲉CYP1A1的诱导机制可能是通过诱导CYP1A1基因表达水平, 从而增加蛋白合成提高酶活性(Wang et al, 2008)。但三者的表达变化也具有一定的差异性:各实验组蛋白表达变化与EROD活性变化具有相同的趋势, 但远没有基因表达量变化范围大, 导致差异性的原因可能是酶活性和蛋白的变化滞后于基因表达量变化。

在具体操作中三种检测方法各具有优势, 基因表达量检测方法快速、灵敏, 而蛋白表达量检测方法和酶活性检测直接、稳定, 在污染生物效应的监测研究中, 可将三者结合起来应用, 能有效互补, 拓宽污染生物效应的监测范围, 更加全面地反映污染物对生物的影响。

4 结论

本研究发现褐菖鲉肝CYP1A1基因表达、蛋白表达量以及EROD活性随着苯并芘剂量和染毒时间的增加, 呈现先上升后下降的趋势, 说明苯并芘对它们有诱导作用。推测苯并芘对褐菖鲉肝CYP1A1的诱导机制可能通过诱导CYP1A基因表达水平, 从而增加蛋白合成提高酶活性。可将三种指标结合起来, 不仅能够有效的弥补酶活性较易各种等环境因素影响的不足之处, 又能通过蛋白和基因检测的方法更快更稳定地全面反映污染物对生物的影响, 也可为海洋有机物污染的监测与防控提供借鉴。