绿潮(Green tide)是大型海洋绿藻过量增殖而产生的生态异常现象, 主要绿潮生物多隶属于绿藻门(Chlorophyta)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)的石莼属(Ulva)、刚毛藻属(Cladophora)和硬毛藻属(Chaetomorpha)等, 浒苔(Ulva prolifera)是我国南黄海绿潮暴发的优势种(Fletcher, 1996;罗民波等, 2015)。一方面, 由绿潮引起的生态危害包括水体缺氧、底质腐败、海洋生物丰度和多样性下降等, 另一方面, 浒苔在营养水平和原料供应上具备一定的饵料价值(刘峰, 2010;孙文等, 2011)。刺参(Apostichopus japonicus)隶属于棘皮动物门(Echinodermata)、楯手目(Aspidocita)、刺参科(Stichopodidae)、仿刺参属(Apostichopus), 是我国重要增养殖海珍品(杨红生等, 2014), 马尾藻(Sargassum sp.)等天然饵料供应不足已成为限制刺参养殖业发展的因素之一(袁成玉, 2005)。当前针对浒苔型饵料的研究多使用单一产地的浒苔, 其刺参饲喂效果也未与马尾藻等天然饵料进行对比分析。本实验将不同产地的浒苔干粉与海泥分别按一定质量比例混合, 制成饵料, 研究其对幼刺参生长、消化和非特异性免疫的影响, 并与马尾藻饵料进行对比, 以期为浒苔资源利用和刺参饵料配制提供参考依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本实验使用藻类为浒苔(Ulva prolifera), 分别采自青岛和宁波附近海域, 经海水洗涤、自然晾晒、粉碎研磨后制成藻类干粉。马尾藻(Sargassum sp.)干粉购于威海马山水产公司, 制备方式与浒苔干粉相同。海泥购于威海马山水产公司。幼刺参购于山东东方海洋科技股份有限公司, 即刻运至实验室水槽内暂养, 期间不投喂饵料。

1.2 饵料制备与营养水平 1.2.1 饵料制备

藻类干粉和海泥于60℃下烘干, 粉碎研磨, 经80目筛绢过滤后按质量比1:3混合, 配制成浒苔属饵料、石莼属饵料和马尾藻饵料。

1.2.2 营养水平

分别测定三种饵料的粗蛋白、粗脂肪和灰分含量。采用考马斯亮蓝法测定饵料的粗蛋白含量, 采用索氏抽提法测定饵料的粗脂肪含量, 采用灼烧称重法测定饵料的粗灰分含量。

1.3 养殖分组与实验管理 1.3.1 养殖分组

暂养3d后, 挑选体质健康、活力良好、规格相近的幼刺参展开饲喂实验。刺参个体初始体重为(10.57±0.43)g, 随机分为3组, 分别饲喂不同饵料, 每组包括3个重复, 每个重复包括4头幼刺参, 置于535mm×390mm×325mm规格的塑料水箱中进行饲喂。

1.3.2 实验管理

刺参饲喂实验于2017年11月27日—12月10日在中国科学院海洋研究所循环水养殖实验室展开, 共计14d。各塑料水箱中海水体积约为40L, 水温约为18℃, 盐度约为30, 溶氧浓度约为5.8mg/L, pH约为7.7。实验期间采用自然光照, 保持连续充气, 每天10:00换水约1/2并通过虹吸管吸取刺参残饵和粪便, 每天12:00分别投放浒苔属饵料、石莼属饵料, 和马尾藻饵料, 投放量按刺参总体重的3%计算, 并根据刺参摄食情况和海水透明度进行适当调整, 每天检查刺参存活情况并确保水温、充气等无异常现象。

1.4 样品采集与指标测定 1.4.1 样品采集

14d饲喂期结束后, 记录每个塑料水箱存活刺参的数量并随机取3头幼刺参, 称重, 即刻解剖后取其肠道, 清理肠道内容物, 使用生理盐水进行漂洗, 置于2mL离心管中, 作为淀粉酶(amylase, AMS)、胃蛋白酶(pepsase, PP)、纤维素酶(cellulose, CL)和胰蛋白酶(trypsin, TRY)活力的样品, 于–80℃条件下暂存, 抽取体腔液, 置于2mL离心管中, 作为酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力的样品, 于-80℃条件下暂存。

1.4.2 指标测定

计算幼刺参的成活率(survival rate, SR)、增重率(weight gain rate, WGR)、特定生长率(specific growth rate, SGR), 各指标计算公式如下:

SR(%)=100×最终刺参头数/初始刺参头数;

WGR(%)=100×(最终刺参平均体重-初始刺参平均体重)/初始刺参平均体重;

SGR(%/d)=100×(ln最终刺参平均体重–ln初始刺参平均体重)/养殖天数;

以肠道淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和纤维素酶活力反映不同饵料对幼刺参肠道消化酶的影响, 以体腔液酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活力反映不同饵料对幼刺参体腔液非特异性免疫酶的影响, 酶活力以比活力表示, 均采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定。

1.5 数据处理

实验数据使用Excel 2016进行初步整理与分析, 使用SPSS 16.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏多重比较, 设定显著水平为P < 0.05。实验结果以平均值±标准误(Mean±SE)表示。

2 结果与分析 2.1 饵料营养水平

由表 1可知, 青岛浒苔饵料、宁波浒苔饵料、马尾藻饵料的粗蛋白含量分别为14.31%±0.10%、11.17%±0.63%、15.43%±1.41%, 粗脂肪含量分别为3.98%±0.85%、4.03%±0.11%、4.96%±0.38%, 灰分含量分别为6.40%±0.60%、4.91%±0.60%、3.47%± 1.22%。青岛浒苔饵料和马尾藻饵料的粗蛋白含量显著高于宁波浒苔饵料(P < 0.05), 青岛浒苔饵料和马尾藻饵料的粗蛋白含量无显著差异(P > 0.05), 三种饵料的粗脂肪和灰分含量无显著差异(P > 0.05)。

2.2 不同饵料饲喂下幼刺参生长情况

由表 2可知, 青岛浒苔组、宁波浒苔组、马尾藻组幼刺参的存活率分别为100%、91.67%±8.33%、91.67%±8.33%, 增重率分别为22.65%±5.68%、3.03%±1.17%、20.47%±2.01%, 特定生长率分别为1.44%±0.33%、0.21%±0.08%、1.33%±0.12%。三组幼刺参存活率无显著差异(P > 0.05), 青岛浒苔组和马尾藻组幼刺参的增重率和特定生长率显著高于宁波浒苔组(P < 0.05), 青岛浒苔组和马尾藻组幼刺参的增重率和特定生长率无显著差异(P > 0.05)。

2.3 不同饵料饲喂下幼刺参肠道消化酶活力

由表 3可知, 青岛浒苔组、宁波浒苔组、马尾藻组幼刺参的淀粉酶活力分别为(1.31±0.24)、(1.35± 0.19)、(0.85±0.14)U/mg prot, 胃蛋白酶活力分别为(2.94±0.55)、(3.66±0.51)、(3.59±0.81)U/mg prot, 胰蛋白酶活力分别为(472.21±108.67)、(403.96± 50.02)、(365.70±59.61)U/mg prot, 纤维素酶活力分别为(954.78±115.06)、(705.91±208.58)、(552.82± 38.63)U/g prot。三组幼刺参各消化酶活力均无显著差异(P > 0.05)。

2.4 不同饵料饲喂下幼刺参体腔液非特异性免疫酶活力

由表 4可知, 青岛浒苔组、宁波浒苔组、马尾藻组幼刺参的超氧化物歧化酶活力分别为(289.69± 25.07)、(328.73±15.33)、(316.95±18.37)U/mL, 碱性磷酸酶活力分别为(5.56±1.32)、(7.33±1.24)、(17.57± 4.56)金氏单位/100mL, 酸性磷酸酶活力分别为(2.55± 0.77)、(2.83±0.75)、(3.62±0.37)金氏单位/100mL。其中马尾藻组幼刺参的碱性磷酸酶活力显著高于青岛浒苔组和宁波浒苔组(P < 0.05), 青岛浒苔组和宁波浒苔组的碱性磷酸酶活力无显著差异(P > 0.05), 三组幼刺参其他非特异性免疫酶活力无显著差异(P > 0.05)。

3 讨论 3.1 饵料营养水平

本实验结果表明, 在同一质量配比下, 青岛浒苔饵料、宁波浒苔饵料、马尾藻饵料的主要营养成分存在一定差异, 其中青岛浒苔饵料和马尾藻饵料的粗蛋白含量(14.31%±0.10%和15.43%±1.41%)显著高于宁波浒苔饵料(11.17%±0.63%), 出现上述差异的原因是可能与藻类的品种、采集时间和生长地点等有关。针对不同品种, 已有研究显示缘管浒苔(Ulva linza)、条浒苔(Ulva clathrata)、肠浒苔(Ulva intestinakis)粗蛋白含量分别为27.0%、22.10%、30.45%, 粗脂肪含量分别为0.9%、1.18%、0.38% (何清, 2006;蔡春尔, 2009;杨欢, 2013)。针对采集时间, 林建云等(2011)对福建沿岸海域浒苔样品的营养成分展开调查, 冬、春季浒苔样品均呈深绿色或亮绿色, 其粗蛋白和粗脂肪含量分别为24.85%±2.40%和0.33%±0.10%, 入夏后浒苔样品多为黄绿色或浅黄色, 其粗蛋白和粗脂肪含量分别为14.72%±1.90%和0.26%±0.06%。针对生长地点, 已有研究显示山东青岛、浙江定海、广东湛江沿岸海域浒苔样品的粗蛋白含量分别为11.16%、13.21%、18.91%, 粗脂肪含量分别为1.5%、1.04%、0.67% (徐大伦等, 2003;吉宏武等, 2005;林英庭等, 2009)。综上所述, 影响藻类营养成分的因素复杂、变化多样, 设计饲料配方时应充分考虑不同品种、时间、产地对其原料的影响, 并进行实际测定, 而非完全依赖现有资料。

3.2 不同饵料饲喂下幼刺参生长情况

本实验结果表明, 青岛浒苔饵料和马尾藻饵料饲喂下, 刺参的存活率、增重率和特定生长率无显著差异, 存活率超过90%, 刺参增重20%以上, 特定生长率为(1—2)%/d, 而宁波浒苔饵料饲喂下, 刺参的增重率和特定生长率显著低于其他小组, 生长情况不佳。一方面, 马尾藻是刺参的天然饵料, 而浒苔型饵料和马尾藻饵料的刺参饲喂效果相似, 说明浒苔在动物饵料开发上具有较大潜力; 另一方面, 浒苔营养成分的影响因素繁杂, 其蛋白质含量可能是浒苔饵料开发的重要参考指标之一。针对浒苔饵料开发潜力, 杨宁(2016)刺参饲喂实验显示, 饵料中浒苔添加量为6%和9%时, 刺参的特定生长率为(1—2)%/d, 其生长效果最佳; Asino(2011)大黄鱼饲喂实验显示, 饵料中浒苔含量为5%、10%、15%时, 大黄鱼的特定生长率分别为0.96、0.99、1.00%/d, 显著高于无浒苔添加组; Yang等(2016)罗非鱼饲喂实验显示, 饵料中浒苔添加量为30、40、50g/kg时, 罗非鱼增重率为424.1%—454.4%, 显著高于无浒苔添加组。针对蛋白质含量, 夏苏东(2012)通过设置不同蛋白质水平(5%—30%)的饵料, 分析其对刺参生长的影响, 结果表明饵料中蛋白质含量为15%时, 刺参的特定生长率最高(0.98%)。而本实验中青岛浒苔组和马尾藻组粗蛋白含量分别为14.31%±0.10%和15.43%±1.41%, 在一定程度上能够解释其饲喂效果为何优于宁波浒苔组。此外, 多糖类、脂类、萜类等生物活性物质综合作用也是浒苔促进动物生长的重要机制(杨欢, 2015)。

3.3 不同饵料饲喂下幼刺参肠道消化酶活力

本实验结果表明, 青岛浒苔饵料、宁波浒苔饵料、马尾藻饵料饲喂下, 刺参肠道淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维素酶活力分别为(0.85—1.35)、(2.94—3.66)、(365.70—472.21)U/mg prot和(552.82—954.78)U/g prot; 各组之间肠道消化酶活力无显著差异。消化酶活力高低与营养吸收、生长和发育密切相关, 可用来判断动物对某种饵料的适应情况(Harris et al, 1986; Hirche, 1989), 而浒苔型饵料组与马尾藻饵料组各消化酶活力均无显著差异, 在一定程度上说明刺参对浒苔型饵料具有良好的适应性。此外, 通过与其他浒苔型饵料饲喂实验对比, 酶解、发酵等前处理手段可能有助于提高浒苔型饵料的吸收效果。李猛等(2015)使用经酿酒酵母发酵处理后的浒苔饵料饲喂刺参, 结果表明其肠道淀粉酶平均活力为5.57U/mg prot, 纤维素酶平均活力为669.83U/g prot, 胰蛋白酶平均活力为526U/mg prot, 除纤维素酶外均高于本实验结果。李猛等(2017)使用经碱性蛋白酶制剂酶解和酿酒酵母发酵处理后的浒苔型饵料饲喂刺参, 结果表明其肠道淀粉酶活力约为7.0U/mg prot, 纤维素酶活力约为680U/g prot, 胰蛋白酶活力约为520U/mg prot, 淀粉酶和胰蛋白酶活力均高于本实验结果。因此, 对浒苔型饵料进行酶解、发酵等前处理工作可能提高刺参对营养物质的吸收, 从而提高刺参生长速度。

3.4 不同饵料饲喂下幼刺参体腔液非特异性免疫酶活力

本实验结果表明, 青岛浒苔饵料、宁波浒苔饵料、马尾藻饵料饲喂下, 刺参体腔液酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶活力分别为(2.55—3.62)、(5.56—17.57)金氏单位/100mL和(289.69—328.73) U/mL, 马尾藻组碱性磷酸酶活力显著高于青岛浒苔组和宁波浒苔组, 其他非特异性免疫酶活力无显著差异。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶是刺参非特异性免疫反应中重要的水解酶, 具备识别异物、提高吞噬细胞吞噬能力、细胞损伤修复等生物学功能(Cajaraville et al, 2000; Rajalakshmi et al, 2005), 超氧化物歧化酶是刺参主要抗氧化酶之一, 与生物体对环境胁迫的适应能力密切相关(Regoli et al, 2004)。酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶活力是评价刺参免疫能力的常用指标, 马尾藻组碱性磷酸酶活力为(17.57± 4.56)金氏单位/100mL, 是浒苔型饵料组的2—3倍, 说明马尾藻促进刺参非特异性免疫的能力或优于浒苔。目前, 针对浒苔及其活性物质对生物体免疫能力的影响也存在较多研究。秦搏(2015)实验结果表明, 饵料中添加浒苔能够显著提高刺参体腔液超氧化物歧化酶活力; 徐大伦(2006)实验结果表明, 浒苔多糖能够提高栉孔扇贝血淋巴中SOD酶和溶菌酶活力。因此, 浒苔型饵料同样有利于增强刺参免疫能力, 如何充分发挥其优势还需更多研究。

4 结论

绿潮暴发时, 通过打捞浒苔用以配制刺参饵料, 既有助于缓解绿潮的生态灾害, 又能够补充刺参饵料来源, 具有广阔的生态效益和市场前景, 但是其营养成分影响因素较为复杂, 配制饵料时应充分考虑不同品种、采集时间和生长地点的差异, 并通过一些前处理手段充分发挥浒苔的饵料价值。