海洋藻毒素主要是由海洋有毒微藻产生的活性物质, 贝类等摄食了有毒微藻, 就会将毒素富集于体内, 人类食用了藻毒素污染的贝类等海产品就会中毒甚至死亡。按中毒症状, 藻毒素分为麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Poisoning, PSP)、腹泻性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning, DSP)、神经性贝类毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning, NSP)、失忆性贝类毒素(Amnesic Shellfish Poisoning, ASP)和西加鱼毒(Ciguatera Fish Poisoning, CFP)。2004年, 联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO)、联合国政府间海洋学委会(Intergovernmental Oceanographic Commission, IOC)和世界健康组织(Word Health Organization, WHO), 按化学结构将贝类毒素分为8组, 即石房蛤毒素组(saxitoxin, STX)、软骨藻酸组(domoic acid, DA)、大田软海绵酸毒素组(okadaic acid, OA)、氮杂螺环毒素组(azaspiracid, AZA)、短裸甲藻毒素组(brevetoxin, BTX)、蛤毒素组(pecenotoxin, PTX)、虾夷扇贝毒素组(yessotoxin, YTX)和环亚胺类毒素(cyclic imine, CI), 除STX和DA为水溶性的, 其他毒素均为脂溶性的, 具热稳定性, 易溶解于甲醇和乙醚等有机试剂。

目前, 我国是世界上海产品生产和消费第一大国, 近海有毒赤潮频发。本文通过对我国近海藻毒素污染状况及有毒微藻进行系统综述分析, 为促进我国海洋生态环境保护和海产品食用安全, 提供可靠科学的依据。

1 我国近海麻痹性贝类毒素污染状况及其产毒微藻 1.1 我国近海麻痹性贝类毒素污染状况

早在1978年, 就开始了长江口海域麻痹性贝类毒素的调查(林燕棠等, 1999)。尔后, 在全国其他海域相继开展了较多的调查研究, 2006—2015年, 进行了全国近岸海域麻痹性贝类毒素的系统性调查, 为全面评估我国近岸海域毒素污染状况, 提供了可靠的数据。

1.1.1 黄海

1996年首次在黄海连云港海域检出麻痹性贝类毒素(Zhou et al, 1999), 2004—2015年, 黄海近岸海域麻痹性贝类毒素污染比较严重, 尤其是2003—2008年, 北黄海虾夷扇贝体中麻痹性贝类毒素污染较重, 消化腺中毒素可达65140µg/kg; 在每年4—6月份为毒素污染高峰期(夏远征等, 2010)。1991—2003年, 连云港的织纹螺体中的麻痹性贝类毒素污染严重, 可高达220000µg/kg(表 1), 已引发多起中毒事件(林祥田等, 2005)。

1.1.2 渤海

1996年首次在渤海天津海域检出麻痹性贝类毒素(林燕棠等, 1999), 2006—2016年, 渤海近岸海域麻痹性贝类毒素逐年升高, 2015年夏季莱州湾的菲律宾蛤仔体中毒素可达60573µg/kg; 2016年春季, 秦皇岛海域的紫贻贝体中麻痹性贝类毒素可达40561µg/kg(表 2)。

1.1.3 东海

1996年首次在宁波纺纹螺体中检出麻痹性贝类毒素, 至2003年每年均有毒素检出, 含量可高达97344µg/kg(于梅等, 2004)。2015年夏季, 厦门竹蛏体内麻痹性贝类毒素含量可达23793µg/kg; 2017年福建近海贻贝体中毒素可高达34146µg/kg。近几年来, 福建近海麻痹性贝类毒素污染呈明显加重趋势(表 3)。

1.1.4 南海

1990年在广东贝类体中检出麻痹性贝类毒素(杨美兰等, 1999); 1998—2002年, 广东近海麻痹性贝类毒素污染比较严重, 1999年大亚湾扇贝消化腺中毒素含量可达227340µg/kg(江天久等, 2000a); 2003年至今, 南海近海麻痹性贝类毒素污染较轻(表 4)。

2013—2015年, 全国近海麻痹性贝类毒素调查结果表明, 甲壳动物体中麻痹性贝类毒素污染最为严重, 消化腺中毒素可高达453154µg/kg, 超标率最高, 为22.2%;其次为棘皮动物, 超标率为16.7%;再次为软体动物, 超标率为16.5%;鱼类最低, 超标率为13.8%。春季超标率最高, 为24.8%;其次是冬季, 为20.8%;再次是夏季, 为14.4%;秋季最低, 为12.6%;不同海区有所差异, 如南海冬季毒素含量偏高。全国近海麻痹性贝类毒素超标率为17.4%, 其中北黄海、东海、南黄海、渤海、南海超标率依次为21.2%、20.0%、17.0%、15.6%和9.8%;在相对外海的海域, 如黄海獐子岛和威海, 东海枸杞岛, 南海三亚和东方等海域, 麻痹性贝类毒素含量明显偏高(图 1)。

1.2 我国近海产生麻痹性贝类毒素的微藻

在我国近海发现产生麻痹性贝类毒素的常见微藻是亚历山大藻(Alexandrium spp.), 2002—2017年, 在全国近海形成24次赤潮(表 5)。仅凭普通光学显微镜观察是难以确定亚历山大藻种类的, 其中塔玛亚历山大藻研究报道的较多(Wang et al, 2005, 2008, 2011, 2014; Chen et al, 2013; Gu et al, 2013a)。根据5个不同的核糖体型, 塔玛亚历山大藻复合种已分为5个种:芬迪亚历山大藻(A. fundyense)(Ⅰ型)、地中海亚历山大藻(A. mediterraneum)(Ⅱ型)、塔玛亚历山大藻(A. tamarense)(Ⅲ型)、太平洋亚历山大藻(A. pacificum) (Ⅳ型)和澳洲亚历山大藻(A. australiense)(Ⅴ型)(John et al, 2014)。其中在黄渤海域是芬迪亚历山大藻, 长江口以南海域是太平洋亚历山大藻(Genovesi et al, 2015; Gao et al, 2015a, b)。此外, 在渤海发现了奥氏亚历山大藻(A. ostenfeldii), 在室内培养条件下, 不产生麻痹性贝类毒素C1/C2, GTX1-4(Gu, 2011), 但是可以产生STX和NEO (Gu et al, 2013a); 全球范围内, 一些地理种群的奥氏亚历山大藻还能产生spirolides等毒素(Kremp et al, 2014; Salgado et al, 2015)

链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)在我国近海可产生麻痹性贝类毒素(Gu et al, 2013b), 2005年至今, 已形成赤潮9次, 主要集中在渤海、江苏连云港和福建近海(表 6)。

巴哈马梨甲藻(Pyrodinium bahamense)可产生麻痹性贝类毒素, 在南中国海(Usup et al, 2012)及香港海域均有分布(Dickman et al, 2002)。

1.3 麻痹性贝类毒素不同检测方法结果比较分析

依据《食品安全国家标准贝类中麻痹性贝类毒素的测定》(中华人民共和国国家标准GB5009.213—2016), 我国现行麻痹性贝类毒素检测方法有:小鼠生物法、酶联免疫吸附法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法。小鼠生物法是测试所有麻痹性贝类毒素组分的毒性, 检出限低, 相当于300 μg STXeq/kg (Fernández et al, 1995; Bricelj et al, 1998), 难以确定毒素组分, 受测试动物的限制及检测程序繁琐, 不宜在基层监测单位推广应用。酶联免疫吸附法是应用检测试剂盒/试纸条, 可以快速、现场检测麻痹性贝类毒素, 既可定性又可定量, 易于在基层监测单位推广普及, 但目前国内外所有商品化麻痹性贝类毒素试剂盒/试纸条, 对麻痹性贝类毒素GTX1/4组分很少能检出(Jellett et al, 2002; 许道艳等, 2013; Harrison et al, 2016; Dorantes-Aranda et al, 2017), 而GTX1/4常常是海产品中的主要组分, 因此应用酶联免疫吸附检测麻痹性贝类毒素, 其检测结果会偏低。液相色谱法可确定已有13种参考标准物质的麻痹性贝类毒素组分, 其检测结果与小鼠生物法有着非常好的相关性, 但检测结果常常高出小鼠生物法(Wong et al, 2009), 可高出11.14%(江天久等, 2007)或49.36%(梁玉波, 2012)。这可能是小鼠生物法检测麻痹性贝类毒素的‘盐效应’及测试样品稀释比例不当所致(LeDoux et al, 2000), 毒素浓度可能被低估了60% (McFarren, 1959; Park et al, 1986)。由于液相色谱法检测麻痹性贝类毒素需要三种流动相检测程序, 十分繁琐, 现已逐渐被液相色谱-串联质谱法所取代, 液相色谱-串联质谱法检测灵敏度高, 操作简便(Zhuo et al, 2013; Mattarozzi et al, 2016; Shin et al, 2017), 其检测结果可高于小鼠生物法5—7倍(Li et al, 2012a)。

2 腹泻性贝类毒素或脂溶性海洋生物毒素污染状况及产毒微藻 2.1 我国近海腹泻性贝类毒素不同检测方法结果比较分析

20世纪70年代, 美国官方分析化学师学会(Association of Official Agricultural Chemist, AOAC)推荐小鼠生物法为检测腹泻贝毒的标准方法, 并在全球范围内广泛推荐使用。本世纪初, 随着液相色谱-串联质谱等检测技术的发展, 发现小鼠生物法检测腹泻性贝类毒素假阳性问题十分严重, 从2015年起欧盟不再使用小鼠生物法检测腹泻性贝类毒素(EU, 2011), 将液相色谱-串联质谱法确定为腹泻性贝类毒素或脂溶性毒素检测的标准方法(EU et al, 2015)。依据《食品安全国家标准贝类中腹泻性贝类毒素的测定》(中华人民共和国国家标准GB5009.212—2016), 我国现行腹泻性贝类毒素检测方法有:小鼠生物法、酶联免疫吸附法、液相色谱-串联质谱法。从1993年至今, 应用小鼠生物法检测我国近海贝类体中腹泻性贝类毒素检出率/超标率为32.3%, 应用酶联免疫吸附法超标率9.2%, 应用液相色谱-串联质谱法超标率为5%(表 7)。比较上述三种方法可以看出, 小鼠生物法检测我国近海贝类体中腹泻性贝类毒素超标率高出酶联免疫吸附法3.5倍; 高出液相色谱-串联质谱法6.4倍。

参照国际上以液相色谱-串联质谱法为检测腹泻性贝类毒素的标准方法, 可以看出小鼠生物法检测我国近海腹泻性贝类毒素假阳性问题十分严重, 应尽快废除。基层监测单位可应用酶联免疫吸附法的试剂盒/试纸条, 能检出腹泻性毒素主要组分OA和鳍藻毒素(dinophysistoxin, DTX), 酶联免疫吸附法的检测结果与液相色谱-串联质谱法一致率为79%—91%(刘仁沿等, 2008a, b; 刘丽等, 2016; Turner et al, 2016)。酶联免疫吸附法检出的超标样品, 再进行液相色谱-串联质谱法验证, 这样就可大幅度降低成本, 节省时间, 保证检测结果的可靠性。

2.2 我国近海脂溶性海洋生物毒素的污染状况

腹泻性贝类毒素是脂溶性海洋生物毒素主要组成部分, 采用液相串联质谱法除了可检出腹泻性贝类毒素OA和DTX外, 我国近岸海域还能检出的其他海洋生物毒素有, AZA、蛤毒素组PTX、YTX、螺旋形亚胺(gymnodimine, GYM)、螺环内酯毒素(spirolides, SPX)、江瑶青毒素(pinnatoxins, PnTX)、(Pteriatoxin, PtTX)、prorocentrolide和spriocentrimine等。在黄渤海海水中, 全年可检出OA、DTX1、PTX2、YTX等毒素(Li et al, 2014; 宋新成等, 2016; 宿志伟等, 2017; Chen et al, 2017, 2018; Li et al, 2017)。在渤海(Liu et al, 2017b)和南海浮游生物体(Jiang et al, 2017; )中, 可检出OA、DTX1、PTX2、YTX、homo-YTX、AZA1、GYM等毒素。在黄海和东海海域沉积物中检出OA和PTX2毒素(Wang et al, 2015; Chen et al, 2017)。

在我国近海贝类体中, 常可检出OA、DTX1、PTX2、YTX、GYM、AZA1、AZA2、SPX1等毒素(刘仁沿等, 2008c, 2014; 高春蕾等, 2010; 姚建华等, 2010; Li et al, 2010, 2012b, 2017; Liu et al, 2011, 2017c; Jiang et al, 2017; Shen et al, 2018)。2000年至今, 我国近海仅有3起OA超出欧盟等国际限量标准160µg/kg的调查研究报道, 2000年大连的菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)体中OA最高含量为440µg/kg(傅云娜等, 2003); 2009年浙江南麂岛缢蛏(Sinonovacula constricta)体中OA最高含量为2770µg/kg, 贻贝(Mytilus edulis)体中最高含量为5850µg/kg, 泥蚶(Tegillarca granosa)体中最高含量为1060µg/kg(张树刚等, 2011); 2012年宁波和宁德贻贝(Mytilus galloprovincialis)体中最高含量为2111µg/ kg(Li et al, 2012b)。1997年连云港四角蛤蜊(Mactra veneriformis)中DTX1最高含量达160µg/kg(Zhou et al, 1999), 达到欧盟等国际限量标准160µg/kg。2011年大连虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)消化腺中YTX最高含量达6680µg/kg(陈建华等, 2014)和5667.5 ± 421.3µg/kg (Liu et al, 2017), 超出欧盟限量标准3750µg/kg。

2.3 我国近海产生脂溶性生物毒素的微藻

在我国近海渐尖鳍藻(Dinophysis acuminata)等可产生OA、DTX1和PTX2等毒素(罗璇等, 2014; Li et al, 2015); 利玛原甲藻(Prorocentrum lima)可产生OA和DTX1毒素, 凯匹林纳原甲藻(Prorocentrum caipirignum)(Luo et al, 2017a)可产生OA毒素。慢原甲藻(Prorocentrum rhathymum)可产生OA等毒素(刘俏等, 2013, 勾玉晓等, 2018)。腹孔环胺藻(Azadinium poporum)可产生AZAs毒素(Gu et al, 2013c; Krock et al, 2014; Li et al, 2016; Luo et al, 2017b)。网状原角藻(Protoceratium reticulatum)可产生YTXs毒素(Liu et al, 2017)。SPX1可由奥氏亚历山大藻(Alexandrium ostenfeldii)产生(Salgado et al, 2015)。PnTX可由削廋伏尔甘藻(Vulcanodinium rugosum)产生(Selwood et al, 2014)。GYM在我国近海普遍检出, 鞍形凯伦藻(Karenia selliformis)可产生GYM(Mountfort et al, 2006), 但在我国近海至今尚未发现这一有毒微藻。

3 失忆性贝类毒素污染状况及产毒微藻

失忆性贝类毒素的主要成分为软骨藻酸(domoic acid, DA)。依据《食品安全国家标准贝类中失忆性贝类毒素的测定》(中华人民共和国国家标准GB5009.198—2016), 失忆性贝类毒素的检测方法为:酶联免疫吸附法、液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。用酶联免疫吸附法可快速检出海水、贝类、浮游植物样品中的软骨藻酸(许道艳等, 2007; 刘仁沿等, 2009; 王茜等, 2012; 刘淑娟等, 2014; 赵芮等, 2015)。用液相色谱法检测渤海14个水产动物样品, 50%检出软骨藻酸(陈西平等, 2001); 舟山附近海域贝类等水产品中检出率为64%(王恒, 2011); 南海栉孔扇贝和钝齿短桨蟹也能检出软骨藻酸(吉薇等, 2011)。用液相色谱-串联质谱法在浙江近海文蛤(宋琍琍等, 2008)和广东大亚湾浮游植物及海水可检出软海绵酸(Jiang et al, 2017)。此外, 用毛细管电泳法, 在大连近海栉孔扇贝体中检出软骨藻酸(李大志等, 2002)。上述所有调查结果表明, 我国近海虽能检出失忆性贝类毒素, 但均不超出欧盟等限量标准20mg/kg。

我国整个近海软骨藻酸产毒来源尚不清楚, 但从南海分离的拟菱形藻(Pseudo-nitzschia simulans)被证实可产软骨藻酸(Li et al, 2017)。

4 我国近海西加鱼毒素污染状况及产毒微藻

根据分子结构及地域分布, 西加鱼毒素分为太平洋西加鱼毒素(Pacific ciguatoxin, P-CTXs)、加勒比海西加鱼毒素(Caribbean ciguatoxin, C-CTXs)及印度洋西加鱼毒素(Indian ciguatoxin, I-CTXs)。从小型草食性鱼类到高营养级肉食性鱼类都已检出西加鱼毒素。全世界每年约有50000—500000人受西加鱼中毒影响(Friedman et al, 2017)。依据《食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定》(中华人民共和国国家标准GB 5009.274—2016), 西加鱼毒素的检测方法为小鼠生物法和液相色谱-串联质谱法。采用这两种方法, 2006—2008年, 我国南海近海西加鱼毒素超出欧盟等国际限量标准(0.1µg/kg)达17.4%(徐轶肖等, 2012)。2003—2013年香港市场鱼类体内西加鱼毒素检出率为85%(Wong et al, 2014)。

西加鱼毒素前驱物为冈比毒素(gambiertoxin), 由底栖甲藻冈比亚藻属(Gambierdiscus)产生。至今全世界共纪录14种冈比亚藻以及5种冈比亚藻基因型(Dai et al, 2017)。在我国近海已发现了3种冈比亚藻Gambierdiscus pacificus, G. australes 和G. caribaeus(Zhang et al, 2016), 但其毒素成分还没有报道。

5 结语

(1) 麻痹性贝类毒素在我国近海污染十分严重, 基本呈现逐年加剧的趋势。20世纪九十年代, 南海麻痹性贝类毒素污染较重; 21世纪初, 北黄海麻痹性毒素污染较重; 近几年, 渤海和福建沿岸海域麻痹性贝类毒素污染较重。主要产毒微藻有亚历山大藻和链状裸甲藻。

(2) 采用小鼠生物法检测我国近海腹泻性贝类毒素超标率32.3%左右, 采用液相色谱/质谱法检测, 仅有3起腹泻性贝类毒素超标的研究报道; 现行小鼠生物法检测腹泻性贝类毒素假阳性问题十分突出, 应尽快废止。腹泻性贝类毒素均是脂溶性的, 脂溶性海洋生物毒素在我国近海常年可检出, 虾夷扇贝毒素和鳍藻毒素偶有超标现象。脂溶性海洋生物毒素产毒微藻有鳍藻和原甲藻及原角藻等。

(3) 失忆性贝类毒素在我国近海已常有检出, 但无超标现象。产毒藻为拟菱形藻等。

(4) 西加鱼毒素在我国南海污染较重, 但毒素标准物质的匮乏, 限制了我国对西加鱼毒素的调查研究。尚未确定产毒微藻种类。

(5) 藻毒素可先经酶联免疫吸附法检测, 需要验证的样品, 再经液相色谱-串联质谱法检测, 这样可大幅度降低成本, 缩短检测时间, 提高准确率, 已成为十分成熟配套的毒素检测技术。小鼠生物法检测毒素灵敏度低, 且受受试动物供应限制, 液相色谱法操作繁琐, 这两种方法已逐渐被淘汰。