工业生产过程中会产生大量的废水, 这些废水含有大量的金属离子、氮、磷等, 排放到环境中污染土壤(余光辉等, 2015)。糖蜜酒精废醪液(molasses wastewater, MW)是糖蜜酒精生产过程中产生的无毒、有害、污染负荷高的酸性有机废水, 包含有蛋白质、氨基酸、维生素、Ca²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺等大量的无机盐和有机质, 直接排放会破坏生态平衡(周祖光, 2005; 张跃彬等, 2009; Ma et al, 2017)。因此, 寻找一种经济、有效的处理方法是解决这一问题的关键和研究热点。

与其他原料相比, 以微藻油脂作为原料生产生物柴油具有诸多的优势(Carioca et al, 2008; Stephenson et al, 2011; 方正等, 2017), 利用废水培养微藻、积累油脂(Nayak et al, 2016; Fernández-Linares et al, 2017)是废水综合利用的又一策略。Mg²⁺作为微藻生长过程中必需的微量金属元素, 是叶绿素的重要组成成分, 其存在可促进光合作用及脂肪酸生成过程中关键限速酶乙酰辅酶A (acetyl CoA)的形成, 从而有利于微藻的生长和油脂的合成(Huang et al, 2014)。

本研究利用MW培养单针藻, 考察不同浓度Mg²⁺对微藻生长及油脂合成的影响, 以及微藻对MW中COD、总氮、总磷的移除效果, 并初步探讨了微藻残渣的利用途径, 以期为糖蜜酒精废水和微藻的综合利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验原料与方法 1.1.1 实验方法

单针藻Monoraphidium sp. FXY-10, 本实验室筛选、保存, 被浓缩的MW(含水量: 28 %)由云南康丰糖业(集团)有限公司提供, 其成分如表 1所示。MW中N、P、K、Mg等含量较多, 同时含有Ca、Fe、Cu等诸多金属离子及微量的Hg、Pb、As等重金属离子, 其COD高达3016.00g/L。为了避免COD含量过高不利于微藻的生长, 因此, 将MW用蒸馏水稀释800倍作为对照组培养基(COD: 3770mg/L), 向对照组培养基中添加不同质量的MgSO₄·7H₂O, 使得最终培养基中Mg²⁺的浓度为400、800、1200、1600μmol/L作为实验组培养基, 调节pH在6.8—7.0之间, 分别装入500mL的三角瓶中(每瓶的装液量为300mL), 121℃灭菌20min。单针藻的初始接种量为0.1g/L。培养条件为:光照强度: 2.5×10³lx；培养温度: (25±1)℃；摇床转速: 150r/min。每组设置3个平行。

1.1.2 实验材料与仪器

三氯甲烷(分析纯):成都市克隆化学品有限公司；甲醇分析纯:天津市风船化学试剂科技有限公司。实验过程中主要仪器如表 2所示。

1.2 生物量和油脂含量的测定(Che et al, 2017)

生物量:根据藻细胞干重与吸光度A₇₅₀值(0.100—1.000)成线性关系, 得出微藻的生物量与A₇₅₀值的关系:

Y:生物量(g/L); X :吸光度值

测定藻液的A₇₅₀值(X), 代入公式(1), 得出微藻细胞干重。

油脂含量:将鲜藻液经8000×g离心5min, 去上清, 得到湿藻体, -80℃冷冻过夜后, 冷冻干燥。取干藻体(m₁) 0.3—0.5g与2倍质量的石英砂混合, 充分研磨。用氯仿-甲醇溶液(2:1, v/v)清洗, 并将混合液转移至50mL的离心管中, 150r/min震荡20min后, 室温下8000×g离心5min, 收集上清液于另一个已干燥称重(m₂)的离心管中。重复上述提取步骤两次, 合并3次上清液, 40℃烘干至恒重(m₃), 微藻中油脂含量η的计算公式(2)如下:

η:油脂含量

1.3 CO₂固定效率

CO₂固定效率依据下述公式(3)计算(Ketheesan et al, 2012):

F_CO2: CO₂固定效率[mg_CO2/(L∙d)]

P_b:生物量产率[mg/(L∙d)]

a:单位生物量固定CO₂的质量

1.4 脂肪酸组成检测

向提取的油脂中加入2mL的3%的硫酸-甲醇(v/v)溶液, 70℃回流4h进行脂肪酸甲酯化, 加入2.0mL的正己烷震荡提取4h, 取正己烷相进行GC-MS分析(Zhao et al, 2016)。长链饱和因子(long chain saturated factor, LCSF)、冷凝点(cold filter plugging point, CFPP)和十六烷值(cetane number, CN)根据下述公式(4)计算(Francisco et al, 2009; Tong et al, 2011)。

m:脂肪酸的百分比

1.5 MW的COD、总氮及总磷检测

MW中COD、总氮及总磷使用COD多参数光度计(HANNA-HI83399)检测, 具体检测方法如下:

COD检测方法:取出COD检测试剂HI93754B-0, 将消解管倾斜45°, 加入2.0mL的去离子水作为空白对照, 其余消解管中加入2.0mL的待测样品。拧紧盖子, 上下颠倒数次混匀。将上述消解瓶放入消解器中, 150℃, 消解2h。消解结束后趁热取出消解瓶颠倒数次混匀, 放在试管架上, 冷却至室温。将空白样品放入样品室中调零, 更换待测样品, 测定样品中COD的含量。

总氮检测方法:向HI93767B-B总氮检测试剂中, 加入过硫酸钾试剂(PERSULFATE/N)。将消解管倾斜45°, 加入0.5mL的去离子水作为空白对照, 其余消解管中加入0.5mL的待测样品。拧紧瓶盖, 用力上下震荡30s至粉末试剂完全溶解。将上述消解瓶放入消解器中, 105℃, 消解30min。消解结束后取出消解瓶放在试管架上, 冷却至室温。向上述冷却的各消解管中分别加入焦亚硫酸钠试剂(BISULFITE/N), 拧紧盖子轻摇15s混匀, 静待3min后, 各加入HI93767-0试剂, 轻摇15s混匀, 静待2min。将经过上述处理的消解管中的液体2.0mL, 加入到HI93767V试剂中, 颠倒10次混匀, 静待5min, 将空白样品放入样品室中调零, 更换待测样品, 测定样品中总氮含量。

总磷检测方法:取出HI93758V-0HR总磷检测试剂, 将消解管倾斜45°, 加入5.0mL的去离子水作为空白对照, 其余消解管中加入5.0mL的待测样品。向上述各消解瓶中分别加入PERFSULFATE/P试剂, 盖上盖子, 轻摇至粉末完全溶解, 105℃, 消解30min。消解结束后取出消解瓶放在试管架上, 冷却至室温。将消解管倾斜45°, 加入2.0mL的HI93758C-0试剂, 拧紧盖子, 颠倒数次混匀, 再向消解瓶中各加入0.5mL的HI93763B-0试剂拧紧盖子, 颠倒数次混匀。将空白样品放入样品室中调零, 更换待测样品, 测定样品中总氮含量。

1.6 统计分析

本文全部试验均设置3组平行, 利用ANOVA (SPSS19.0)一步法分析实验数据。^*P < 0.05表示差异显著, ^**P< 0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论 2.1 不同浓度Mg²⁺对微藻生长、CO₂固定效率及油脂含量的影响

MW中添加不同浓度Mg²⁺对单针藻生长的影响如图 1a所示, 微藻的生物量随着Mg²⁺浓度的不断增加而增加, 当Mg²⁺浓度为800μmol/L, 生物量达到最高(0.91g/L), 是对照组的1.62倍。继续增加Mg²⁺浓度, 微藻的生长受到抑制。张森等(2014)也得到相似研究结果, 当海水BG11培养基中Mg²⁺浓度为0.09mmol/L时, 沙漠链带藻Desmodesmus sp. WC08的生物量达到最高, 是对照组的1.2倍, 过高或过低的Mg²⁺浓度均不利于微藻生长。在微藻的生长过程中, CO₂作为唯一碳源, 其固定效率如图 1b所示, 当培养基中不额外添加Mg²⁺时, CO₂的固定效率为45.55mg/(L·d), 当MW中的Mg²⁺含量增加至800μmol/L, CO₂的固定效率逐渐增加至88.89mg/(L·d), 继续增加Mg²⁺含量, 微藻生物量降低, CO₂的固定效率降低。作为叶绿素的中心原子, 适宜的Mg²⁺浓度, 在光能及酶促作用下参与光合作用(张森等, 2014), 促进微藻吸收CO₂, 提高生物量。本实验结果表明, 向MW中添加适当浓度的Mg²⁺, 可促进MW中单针藻的生长及CO₂的吸收。

Mg不仅是植物叶绿素的组成成分, 在发酵和呼吸过程中会活化一些磷酸变位酶和磷酸激酶, 促进微藻中油脂的积累(李林等, 2012; Zhao et al, 2018)。由图 2可知, 当Mg²⁺浓度为800μmol/L, 油脂含量高达59.58%, 比对照组提高了25.99%, 同时生物量产率及油脂产率达到45.22和26.94mg/(L·d), 分别是对照组的1.62和2.03倍。有研究表明, 当培养基中Mg²⁺浓度从0增加至0.73g/L时, 栅藻Scenedesmus sp.中油脂含量逐渐增加(Ren et al, 2014)。虽然镁的浓度对链带藻Desmodesmus sp.WC08的油脂含量影响不显著, 但0.09mmol/L的镁作用下, 其油脂产率是对照组的1.2倍(张森等, 2014)。本实验中, 当MW中Mg²⁺浓度为800μmol/L时, 不仅可以提高单针藻的生物量, 还促进了油脂的积累。

2.2 Mg²⁺对单针藻Monoraphidium sp. FXY-10脂肪酸组成的影响

脂肪酸组成是衡量微藻油脂作为生物柴油原料的重要指标, 提高单不饱和脂肪酸甲酯的含量, 尤其是C18:1, 可以提高生物柴油的质量(王盛林等, 2017)。图 3显示不同Mg²⁺浓度作用下MW中单针藻脂肪酸组成变化。与对照组相比, 800μmol/L Mg²⁺作用下, 微藻中的C18:1含量增加至49.08%, 而C18:3的含量则下降12.67%, 分别为对照组的1.46和0.77倍；相同实验组中单不饱和脂肪酸含量上升至50.89%, 多不饱和脂肪酸下降至14.91%, 分别是对照组的1.45和0.73倍；实验组的不饱和度为80.72, 与对照组相比没有明显变化, 但均小于137, 可作为生产生物柴油的原料(Yu et al, 2012)。此外, MW中所培养微藻的脂肪酸LCSF、CFPP、CN值如表 3所示。CN值是衡量柴油抗爆性的指标, CN值低, 则燃料发火困难, 滞燃期长, 发动机工作时容易爆震, 欧洲柴油标准(EN 14214)指出, 生物柴油CN值的标准为不低于51 (Francisco et al, 2010)。LCSF是用来计算生物柴油的CFPP值的, CFPP值越低, 生物柴油的低温流动性能越好。由于各国所处的环境不同, 对CFPP值也有不同的规定, 而欧洲柴油标准并未对生物柴油的CFPP值提出具体的要求, 但我国(GB/T25199-2010)规定其值不高于-5℃到12℃。本实验结果表明, 以MW为培养基, 培养微藻得到的脂肪酸, 符合生产生物柴油的标准。

2.3 MW中总氮、总磷、COD的移除率

糖蜜酒精废醪液中含有大量的氮、磷等无机盐和有机质等营养物质, 未经适当的处理直接排放, 会导致水体的富营养化, 引起环境污染。

微藻对MW中总氮的移除率如图 4所示, 外源添加Mg²⁺的实验组中, 当培养基中Mg²⁺浓度为800μmol/L时, MW中总氮去除效果最佳, 从16.25下降至1.89mg/L, 移除率达到88.37%, 相比对照组提高了15.96%。藻细胞对水体内总氮的去除, 主要依靠藻细胞的同化作用, 在细胞膜上将硝酸盐转化为亚硝酸盐, 再转化为铵盐, 然后被纳入自身物质的碳骨架中(甄茜等, 2017)。添加800μmol/L的Mg²⁺培养微藻, 随着其生物量的逐渐增加(图 1a), MW中总磷的含量逐渐下降至0.076mg/L, 移除率达到93.69% (图 4), 是对照组的1.35倍。磷是能量传递和核酸合成等细胞过程的重要元素, 微藻通过底物水平磷酸化、氧化磷酸化和光合磷酸化等三种磷酸化作用, 使磷进入细胞中的ATP中, 将废水中的磷去除(甄茜等, 2017)。废水COD值是衡量废水中有机物污染程度的综合指标。仅以MW培养微藻, 对照组COD值从3770下降至791mg/L, 而当MW中的Mg²⁺含量为800μmol/L时, COD值最终达到453mg/L, 相比对照组降低了42.73%, 同时COD移除率达到87.98% (图 4d), 是对照组的1.11倍。

在本实验结果表明, Mg²⁺促进了MW中单针藻生长(图 1), 因此需要更多的氮(图 4)纳入自身的碳骨架, 以及更多的磷(图 4)形成ATP供给生命活动。已有研究表明, 利用光合细菌(PSB001)处理污水, COD的移除率最高可以达到87.5%, 但去除量仅有375.0mg/L (王冰等, 2018)。将1%的废水净化菌Lysinibacilus sp. S6菌株接种到糖蜜酒精废醪液中, COD的移除率最高, 可达到71.00%, 氨氮移除率为21.90%, 对总磷的去除效果不理想(郑先虎等, 2017)。本实验利用微藻处理MW废水, 其中总氮、总磷和COD的移除率可达到88.37%、93.69%和87.98%。此外, 魏鹏骥等(2018)的研究结果显示, 当受到氮饥饿等环境因素的胁迫时, 微藻会倾向于转变生理代谢途径, 合成较多的油脂(图 2)作为储能物质, 这样有利于其在不利的环境中存活。

2.4 微藻的资源化综合利用

水和营养物质是微藻培养过程中不可缺少的成分, 而利用废水中的营养物质无疑可以降低微藻培养的成本, 同时还可以起到净化污水的目的。本实验利用MW作为微藻培养的基础培养基, 由图 5可知, 利用每千克的MW经稀释800倍后(800L培养基)可以培养得到单针藻728g的, 其中包含有433.74g的油脂和294.26g的微藻残渣。近期研究结果显示, 利用乳制品工业废水培养绿藻A. dimorphus, 其生物量仅为0.84g/L (Chokshi et al, 2016), 经计算, 728g的微藻最终可得到339.32g的生物柴油。微藻中含有丰富的蛋白质、多糖、维生素及矿物元素等多种营养物质, 将微藻作为幼体动物的饵料, 相比人工饵料, 具有促进幼体生长, 提高幼体成活率等作用(杨贤庆等, 2015; 赵震宇等, 2017), 而将藻类残渣作为牡蛎稚贝的食物来源(GB/T 7714), 为微藻的资源化综合利用提供了一种新的策略(Chokshi et al, 2016)。

3 结论

(1) Mg²⁺作为微藻生长过程中重要的金属离子, 促进了单针藻Monoraphidium sp. FXY-10的生长和油脂的积累。以MW作为培养基, 添加800μmol/L的Mg²⁺, 微藻的生物量和油脂含量最高分别达到0.91g/L和59.58%, 生物量产率和油脂产率分别为45.22和26.94mg/(L·d)。

(2) 在800μmol/L的Mg²⁺的作用下, 单针藻降低了MW中总氮、总磷及COD值, 其移除率分别为88.37%、93.69%和87.98%。

(3) 每千克MW经蒸馏水稀释800倍后, 添加800μmol/L Mg²⁺培养单针藻, 可制备339.32g的生物柴油, 同时单针藻残渣可以作为牡蛎稚贝的食物来源, 提高微藻的利用率。