活性肽是含有数个到数十个氨基酸的多肽类物质。目前的研究发现, 富含生物活性肽的酶解液具有药用价值, 例如, 牡蛎肽在降血糖、抗肿瘤等方面具备特殊的生理活性(方磊等, 2018); 扇贝裙边活性肽可以改善小鼠对血糖浓度的调节能力, 对机体的糖耐受能力具有一定的增强作用(延海莹等, 2018)。金枪鱼(Thunnus sp.)营养价值很高, 含有丰富的DHA和EPA(马振华等, 2006), 但在加工过程会产生大量下脚料, 包括鱼头和内脏等, 其中胰腺作为金枪鱼主要的消化腺, 蛋白质含量丰富, 质量约占内脏下脚料的27%(鳃除外)。为提高金枪鱼下脚料的利用率, 利用胰腺来制备生物活性肽、实现金枪鱼加工废弃物高值化利用。由于酶解液是组成、丰度和肽链长度均不同的多肽混合物, 传统借助细胞模型、动物模型等来筛选和验证多肽酶解液的功能, 是一项费时费力的工作(Han et al, 2018)。因此, 迫切需要一种可以直接高通量预测酶解液中活性肽功能的策略, 减少酶解液功能筛选过程中的工作量和不确定性。Discovery Studio(以下简称DS)是新一代分子建模软件。最近研究表明, 通过DS软件对灵芝次生代谢产物进行预测分析。董丽莎利用DS软件中CDOCKER模块将所得的优势肽与抗氧化相关的Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)进行分子对接, 研究黑线鳕鱼皮胶原蛋白酶解多肽对UVB诱导HaCaT光损伤的抑制作用, 并通过细胞实验得到验证(董丽莎等, 2018)。

本研究中以金枪鱼(Thunnus sp.)胰腺为原料, 制备酶解液, 利用MALDI-TOF/TOF-MS测定金枪鱼胰腺酶解液中的多肽组分及其丰度, 通过Discovery Studio软件预测优势肽的功能, 最后通过细胞实验进行验证, 为酶解液的功能组分鉴定提供了新的思路。

1 材料与方法 1.1 材料

金枪鱼(Thunnus sp.)胰腺取于宁波今日食品有限公司; 胰岛素瘤细胞(INS-1)细胞株购于上海瑞路生物技术有限公司; RPMI-1640培养基购于美国Hyclone公司; 胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)购于美国Gemini公司; 二甲基亚砜(DMSO)购于美国Amresco公司; 噻唑蓝[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl, MTT]购于美国Sigma公司; β-巯基乙醇购于美国Gibco公司; AnnexinV-PI双染凋亡检测试剂盒购于美国BD Pharmingen公司; 大鼠胰岛素(INS)ELISA试剂盒购于宁波百川生物公司; 磷酸盐缓冲液(Phoshate Buffered Saline, PBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素、胰酶、RIPA细胞裂解液和Hanks缓冲液购于上海碧云天公司。

1.2 方法 1.2.1 金枪鱼胰腺活性肽的制备

将金枪鱼胰腺清洗、沥干后于组织搅碎机打碎, 经胰蛋白酶在酶浓度为1.23%, 温度为52.95℃条件下水解1.75h, 随后100℃加热10min灭酶活, 4000r/min离心10min获得上清液, 采用1kDa的超滤膜(购于美国Millipore公司)截留酶解液, 制备低分子量多肽, 并在真空冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)中冷冻干燥24h得到活性肽冻干粉(Han et al, 2018)。用无糖RPMI-1640培养基溶解活性肽冻干粉并过滤除菌, 制成浓度为10mg/mL的储备液备用。

1.2.2 多肽组成分析

在质谱仪分析前, 将酶解产物加入60μL含有0.2%甲酸和2mmol/L醋酸钠的甲醇/水(50/50, V/V)中, 将样品(0.5mL)直接置于MALDI板上, 并与等量体积的二羟基苯甲酸混合(Je et al, 2009)。使用MALDI-TOF/TOF串联质谱(MALDI- TOF/TOF购于美国Applied Biosystem公司)获得多肽质谱图。结果用MASOT数据库和NCBI分析得到多肽的序列。用一级质谱法测定其准确分子量, 用二级质谱法测定其氨基酸序列(董丽莎等, 2018)。

1.2.3 金枪鱼胰腺多肽功能预测 1.2.3.1 构建多肽结构和反向找靶

首先, 利用DS软件构建多肽的结构, 用DS中“构建和编辑蛋白”(“Build and Edit Protein”)模块将1.2.2获得的多肽氨基酸序列输入, 并通过“配体优化”(“Minimize Ligands”)模块中的Full Minimization功能将其能量最优化, 以获得最佳能量的多肽3D结构; 然后, 使用DS中的“准备配体”(“Prepare Ligands”)程序生成多个构象。该过程使用DS配体分析工具执行。在这项工作中, 我们使用Pharma DB作为目标数据库, 参数被设置为PharmaDB药效团的形状, 输入药物中最具选择性的药物团, 其他参数设置为默认值。

1.2.3.2 分子对接

从蛋白数据库(PDB)中获得具有Fit-value值大于3的药效团进行模拟对接。将Fit- value值大于3的蛋白在DS中打开后, 去水加氢, 并用“准备蛋白”(Prepare Protein)模块对蛋白进行预处理, 包括缺失的loop的补充, 在不同pH条件下的质子化状态等。该过程使用“分子对接”(Receptor-Ligand Interactions)模块的CDOCKER工具执行。在此过程中, 从PDB中下载蛋白作为受体, 将多肽设置为配体。配体受体复合物的能量评分决定了配体和受体蛋白是否结合。

1.2.4 多肽对INS-1细胞氧化损伤的作用 1.2.4.1 细胞悬液的制备

INS-1细胞用含10%胎牛血清、50μmol/L的巯基乙醇、1% 100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液(即为10%FBS培养基)于37℃、5% CO₂细胞培养箱中贴壁培养(CO₂培养箱购于上海精密仪器仪表有限公司)。每2d更换一次培养基, 当细胞生长到覆盖培养瓶底壁表面的70%—80%时, 用0.05%含EDTA的胰酶消化, 离心后计数, 调整到10⁵个/mL备用。

1.2.4.2 多肽对氧化损伤INS-1细胞增殖活性的作用

对细胞进行分组, 分为正常对照组(10% FBS的INS培养基100μL/孔); 模型组(H₂O₂氧化损伤组, 80μL含10% FBS的INS培养基和20μL 200μmol/L H₂O₂); 活性肽高剂量组(HDAP, 1mg/mL的酶解液10μL、70μL含10% FBS的INS培养基和20μL 200μmol/L H₂O₂)和活性肽低剂量组(LDAP, 0.1mg/mL的酶解液10μL、70μL含10% FBS的INS培养基和20μL 200μmol/L H₂O₂), 将1.2.4.1制备的处于对数生长期的细胞悬液接种于96孔培养板中, 每组细胞都有3个复孔, 培养24h后, 每孔加入50μL 2mg/mL MTT, 4h后弃培养液, 加入150μL二甲亚砜(DMSO), 在570nm波长处检测(酶标仪为美国Molecular Devices公司)测各孔吸光度值(董丽莎等, 2018)。

增殖率计算公式如下:

1.2.4.3 多肽对氧化损伤INS-1细胞凋亡的影响

将INS-1细胞按“1.2.4.2”项下分组处理, 以10⁵/mL接种于96孔板, 培养48h后, 利用AnnexinV-PI双染凋亡检测试剂盒做细胞凋亡处理, 将样品于冰上避光放置, 并于1h内于激发波长488nm, 发射波长525nm条件下利用流式细胞仪检测细胞凋亡水平(流式细胞仪购于美国Beckman Coulter公司), 并用Modfit LT软件分析凋亡率(李晔等, 2012)。

1.2.4.4 多肽对氧化损伤INS-1细胞胰岛素分泌的影响

选取对数生长期的INS-1细胞, 按“1.2.4.2”项下分组处理, 按10⁵/孔接种于24孔板中, 培养24h后去除原培养液, 以无糖Hanks液洗涤3次, 分别添加含5.6mmol/L或16.7mmol/L葡萄糖的Hanks液50μL, 37℃孵育1h后, 分别收集上清液, 采用ELISA法测定上清液中的胰岛素含量(郑书国等, 2015)。

1.2.5 数据分析

数据用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析, 结果以平均值±标准差形式表示, P值小于0.05则认为差异显著。

2 结果与分析 2.1 金枪鱼胰腺酶解液多肽组成和丰度

利用MALDI-TOF/TOF-MS从胰蛋白酶的水解液中共检测到988个峰, 其中有3个相对较强的质谱峰, 其质核比(m/z)分别为556.2504、511.2240和570.2549。选择它们作为母离子进行二级质谱处理, 得到3个优势多肽, 分别为G-PQV-R、G-LPP-K和E-HE-R(表 1和图 1)。

2.2 优势肽的反向找靶结果

通过DS软件的反向找靶功能, 对这三种多肽的活性进行筛选结果如表 2所示, G-PQV-R与编号为5dad-02, 1m4d-05和1tyr-06的药效团结合; G-LPP-K与编号为5dad-01和1o86-01的药效团结合; E-HE-R与编号为5dad-01, 1m48-04和3d9k-08的药效团结合。编号为5dad的药效团是Keap1蛋白, 它是细胞氧化应激的重要调节因子。三种多肽均可与Keap1结合, 且Fit-value值均为最高。因此, 我们初步推测Keap1是三种优势多肽的潜在靶标蛋白。

2.3 分子对接模块复筛预测的功能

经过反向找靶, 初步推测优势多肽G-PQV-R、G-LPP-K和E-HE-R的靶标蛋白为Keap1。为了进一步确认上述推测, 使用DS软件中的分子对接模块, 对G-PQV-R、G-LPP-K和E-HE-R与Keap1之间的互相作用进行验证。CDOCKER分子对接主要根据受体与配体相互作用的能量(CDOCKER interaction energy, E_CI), 范德华力(van der Waals Energy, E_VDW)等信息来确定结合程度。E_CI值越低表示分子对接过程中受体与配体的相互作用越小, 结合的越紧密。如表 3所示, 配体小分子G-LPP-K与受体蛋白结合所需的能量最低, 结合最紧密。如图 2可看出, 参与G-LPP-K配体小分子与Keap1中的相互作用的氨基酸残基共16个, 其中配体小分子与赖氨酸, 精氨酸和天冬氨酸形成电荷吸引力, 与苏氨酸, 天冬氨酸, 精氨酸, 谷氨酰胺, 赖氨酸和丝氨酸形成氢键能, 与甘氨酸和谷氨酰胺形成碳氢键能, 与异亮氨酸, 酰胺酸和苯丙氨酸形成烷基键能和PI烷基键能; G-QPV-R配体小分子与Keap1中的相互作用的氨基酸残基共14个, 其中配体小分子与精氨酸和天冬氨酸形成电荷吸引力, 与苏氨酸, 甘氨酸, 谷氨酰胺和赖氨酸形成氢键能, 与异亮氨酸, 酪氨酸, 亮氨酸和色氨酸形成烷基键能和PI烷基键能; E-HE-R配体小分子与Keap1中的相互作用的氨基酸残基共10个, 其中配体小分子与天冬酰胺, 苏氨酸, 天冬氨酸, 甘氨酸和谷氨酰胺形成电荷吸引力, 与苯丙氨酸和谷氨酰胺形成碳氢键能。综上所述, 金枪鱼胰腺酶解液中的优势多肽可以通过多种作用力与靶标蛋白Keap1结合, 预测其具有抗氧化的活性功能。

2.4 抗氧化功能的研究 2.4.1 促进氧化损伤的INS-1细胞的增殖

与对照组(细胞活力为100%±1.3%)相比, 模型组的细胞活力显著下降(P < 0.01), 仅为对照组的22%±2.3%;经高、低剂量金枪鱼胰腺酶解液处理后, 细胞活力较模型组显著升高(P < 0.01), 且细胞活力随胰腺酶解液浓度的增加而增加。分别将细胞活力恢复到对照组的63%±1.5%和44%± 2.8%(图 3)。金枪鱼胰腺酶解液可以增强氧化损伤的INS-1细胞的细胞活力, 对氧化损伤的INS-1细胞的增殖具有一定的促进作用。

2.4.2 抑制氧化损伤INS-1细胞的凋亡

由图 4可知, 与正常对照组(细胞凋亡率6.43%±0.79%)相比, 模型组细胞凋亡率显著升高到79.17%±4.56% (P < 0.01)。与模型组相比, 金枪鱼胰腺酶解液高剂量和低剂量处理使得细胞凋亡率显著降低, 分别降低到43.2%±1.73% (P < 0.01)和28.9%±1.32% (P < 0.01)。金枪鱼胰腺酶解液能够显著抑制H₂O₂诱导的INS-1细胞凋亡。但是, 随着胰腺酶解液浓度的增加, 对细胞凋亡的抑制活性反而降低。

2.4.3 改善氧化损伤的INS-1细胞的胰岛素分泌

胰岛素由人体胰脏胰岛分泌的。正常时, 葡萄糖摄入增加促进胰岛分泌胰岛素增多, 葡萄糖摄入不足胰岛素分泌会明显减少。由图 5可知, 当葡萄糖浓度为5.6mmol/L时, 与正常对照组(24h的胰岛素分泌量为3.75±0.02mIU/L)相比, 模型组胰岛素分泌量显著减少到2.65±0.35mIU/L (P < 0.01), 金枪鱼胰腺酶解液高剂量和低剂量处理后, 胰岛素分泌量较模型组显著升高, 分别为3.45±0.23mIU/L (P < 0.01)和3.15± 0.19mIU/L (P < 0.01)。当葡萄糖浓度为16.7mmol/L时, 与正常对照组(24h胰岛素分泌量为6.15±0.02mIU/L)相比, 模型组胰岛素分泌量显著减少到3.65± 0.24mIU/L (P < 0.01), 金枪鱼胰腺酶解液高剂量和低剂量处理后, 胰岛素分泌量较模型组显著升高到5.75±0.18mIU/L (P < 0.01)和4.95±0.22mIU/L (P < 0.01)。随着葡萄糖摄入量增加, 胰岛素分泌水平整体增加, 金枪鱼胰腺酶解液能够显著改善氧化损伤的INS-1细胞的胰岛素分泌, 且改善效果呈剂量效应增加。

3 讨论

分子对接方法已成为药物设计中比较成熟的方法, 它能够准确预测蛋白质受体与配体间的结合位点, 指导和解释实验现象(段爱霞等, 2009)。刘广斌等(2016)已通过DS模拟Hsrad51蛋白与多肽brc4的分子对接, 为研究Hsrad51蛋白与其他重复基元的分子对接以及相互作用提供了重要依据。成功预测独活寄生汤对TNF-α和IL-1β作用的活性成分(郑春松等, 2012)。反向找靶是研究多肽功能和药物作用活性位点的重要工具(Chen et al, 2014; Grienke et al, 2015)。通过反向找靶预测多肽功能, 如抗高血压、细胞生长调节、抗肿瘤活性、免疫系统调节等(Han et al, 2018)。

金枪鱼的胰腺质量约占内脏下脚料的27%(鳃除外), 并且胰腺蛋白质含量丰富。其多肽G-LPP-K, E-HE-R和G-QPV-R为金枪鱼胰腺酶解液的优势肽, 反向找靶技术预测了G-LPP-K, E-HE-R和G-QPV-R三种多肽均可与Keap1结合, 细胞学实验结果表明, 金枪鱼胰腺酶解液高剂量和低剂量处理后, 细胞活力较H₂O₂氧化损伤组显著提高, 凋亡率从79.17%分别下降到43.2%和28.9%;胰岛素的分泌量从3.65mIU/L分别增加到5.75mIU/L和4.95mIU/L。金枪鱼胰腺活性肽具有显著的抗氧化活性, 对H₂O₂损伤INS-1细胞具有明显的保护作用, 促进INS-1细胞的胰岛素分泌。

大量研究表明氧化应激与多种慢性病和急性病有着密切的联系, 常见的有心血管疾病、癌症、神经紊乱、糖尿病、缺血再灌注和衰老(Ryoo et al, 2001)。而生物活性肽以多种方式发挥其抗氧化的特性, 包括清除自由基、抑制ROS的产生以及抑制促炎细胞因子的释放等(蔡江佳等, 2015; 童茜茜等, 2016)。金枪鱼胰腺酶解液使机体形成了一个复杂的氧化应激反应系统, 调控上游区域的抗氧化反应元件(ARE), 以缓解氧化损伤对机体的损伤(Itoh et al, 2003)。Nrf2是调节氧化应激的关键转录因子(Stewart et al, 2003), Keapl-Nrf2/ARE作为一种有效的抗氧化调节途径, 抑制Keap1活性激活Nrf2/ARE信号通路的抗氧化应激, 在细胞防御和降低机体氧化应激中发挥了重要作用(Rubiolo et al, 2008)。因此, 多肽可以通过抑制Keap1的活性, 实现细胞抗氧化的目的。

多肽的特定生理功能与其分子结构中的氨基酸数量、组成、排列顺序及分子构象密切相关(Zhang et al, 2010)。在本实验中, 金枪鱼胰腺酶解多肽的分子对接结果显示, 与Keap1相互作用的共同氨基酸有赖氨酸, 精氨酸, 天冬氨酸, 苏氨酸, 谷氨酰胺, 丝氨酸, 甘氨酸, 异亮氨酸, 络氨酸, 苯丙氨酸。其中, 络氨酸, 苯丙氨酸, 异亮氨酸为疏水性氨基酸, 天冬氨酸为酸性氨基酸, 其组成的独特的空间结构, 使得金枪鱼胰腺酶解多肽较单独的疏水性氨基酸和酸性氨基酸, 具有更强的抗氧化性能(杨兵等, 2011; 王宁丽等, 2016; 张晶等, 2016)。

4 结论

金枪鱼胰腺水解多肽G-PQV-R、G-LPP-K和E-HE-R能增强氧化损伤的INS-1细胞的细胞活力, 促进这些细胞的增殖, 抑制细胞凋亡, 改善氧化损伤的INS-1细胞的胰岛素分泌, 且改善效果呈剂量效应增加。