与其他无脊椎动物一样, 贝类缺乏适应性免疫系统, 而主要依靠先天性免疫系统防御各种病原和外来物质的入侵, 以维持机体的正常生命活动; 非特异的先天性免疫防御被认为是宿主对抗细菌、真菌以及病毒等病原入侵的第一道防线。补体系统作为先天性免疫系统的重要组成部分, 是迄今所知机体中最复杂的一个限制性蛋白水解系统(limited proteolysis system), 其不仅联系着先天免疫和获得性免疫, 而且广泛参与多种生理和病理过程(Beutler, 2004)。由补体系统介导的生物学功能包括吞噬作用、细胞溶解、炎症、免疫复合物溶解、凋亡细胞清除及促进体液免疫应答等(Schmidt et al, 2000)。

自19世纪末被发现以来(Fujita et al, 2004a), 补体系统在哺乳动物中得到了广泛的研究。补体系统必须被激活以启动一系列的生化反应, 才能表现出各种免疫效应, 并最终导致外来病原的裂解和破坏。高等动物中补体的激活过程分为前端反应和末端通路两个阶段; 按激活物及激活顺序的不同, 前端反应又可分为三条途径, 即经典途径(classic pathway)、凝集素途径(lectin pathway)和替代途径(alternative pathway); 三条途径具有共同的末端通路(terminal pathway), 并形成膜攻击复合物(membrane attack complex, MAC)。此外, Huber-Lang等(2006)发现小鼠血浆中的凝血酶(thrombin)分子可替代C3依赖型C5转化酶切割C5分子, 并由此提出了一条经凝血素(prothrombin)介导的补体激活途径。

补体系统是一种古老的免疫防御机制, 在无脊椎动物的免疫防御中发挥重要作用, 最近在无脊椎动物中陆续发现补体组分, 使得“补体系统在低等无脊椎动物中早已形成”的推论得到进一步确认(Nonaka et al, 2001; Smith et al, 2001; Dishaw et al, 2005)。如在玻璃海鞘(Ciona intestinalis)和文昌鱼(Branchiostoma floridae)的基因组中发现了数百个含补体相关结构域分子(Azumi et al, 2003; Huang et al, 2008); 在昆虫等无脊椎动物中发现模式识别分子(Pattern recognition receptor, PRR)及丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)、纤胶凝蛋白(ficolin)、甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine protease, MASP)、C3、C2和补体因子B等补体样分子(Matsushita et al, 2001; Nonaka et al, 2001; Blandin et al, 2004; Fujita et al, 2004b); 另外, 刺胞动物中也发现了C3样分子、B因子/C2以及参与形成MAC的蛋白分子(Nonaka et al, 2006; Miller et al, 2007)。基于海胆(Strongylocentrotus purpuratus)原始补体系统的研究, Smith等(2001)提出由C3、B因子及MASP等组成的补体替代途径和凝集素途径在棘皮动物(海胆)和尾索动物(海鞘)中早就已出现。最近, Wang等(2017)系统分析了太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)全基因组数据中补体样组分的结构域和系统进化关系, 提出贝类补体系统可能通过替代途径激活。目前, 受限于少数无脊椎动物补体系统的研究结果以及全基因组信息, 无脊椎动物补体系统的组成及其激活途径的研究工作进展缓慢, 而对于贝类补体系统的研究工作更是匮乏。

近年来, 高通量测序技术的发展为研究无脊椎动物补体系统的结构特征、推断补体组分功能以及可能存在的激活途径提供了新的途径(Hibino et al, 2006; Huang et al, 2008; Zhang et al, 2012; Gerdol et al, 2015; Wang et al, 2017)。本文基于前期转录组RNA-Seq数据检索马氏珠母贝(Pinctada fucata)补体样组分, 并对其结构域和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激前后的基因表达水平进行了分析, 为深入了解马氏珠母贝免疫防御机制、探讨补体系统的进化起源提供新的依据。

1 材料与方法 1.1 马氏珠母贝的暂养、细菌刺激及总RNA提取

马氏珠母贝(Pinctada fucata)(平均壳长70mm)购自广东省湛江市徐闻迈陈珍珠贝养殖场, 暂养于室内玻璃钢水槽中(80L/槽, 20只/槽); 水温25℃, 盐度28, 饲养期间连续充气, 投喂螺旋藻粉; 每天100%换水一次。

室内暂养一周后将珠母贝分为两组(每组40只); 第一组于闭壳肌处注射0.1mL浓度为5×10⁷CFU/mL的溶藻弧菌(V. alginolyticus)悬液; 第二组于闭壳肌处注射同等体积的PBS (pH 7.4)作为对照。注射4h后, 闭壳肌采集血淋巴, 每只约0.5mL; 采集的血淋巴分装至1.5mL离心管中, 每管1mL; 4℃, 800g离心10min收集血细胞, 并立即提取总RNA。

1.2 RNA-Seq文库构建、转录组测序及数据

RNA-Seq文库构建及转录组测序的具体方法见Wang等(2016)。

转录组测序共获得70407878条Raw reads, 经去除含有接头、重复及测序质量较低的原始读数后, 获得56345139条Clean reads。使用转录组de novo组装软件Trinity (Grabherr et al, 2011)对Clean reads进行组装, 并进行去冗余处理和进一步拼接, 共得到74007条unigenes(转录组Raw reads已提交至NCBI的SRA数据库, 登录号为SRP041567)。

1.3 Unigene表达水平分析

采用RSEM软件(Version1.1.21) (Li et al, 2011)将每个样品的Clean reads比对Trinity组装的参考序列, 得到每个样品比对的每个unigene上的read数目, 并进行RPKM标准化转换(Mortazavi et al, 2008), 进而分析unigene的表达水平; 采用DEGseq方法(version 1.12.0) (Anders et al, 2010)筛选差异表达unigene, 筛选阈值为q值< 0.005且|log₂ Fold Change| > 1。

1.4 生物信息学分析

利用BLAST程序在Nt、Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG及Pfam数据库中比对unigene并获得期注释信息(E值< 1.0E^–5); 然后, 在此注释信息中检索含C1q结构域蛋白(C1q、C1qDC)、凝集素(凝集素、C型凝集素、胶原凝集素、甘露糖结合凝集素MBL)、C3、纤维蛋白原相关蛋白(fibrinogen-related protein, FREP)、丝氨酸蛋白酶、含硫酯蛋白(thioester-containing protein, TEP)、补体受体(complement receptor, CR)、补体因子及ficolin等补体样组分。采用NCBI保守结构域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)及SMART server (http://smart.embl-heidelberg.de/)进行补体样组分的蛋白结构域检测。

2 结果与分析 2.1 马氏珠母贝的补体样组分

通过对马氏珠母贝RNA-Seq转录组注释信息的检索, 共获得68条补体样成分unigene, 分别编码14个含C1q结构域蛋白、14个凝集素蛋白(含2个MBL、2个胶原凝集素及10个C型凝集素)、4个FREP、12个丝氨酸蛋白酶(含1个补体C2)、10个含硫酯键蛋白(含1个补体C4、1个补体C5、2个含硫酯蛋白及6个alpha巨球蛋白)、1个末端补体分子C6、5个补体受体、1个补体因子及7个ficolin(表 1)。

2.2 含C1q结构域蛋白、甘露糖结合凝集素、纤维蛋白原相关蛋白及纤胶凝蛋白

脊椎动物中, C1q、MBL及ficolin等均作为PRR识别外来入侵病原微生物并激活补体系统的经典途径和凝集素途径。在检索到的14个马氏珠母贝含C1q结构域蛋白(C1qDC)中, 共有11个C1qDC含有C末端球状结构域, 但均未能检测到N末端的胶原结构域。见表 2。

甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin, MBL)和能结合微生物表面的多糖, 从而激活MBL相关丝氨酸蛋白酶和C3。本文中, 2个MBL分子中均含有Lectin_leg样结构域, 但未检索到N末端胶原结构域和C型凝集素样结构域; 同时, 其他12个C型凝集素基因(C-type lectin, CTL)中均发现含有CTLD结构域。见表 3。

与MBL结构相似的ficolin也是由N端的胶原结构域和C端的糖识别结构域组成。马氏珠母贝ficolin基因中均发现了识别糖结构的纤维蛋白原样(Fibrinogen-like, FBG)结构域, 但同时, RNA-Seq数据中还发现了4个含有FBG结构域的FREP, 推测其可能具有高等动物ficolin相似的配体结合功能。见表 4。

2.3 丝氨酸蛋白酶

补体丝氨酸蛋白酶主要包括经典途径和凝集素途径中的MASP、C1r和C1s以及替代途径中的B因子和补体C2。在马氏珠母贝RNA-Seq数据中, 共发现了12个丝氨酸蛋白酶基因(包括11个丝氨酸蛋白酶和1个补体C2分子); 其中, 9个丝氨酸蛋白酶基因中含有SPC结构域, 补体C2分子中含有一个串联CCP结构域, 但未发现同时含有CCP和SPC结构域的丝氨酸蛋白酶分子。见表 5。

2.4 含硫酯键蛋白家族分子

马氏珠母贝RNA-Seq组装数据内共检索到10个含硫酯键蛋白家族分子, 包括含硫酯蛋白、补体C4/C5和alpha-巨球蛋白。保守结构域分析发现, 以上含硫酯键蛋白均具有alpha 2-巨球蛋白超家族成员的特征保守结构域, 如硫酯键位点、受体结合区、A2M_comp结构域、A2M_N结构域及A2M_N_2结构域等。然而, 组装数据中并未检索到在补体系统活化过程中起枢纽作用且与C4和C5分子同源的的补体C3分子。见表 6。

2.5 其他补体样组分

CR1、CR2、H因子、C4结合蛋白、衰变加速因子(decay-accelerating factor, DAF)和膜辅蛋白(membrane cofactor protein, MCP)同属于补体激活调节剂基因家族(regulator of complement activation, RCA)成员, 参与补体的活化调节。本研究中, 共发现5个补体受体(包含2个CR1和3个CR2)及1个H因子; 经保守结构域分析发现其蛋白质结构中均含有串联CCP结构域(SCR重复), 与RCA家族成员一致。此外, 本研究中还检索到1个补体终末途径的C6成分, 但并未发现其含有EGF(表皮生长因子)、SCR等保守结构域; 经BLASTx比对分析发现, 其氨基酸序列与弓形虫(Toxoplasma gondii)含SCR重复结构域蛋白(SCR repeat domain- containing protein)具有32%的同源性。见表 7。

2.6 补体样组分基因表达水平特征

分析溶藻弧菌刺激前后马氏珠母贝补体样组分的表达水平, 见图 1。结果表明, 68条补体样组分unigene中, 共有21条unigene表达上调, 包括C1qDC、CTL、ficolin、丝氨酸蛋白酶、C4、含硫酯键蛋白、补体受体及补体因子H。而在表达上调的unigene中, 共有12条模式识别受体unigene(包括C1qDC、CTL及ficolin), 占表达上调unigene数的57%, 这也表明模式识别受体在马氏珠母贝免疫防御过程中发挥重要作用。

3 讨论

脊椎动物补体系统是一个复杂的蛋白水解系统, 是先天性免疫系统的重要组成部分, 联系着先天性免疫和获得性免疫, 其激活后的主要效应功能表现为促进吞噬微生物病原的调理作用和补体介导的溶胞效应(Huang et al, 2008)。目前, 有关无脊椎动物补体的研究大多数以脊索动物、棘皮动物等为研究对象, 如在海鞘、文昌鱼中众多补体同源分子的发现, 并由此推测其可能具有一个依赖于凝集素的原始补体系统(Azumi et al, 2003; Huang et al, 2008)。然而有关贝类等原口动物补体同源分子及激活途径的研究目前仍处于初级阶段, 尚缺乏系统性研究。本研究中, 基于马氏珠母贝血细胞转录组数据共检索到68条补体样成分的unigene, 分别编码C1q结构域蛋白、凝集素蛋白、FREP、丝氨酸蛋白酶、含硫酯键蛋白、补体受体、补体因子及ficolin等补体组分。虽然未检索到补体系统的中心分子C3, 但这些补体同源分子的发现依然暗示它们在免疫防御中可能具有脊椎动物补体组分相似的功能, 并构成了马氏珠母贝复杂的原始补体系统。

在脊椎动物中, C1q、MBL、CTL和ficolin等补体组分通常作为模式识别受体在免疫应答过程中发挥病原识别功能并激活不同的补体途径(Nonaka et al, 2004)。而无脊椎动物补体组分, 如扇贝的C1qDC和CTL分子同样能够作为调理素参与病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMP)的识别、结合高等动物IgG抗体以及入侵微生物的清除(Wang et al, 2012a, b; Zhang et al, 2008)。此外, LPS和革兰氏阴性菌能够诱导文昌鱼C1q基因(AmphiC1q1)的表达(Yu et al, 2008); 玻璃海鞘MBL基因经LPS刺激后高度活化(Bonura et al, 2009); 而LPS、LTA及细菌可诱导文昌鱼ficolin基因(FCN1)的上调表达(Huang et al, 2011)。本研究中, 部分C1q、CTL及ficolin基因在溶藻弧菌刺激后mRNA水平也出现了上调表达(图 1), 暗示这些补体相关分子可能参与了马氏珠母贝原始补体系统的激活作用。

补体系统中的丝氨酸蛋白酶, 包括MASP家族(MASP、C1r、C1s)和B因子家族(B因子和C2)等, 在不同补体途径激活过程中发挥重要作用。目前, 海洋无脊椎动物中仅发现了文昌鱼MASPl和MASP3分子, 以及海葵(Nematostella vectensis)和真海鞘(Halocynthia roretzi)的MASPl分子, 而在其他海洋无脊椎动物中尚未有MASP家族分子的报道(Ji et al, 1997; Kimura et al, 2009)。本研究中鉴定的丝氨酸蛋白酶分子均未检测到补体控制蛋白(CCP)结构域, 这与牡蛎基因组中检索的丝氨酸蛋白酶分子结构特征一致, 推测双壳贝类丝氨酸蛋白酶在进化过程中丢失了CCP结构域(Wang et al, 2017)。B因子家族分子在文昌鱼、玻璃海鞘、海胆和欧洲沟纹蛤仔(Ruditapes decussatus)等无脊椎动物中均有发现, 虽然其分子结构同源性较高, 但仍存在一定的差异(Gross et al, 2000; Yoshizaki et al, 2005; He et al, 2008; Prado-Alvarez et al, 2009)。如海鞘的B因子在N端具有额外的2个LDLR(Low-density lipoprotein receptor, 低浓度脂蛋白受体)结构域和1个CCP结构域, 而本研究中马氏珠母贝C2分子与中国鲎(Tachyplens tridentatus)B因子在N端均具有串联重复的CCP结构域(Tagawa et al, 2012)。这些分子结构不同的无脊椎动物B因子家族成员是否具有典型的B因子/C2功能仍需要进一步的验证。

C3作为补体系统的中心组分在补体活化和生物学效应发挥过程中起着枢纽作用。因而, 研究者普遍认为C3或其类似分子的出现是低等动物补体系统产生的主要标志, 并基于C3或其类似分子研究补体的进化过程(Nonaka et al, 2004)。马氏珠母贝RNA-Seq数据中并未检索到C3分子, 仅发现了与C3同源的C4、C5分子以及同属含硫酯蛋白家族的α2-巨球蛋白和TEP分子, 这与昆虫中的研究结果一致(Nonaka et al, 2004, 2006)。在果蝇(Drosophila melanogaster)和按蚊(Anopheles gambiae)的基因组数据中同样没有发现与高等动物补体C3结构一致的分子, 而仅存在与C3同家族的TEP分子(如按蚊TEP-1分子)。功能研究发现, 病原刺激可诱导TEP-1基因的表达上调, 而且该分子具有与C3类似的、依赖分子内硫酯键的调理作用, 可以显著地促进吞噬细胞对革兰氏阴性菌的吞噬(Levashina et al, 2001; Blandin et al, 2004)。因此, 有研究者认为昆虫的TEP分子可替代补体C3并形成一个类似于脊椎动物补体系统的免疫防御系统。与此同时, 近年在太平洋螯虾(Pacifastacus leniusculus)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)和太平洋牡蛎中也发现了多个TEP分子(Zhang et al, 2007; Wu et al, 2012; Wang et al, 2017)。但目前其功能研究还较少, 尚不能确定其是否具有脊椎动物C3分子的类似功能。

免疫细胞表面的特异性补体受体可与相应的补体活性分子或调节因子结合, 介导补体调理作用等生物学功能。补体受体按其发现的先后顺序依次命名为CR1、CR2、CR3、CR4和CR5等。本研究中, 检索到2个马氏珠母贝CR1分子和3个CR2分子, 且其分子结构中均含有保守的SCR重复结构域, 与典型的CR1和CR2分子结构相一致(Ahearn et al, 1989); 基因表达量分析表明, 马氏珠母贝5个CR分子经溶藻弧菌刺激后其在血细胞中的表达量均显著上调(图 1), 推测其可能位于血细胞表面并与C3b或类似的补体活性片段结合共同发挥补体系统的功能。同时, 结合本研究中补体调节成分(H因子)的发现, 我们也可以推测马氏珠母贝可能具有以C3或类似分子为中心组分的补体系统。

4 结论

随着多种无脊椎动物全基因组序列测定的完成以及高通量测序技术的应用, 无脊椎动物补体相关成分逐渐被发现, 随之有关其功能和激活途径的研究也更加深入。本研究中, 通过对马氏珠母贝RNA-Seq转录组注释信息的检索和生物信息学分析, 共获得68条补体样成分的unigene, 包括C1q、C4/C5/C6、TEP家族蛋白、MBL、CTL、SP、CR、Ficolin以及补体因子H等; 虽然RNA-Seq数据中未发现典型的补体C3、MASP等关键补体成分, 但结合太平洋牡蛎、沟纹蛤仔等贝类补体成分的研究结果, 可以推测贝类具有补体的凝集素途径和替代途径; 同时, 这些激活途径在进化上经历了较大的变化, 其激活的具体方式仍需进一步研究; 此外, 马氏珠母贝C6样分子的发现也提示贝类补体终末途径存在的可能性。