人工增殖放流是水生生物资源养护的重要措施, 对放流效果的评价及渔业资源的管理和评估工作需要对放流鱼类进行标记, 目前较多使用的挂牌、剪鳍等标记方法存在保留时间短、成本高、操作损伤、标记量小等问题(王茂元等, 2015)。荧光染料标记方法减少了操作损伤, 适用于大规模标记放流。荧光物质标记方法的原理主要是通过用与钙具有亲和性的荧光化合物如盐酸四环素、钙黄绿素、茜素红等使其沉积于鱼类的钙化组织——耳石上以形成在荧光显微镜下可识别的化学标记(Nielsen, 1992)。盐酸四环素(Tetracycline Hydrochloride, TCH)作为荧光标记染料已经使用了近50年(Weber et al, 1962), 对太平洋鲑鱼(Oncorhynchus spp.)、美洲西鲱(Alosa sapidissima)、白鲑(Coregouns sp.)、许氏平鲉(Sebastes schlegelii)、斑马鱼(Danio rerio)等鱼类耳石的标记效果明显, 荧光标记可维持约5—24个月, 最长可保持3年半(Weber et al, 1967; Lorson et al, 1987; Yamada et al, 1987; Nagięć et al, 1988; Lü et al, 2014a;郭鹤等, 2019)。在标记放流过程中, 被标记鱼体所受的胁迫、损伤是影响成活率的关键, 荧光标记是否对标记鱼类机体产生胁迫、损伤及鱼类生理响应等方面需要加强研究。

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)是我国主要养殖鱼类, 也是内陆河流、湖泊、水库主要增殖放流和渔业捕捞种类(李思发等, 1990;谢平, 2003;张永正等, 2018), 人工增殖放流已经成为补充和恢复其天然资源的重要途径(陈文静, 2013;张永正等, 2018), 对其增殖放流效果的评估对有效了解其资源状况尤为重要。然而, 关于鲢的标记方法及效果报道较少(李小芳等, 2012;王茂元等, 2015)。为建立一种有效的TCH荧光标记鲢耳石的方法, 了解TCH标记对鲢肝脏的应激胁迫影响, 本研究首先用显微镜检的方法对TCH浸泡与药饵投喂两种荧光标记耳石的方法进行效果比较, 之后用其中一种效果较好的标记方法处理实验鱼, 运用生理生化方法对标记后鲢的肝脏转氨酶和氧化应激指标进行检测, 了解TCH标记对鲢肝脏功能的影响情况, 研究结果可为TCH标记鲢的可行性及安全性提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验鱼

鲢鱼种购于重庆市北碚区歇马鱼场。体长为17.5—20.0cm, 体重为80.0—100.0g, 该规格为三峡库区鲢增殖放流常用规格大小。实验鱼缸规格为220L(养殖水体100L), 调节室温在24—28℃, 曝气2d的自来水, pH为7.5左右, 光周期为10h:14h。购回后在恒温室内暂养7d, 期间按时按量投喂花白鲢粉料, 早晚各一次。之后挑选体质健康鱼种作为实验对象, 在进行正式实验前停食24h, 为防止饵料对实验的影响, 24h浸泡实验期间不投喂。

1.2 药饵投喂荧光标记方法及样品处理

先将TCH(上海生工生物工程公司, 分析纯粉剂)按比例称取与花白鲢粉料混合, 将明胶溶液倒入饲料中搅拌混匀, 再铺开晾干制成粉状药饵饲料。根据预试验, 设置1个对照组和3个实验组, 实验组TCH含量依次为4%、8%、12%, 各组均设3个平行重复组, 每组随机分20尾鱼, 投喂养殖密度为2尾/10L, 投喂周期为3d, 每天投喂2次。投喂结束后进行常规饲养, 每天定时投喂两次, 换水一次, 每次换水三分之一。

在药饵投喂处理后于第10、22d进行取样, 每次均在每个重复组随机选取3尾鱼, 每个投喂组共取9尾鱼, 根据本实验室前期研究发现TCH标记微耳石效果更好(郭鹤等, 2019), 解剖取出不同TCH含量下的鲢微耳石(lapillus), 清洗后用配有数码照相机(Leica DFC 495)的倒置荧光显微镜(Leica DMIL LED)5倍物镜下观察荧光标记并拍照, 标记质量判断参照欧阳斌等(1999)的方法。

1.3 荧光浸泡标记方法及样品处理

先将TCH(上海生工生物工程公司, 分析纯粉剂)溶于蒸馏水中, 配制成2g/L的母液, 然后用母液加曝气的自来水稀释配制成不同浓度的浸泡液。根据预实验, 设置1个对照组和3个实验组, 实验组TCH浓度依次为150、250、350mg/L, 所有组均设3个平行重复组, 每组随机分20尾鱼, 浸泡密度为2尾/10L, 浸泡时间为24h。浸泡结束后将鱼转移至正常水体中饲养, 每天定时投喂两次, 换水一次, 每次换水三分之一。浸泡处理后第1、2、5、10、22d, 每次均在每个平行重复组随机选取3尾鱼, 每个浓度组共取9尾鱼, 用浓度为0.2g/L的MS-222快速麻醉, 尾静脉采血, 然后在冰盘上剥离出肝脏用液氮速冻并称重, –80℃保存待测。抽取的血样在4℃静置2—4h后, 用冷冻离心机(4℃)以3000r/min离心10min, 吸取上清液待测。同时在浸泡处理后于第10、22d分别解剖取出不同浓度下的鲢微耳石(lapillus), 显微镜检方法同1.2。

1.4 浸泡荧光标记生化指标测定

将离心所得血清分别取500μL装于5mL离心管中, 用试剂盒测定血清生化指标谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性(四川省新成生物科技有限责任公司)。取出冻存的肝脏, 按照质量体积比1:9加入生理盐水, 置于冰上充分匀浆后, 用冷冻离心机(4℃)以3000r/min离心10min, 取上清液, 用试剂盒测定肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)、总蛋白(TP)含量(南京建成生物工程有限公司)。

1.5 数据分析

实验数据用SPSS18.0进行统计分析, 采用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)进行分析, 最小极差法(LSD)比较组间差异, Microcal Origin6.0作图处理, 实验结果用平均值±标准偏差(Mean±SD)表示, P < 0.05时表示有显著性差异, P < 0.01时表示有极显著性差异。

2 结果 2.1 TCH药饵投喂荧光标记效果

TCH药饵投喂处理3d, 4%、8%、12%含量的鲢鱼种在投喂过程中及投喂后22d, 均无死亡个体, 摄食及活动能力与对照组无明显区别。在蓝色激发光I₃下观察投喂结束后第10、22d的鲢微耳石, 标记率为100%。但是同一观测时间点, 随着药饵TCH含量升高, 微耳石上的荧光强度变化不规律, 标记效果不稳定(图 1)。

2.2 TCH浸泡荧光标记效果

TCH溶液浸泡处理24h, 150、250、350mg/L浓度中的鲢鱼种在浸泡过程中及浸泡后22d, 均无死亡个体, 摄食及活动能力与对照组无明显区别。在蓝色激发光I₃下观察浸泡结束后第10d、22d的鲢微耳石, 标记率100%。同一时间下, TCH浸泡液浓度越高, 微耳石上的荧光标记强度越高, 标记效果越好, 350mg/L组标记效果最明显(图 2)。

2.3 TCH浸泡标记鲢血清转氨酶活性变化 2.3.1 血清ALT酶活性的变化

TCH浸泡处理后的第1d, 各浓度组ALT活性与对照组[(23.43±3.69)U/L]相比分别极显著升高至(32.15±1.96)、(32.71±5.92)和(41.75±4.50)U/L (P < 0.01)。第2d 150mg/L浓度组ALT活性下降至对照组水平[(23.39±2.74)U/L], 250mg/L和350mg/L浓度组ALT活性仍有极显著升高, 第5d之后虽有波动, 但均与对照组无显著差异, 直至处理后第22d(图 3)。

2.3.2 血清AST活性的变化

TCH浸泡处理后第1d, 250mg/L和350mg/L浓度组AST活性与对照组[(83.00±5.11)U/L]相比极显著升高至(97.98±3.59)U/L和(115.08±3.72)U/L (P < 0.01), 150mg/L浓度组出现略微降低, 但差异不显著, AST与ALT同为反映肝功能状况的指标, 其变化趋势与ALT基本一致。处理后第2d除250mg/L浓度组外, 其他组AST活性出现下降, 在第5d降至与对照组水平[(85.88±6.09)U/L]无显著差异(图 4)。

2.4 肝脏MDA含量和抗氧化酶活性变化 2.4.1 肝脏MDA含量的变化

TCH浸泡后第1d, 各浓度组与对照组氧化损伤指标MDA含量[(276.78±29.23)nmol/mg prot]相比分别极显著升高至(438.11±61.15)、(472.25±27.98)和(548.51±18.97)nmol/mg prot (P < 0.01), 但在第2d MDA含量即开始出现大幅度下降, 均极显著低于(279.27±18.79)nmol/mg prot的对照组含量(P < 0.01), 从第2d到第10d, 期间除10d时150mg/L浓度组MDA最先恢复到与对照组(209.44±26.74)nmol/mg prot无显著差异外, 到第22d各浓度组均恢复到与对照组[(240.33±13.82)nmol/mg prot]无显著差异(图 5)。

2.4.2 肝脏SOD活性的变化

TCH浸泡处理后第1d, 150mg/L浓度组SOD活性与对照组[(403.26±25.76)U/mg prot]相比, 显著升高至(561.86±39.71)U/mg prot (P < 0.05), 250和350mg/L浓度组SOD活性极显著升高至(574.25±63.36)和(583.96±64.17)U/mg prot (P < 0.01), 标记后第2d除150mg/L组外, 其余两组SOD活性与对照组[(395.62±52.93)U/mg prot]无显著差异, 从第5—22d各组均恢复至与对照组无显著差异的水平(图 6)。

2.4.3 肝脏CAT活性的变化

TCH浸泡后第1d, 150mg/L浓度组CAT活性与对照组[(20.48±2.88)U/mg prot]相比, 显著升高至(26.52±0.93)U/mg prot (P < 0.05), 250mg/L浓度组CAT活性与对照组相比极显著升高至(39.18±4.03)U/mg prot (P < 0.01), 350mg/L浓度组略有升高, 但不显著, CAT是与SOD相关联的抗氧化酶, 本实验中其活性变化趋势与SOD基本一致; 在第2d CAT活性下降至与对照组水平[(23.60±2.82)U/mg prot]无显著差异, 其中350mg/L浓度组例外, CAT活性在第2d下降到(13.66±2.74)U/mg prot, 极显著低于对照组(P < 0.01), 到第5d至22d各浓度组均与对照组水平[(24.95±3.86)U/mg prot]无显著差异(图 7)。

3 讨论 3.1 TCH荧光标记鲢耳石的效果

荧光标记能够较好地用于短时间、大规模标记鱼类(耿倩等, 2016), TCH作为荧光物质已经在鱼类的标记放流中使用了近50年, 标记效果稳定可靠(Weber et al, 1962)。对TCH标记的鱼类耳石目前多采用紫外激发光和蓝色激发光进行观察(何春林等, 2008;郭鹤等, 2019), 根据本实验室前期斑马鱼的荧光浸泡标记研究结果(郭鹤等, 2019), 本研究采用蓝色激发光I₃进行鲢鱼种微耳石的荧光标记效果鉴定, 结果在TCH各浓度组浸泡的鲢微耳石上均检测到黄绿色荧光及标记轮, 并且随着浸泡浓度增加, 耳石上的荧光强度也越明显, 其中350mg/L浓度的TCH溶液浸泡标记效果最明显。

药饵投喂的各含量组鲢微耳石虽然可以被TCH标记, 但标记在荧光显微镜下观察到的效果不稳定, 标记效果在不同个体之间差异较大, 原因有几个方面。一方面, 鲢虽然是滤食性鱼, 但是食道对食物团的吞咽是主动的, 饲料中添加TCH可能导致适口性下降, 导致摄食减少; 另一方面, 不同个体间在摄食量和肠道吸收上会有差异, 这些因素综合叠加导致标记的均一性较差, 很难在同批次标记鲢的耳石上形成稳定的荧光标记。比较两种不同标记方式, 浸泡方式操作方便, 被标记鱼是被动吸收, 结果均一, 因此, 本研究结果表明, 浸泡方式比药饵投喂更适合对鲢鱼种进行荧光标记。

在使用荧光物质标记放流鱼类时, 要综合考虑荧光染料的成本、浸泡浓度、标记效果、对标记鱼类的安全性及标记可保持时间等多方面因素(Taylor et al, 2005)。有研究表明四环素类荧光标记最长可保持3年半(Lorson et al, 1987; Yamada et al, 1987), 由此推断TCH标记鲢也可长时间保持沉积在骨质的耳石中。此外, TCH与茜素络合物、钙黄绿素和茜素红S等其他荧光染料相比, 短时间可代谢的抗生素, 不会长时间残留在鱼体(徐维海等, 2004), 食用是安全的。此外, 作为抗生素还可以预防或治疗放流操作过程所致的损伤感染, 减少标记放流所造成的死亡。综上分析, 对应激反应强, 操作易受损伤的鲢, TCH荧光浸泡标记是一种较优选择。

3.2 TCH浸泡标记对鲢肝功能的可逆性影响

TCH作为荧光染料浸泡标记鲢鱼种, 有较好的标记效果, 但是作为一种抗生素通过鳃、皮肤和消化道吸收难免会对标记鱼体造成一定的生理影响。血清转氨酶AST和ALT是广泛存在于动物组织细胞线粒体内的重要氨基转移酶, 在机体蛋白质代谢中起着重要的作用, 其变化能反映肝脏的损伤程度(De La Torre et al, 1999, 2000)。本研究为了解TCH对鲢肝功能的影响, 检测了血清两种转氨酶AST和ALT活性, 结果显示在TCH浸泡后1d, 150、250、350mg/L三个浓度组鲢的血清转氨酶均出现急性升高, 表明TCH浸泡对鲢造成急性肝功能损伤。但是AST和ALT的活性在浸泡后2—5d即很快就恢复正常。文献报道, 茜素红S浸泡中华倒刺鲃引起的转氨酶活性升高需要10d后方可恢复正常水平(霍来江, 2015), 此外, 四环素类药物在吉富罗非鱼体内的消除半衰期为24h左右(徐维海等, 2004), 本研究表明TCH浸泡可能会造成鲢鱼种肝功能短期急性损伤, 但这种损伤是可逆的, 随着TCH从鱼体代谢清除, 鱼体在短时间内可自行恢复, 不会造成永久损伤。

3.3 TCH浸泡标记对鲢肝脏的氧化损伤和抗氧化酶的保护作用

化学药物浸泡对水生生物的影响是显著的, 用于防治病害在水产养殖上广泛应用的抗生素类药物, 其施用会引起鱼体的氧化应激, 使机体内产生大量活性氧自由基(ROS)(Bomzon et al, 2001;李兆新等, 2017), 当机体内ROS的含量快速增加超过机体的清除能力时, 就会对机体造成应激损伤, 引起细胞脂质过氧化、酶失活、DNA损伤等反应, 使组织细胞代谢失调, 机体随之发生进行性的生理和病理改变(Livingstone et al, 1990; Palace et al, 1998)。MDA是细胞脂质氧化的代谢产物, 它反映了机体受氧化损伤的程度(Benli et al, 2008)。本研究结果显示不同浓度的TCH浸泡后1d就导致了肝脏MDA呈浓度依赖的极显著升高, 表明鲢肝脏受到氧化损伤, 与此同时, 也检测到肝脏两种抗氧化酶SOD和CAT的活性也在同一时间呈浓度依赖的极显著升高, 这是由于SOD和CAT是动物体内主要的抗氧化酶, 它们通过协同作用保持细胞和机体的正常生理活动, 当TCH浸泡对肝脏造成氧化损伤时, 鲢肝细胞会大量合成SOD和CAT等抗氧化酶清除细胞内氧化应激产生的多余ROS。只有350mg/L浓度组的CAT活性出现下降, 推测可能是由于CAT酶对过高浓度TCH敏感而受到抑制所致。据文献报道, 茜素红S浸泡中华倒刺鲃, 钙黄绿素浸泡标记刺参, TCH浸泡斑马鱼也得到了类似的结果(赵鹏等, 2011;霍来江, 2015;郭鹤等, 2019)。此外, 研究发现使用钙黄绿素和茜素络合物联合标记中华倒刺鲃, TCH浸泡标记许氏平鮋, 钙黄绿素和茜素红S浸泡标记许氏平鮋都可获得良好的标记效果并且不会明显影响其生存和生长, 这与本研究的结果也是一致的(Lü et al, 2014a, b, 2017)。鲢在处理2—5d后抗氧化酶活性逐渐恢复到正常水平, 同样是TCH处理的斑马鱼则需要9d才恢复正常水平。本研究结果显示, 肝脏MDA在急性升高后的第2d就极显著下降低于对照组, 直至第10—22d逐渐恢复正常水平, 表明了鲢抗氧化系统有效而快速地清除肝细胞脂质氧化的代谢产物这一过程。结果表明TCH浸泡造成了鲢肝脏急性氧化应激, 但鱼体通过自身抗氧化系统的调节可以有效避免应激导致的永久损伤。因此不会影响鲢的野外存活, 这种标记对鲢是安全的。

4 结论

综上, 采用TCH浸泡标记鲢微耳石的方法比药饵投喂荧光标记的效果更好, 更方便操作。350mg/L的TCH溶液可以作为鲢鱼种浸泡标记的参考浓度; 150—350mg/L的TCH溶液浸泡会导致鲢的肝功能短暂异常, 表现为血清转氨酶急性升高和氧化应激指标上升, 但这种肝脏应激损伤可在短时间恢复正常, 表明TCH浸泡方法是鲢标记放流的有效、安全、可靠的方法。本研究结果可为鲢的增殖放流、跟踪监测和效果评估工作提供技术支撑, 为其他鱼类的标记放流提供参考。