克氏原螯虾(Procambarus clarkii)俗称小龙虾, 肉质鲜美, 营养丰富, 是我国重要的养殖经济虾类(柳富荣, 2002)。近年来, 克氏原螯虾养殖业发展迅速, 由于各地生长环境不同, 种质资源来源不同使得行业中小龙虾种质较为混乱, 市场上形态和品质参差不齐的克氏原螯虾(Paglianti et al, 2004; Ramalho et al, 2008)严重影响行业的可持续健康发展和渔民的增收, 为了对全国范围内的克氏原螯虾种质资源状况有充分的了解, 本研究拟对不同产地群体进行有效区分和鉴别, 从而有利于展开种质资源的保护和利用等后续研究工作。

关于种群鉴定, 基于形态学及遗传多样性的研究手段是常用的两种方法。形态学研究以传统形态测量法为主(韩晓磊等, 2011a, b; 郑友等, 2014; 张萌等, 2016), 遗传多样性研究多采用微卫星分析(彭刚等, 2010; 邢智珺等, 2014; 李喜莲等, 2016), 随机扩增多态性DNA标记技术(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)(张龙岗等, 2014), 扩增片段长度多态性分子标记技术(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)(宋亮等, 2012; 黄羽, 2012)等。与形态学方法相比, 通过遗传多样性来构建进化树从而进行亲子鉴定、种属鉴定具有准确率高、不受年龄限制等优点, 但是其需要提取DNA, 进行引物的筛选再聚类等复杂步骤, 成本较高。与遗传学方法相比, 形态学鉴定成本较低, 易操作, 不受设备等因素的影响。近年来以人脸识别为标志的形态学鉴别已成功应用于多种场景。本文拟从形态学的角度进行克氏原螯虾不同地理群体的种属鉴定问题, 这与克氏原螯虾不同地理群体在形态和品质具有一定的差异的背景相一致(Paglianti et al, 2004; Ramalho et al, 2008)。

传统形态测量法具有线性距离的同源性、具有相同距离数据的不同形态等问题(白明等, 2007)。因此, 为了克服传统形态测量法的缺陷, 通过选取生物结构中的样点来反映不同标本中结构的变化的地标点法被提出(Bookstein, 1986; Rohlf, 1986; Rohlf et al, 1990)。目前地标点法主要应用在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)(郑朝臣等, 2017)、多种鱼类耳石(Otolith)(侯刚等, 2013, 2014; 姜涛等, 2018)、蛇(Saurogobio dabryi)耳石(彭艳等, 2018)、夜蛾昆虫(Noctuidae)(蔡小娜等, 2019)等的差异性判别研究中, 而在克氏原螯虾群体形态差异性的研究报道较少。为得到快速高效的对不同产地克氏原螯虾种群形态鉴定的方法, 本研究分别采用传统形态测量法和地标点法对主要养殖和消费地点的上海、江苏、江西、河南、湖北的克氏原螯虾群体的形态进行分析比较, 从而确定不同地理群体的结构性特征和形态学鉴定方法, 为进一步研究克氏原螯虾的种质特性和遗传选育提供必要的参考资料。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本研究选取上海、江苏、江西、河南、湖北5个不同群体克氏原螯虾, 每个群体选取规格相近雌雄各10尾进行形态学研究, 群体详细信息见表 1。

1.2 样品处理及图像获取

将所采集到的克氏原螯虾进行形态固定, 利用相机获取其图像。样本与相机应保持垂直平行, 样本方向, 相机方位等均应保持一致(白明等, 2007)。

1.3 实验方法 1.3.1 传统形态测量法

运用tpsDig32软件测量每尾虾的全长(total length)、体长(body length)、头胸甲长(carapace length)、腹部长(length of abdomen)、头胸甲宽(carapace width)、腹部宽(segment height)、尾扇长(length of tail-fan)(图 1), 测量标准参考邹节新等(2014)记载的克氏原螯虾分类学研究方法, 精确至0.01mm。为避免虾体大小对参数的影响, 将各形态指标与体长的比或取2个形态指标的比值进行数据分析。本研究共选取了10项形态比例参数(表 2)。

求出10项形态比例参数的平均值, 采用欧式距离系统聚类法对这些平均值进行聚类分析; 将数据进行校正, 对5个不同产地克氏原螯虾群体形态比例参数进行主成分分析, 将第1、2主成分绘制主成分散点图, 以便对不同群体进行形态归类; 运用逐步判别分析法进行判别分析, 从判别分析中筛选出贡献较大的参数建立判别函数, 判别准确率的计算参照李思发等(1998)的方法。数据处理采用Excel和SPSS23软件。

1.3.2 地标点法

地标点选取标准、TPS系列软件使用方法同郑朝臣等(2017)。根据地标点的同源性, 运用TPS系列软件从克氏原螯虾背面选取了36个地标点, 确定每个地标点的x、y坐标值(2D), 建立数据文件。其中Ⅰ型地标点: 2—5、11、17、23—26; Ⅱ型地标点: 6—10、13、15、18—22、27—36; Ⅲ型地标点: 1、12、14、16(图 2)。

运用TPS系列软件检验所有地标点的有效性, 计算平均形(mean shape)和相对扭曲主成分得分(relative warps scores), 描绘出克氏原螯虾背面和腹面的网格图, 比较其与平均形的形态差异, 实现克氏原螯虾群体间的形态差异可视化。根据克氏原螯虾各样本的相对扭曲主成分得分, 采用欧式系统聚类法对相对扭曲主成分得分平均值进行聚类分析, 建立Bayes判别函数, 用逐步判别法进行判别分析, 运用SPSS 23软件, 进行统计分析。

2 结果 2.1 地标点法分析不同来源克氏原螯虾群体的表型差异

本文测定了克氏原螯虾雌雄群体切空间距离(distance in tangent space, y轴)和普氏距离(procrustes distance, x轴)的回归分析系数均为0.996, 说明所选取的地标点符合地标点分析要求。克氏原螯虾雌雄群体平均形及所有地标点重叠后的效果如图 2。群体间形态差异分析结果见图 3, 雌雄群体相对网格平均形而言, 形态差异主要体现在头胸甲及腹部部位的Ⅱ型地标点, 具体为地标点4—6、22—24、28—32、35、36变形最大。从以上分析可以得出克氏原螯虾头胸甲和腹部部位的各地标点是其形态差异的主要来源。

2.2 主成分分析

将不同产地克氏原螯虾10个形态比例参数进行主成分分析, 雌雄群体前2个主成分累计贡献率均超过50%(表 3), 解释了主要形态差异。在雌性群体中, 第1主成分X₅、X₈、X₉、X₁₀贡献率较高; 第2主成分X₃、X₆、X₇贡献率较高; 雄性群体中, 第1主成分X₁、X₂、X₅、X₆、X₈、X₁₀贡献率较高; 第2主成分X₃、X₇贡献率较高说明5个群体形态特征差异主要体现在头胸甲长、头胸甲宽、腹部长、腹部宽。

地标点法相对扭曲主成分分析, 雌雄群体前两个主成分累计贡献率分别为73.04%、54.75%(表 4), 超过了50%, 代表其形态差异的主要部分。克氏原螯虾雌雄群体Ⅰ型地标点累计贡献率分别为16.69%、20.10%; Ⅱ型地标点累计贡献率分别为78.39%、72.70%; Ⅲ型地标点累计贡献率分别为4.93%、7.20%(表 5), 表明Ⅱ型地标点是克氏原螯虾形态差异的主要来源, Ⅱ型地标点代表克氏原螯虾头胸甲及腹部的形态特征, 此结果与传统形态测量法结果相同。

图 4为两种方法雌雄群体第1、2主成分散点图。从图 4a、b中可看出各产地雌雄群体形态比例参数主成分重叠程度较大, 不易区分。相对扭曲主成分散点图(图 4c, 4d)显示雌雄群体散布趋势相似, 上海、江西、河南、湖北重叠程度较大, 江苏群体与其他群体重叠较少。

2.3 聚类分析

本文分别对克氏原螯虾群体形态比例参数平均值、相对扭曲主成分得分平均值作聚类分析, 结果如图 5。形态比例参数平均值聚类分析将群体分为两支, 雌性群体中江苏、河南群体欧氏距离最短, 首先聚为一支, 之后与江苏、湖北群体聚为一支, 江西群体单独聚为一支(图 5a)。雄性群体与雌性群体聚类结果相似, 上海、河南群体欧氏距离最短, 首先聚为一支, 之后与江苏、湖北群体聚为一支, 江西群体单独聚为一支(图 5b)。相对扭曲主成分得分平均值聚类分析, 雌性群体与雄性群体结果相似(图 5c, 5d), 均为江苏群体单独聚为一支, 此聚类结果与相对扭曲第1、2主成分散点图结果相同。

2.4 判别分析

克氏原螯虾5个地理群体判别分析中, F检验判别效果均较好(P < 0.01)。雌雄群体相对扭曲主成分得分综合判别准确率分别为100%、94%(表 6)。而形态比例参数主成分得分综合判别准确率较低均为56%(表 7)。利用基于地标点法的几何形态学测量可以有效判别不同产地克氏原螯虾, 判别效果较传统形态测量法好。

3 讨论 3.1 基于形态学特征的群体判别

通过形态学及遗传多样性两种方法来对不同地理群体间进行种质鉴定已在多个物种中应用。尹洁等(2020)、宋垚萱等(2018)分别在青岛和舟山的星康吉鳗(Conger myriaster)群体、角木叶鲽(Pleuronichthys cornutus)群体进行形态学及遗传学研究中, 群体间形态差异显著, 但遗传多样性差异不显著, 这可能是由于种群遗传分化所需时间跨度要长于形态学上表现出差异所需的时间。武小斌(2017)采用形态标记和微卫星标记等对日本沼虾(Macrobrachium nipponense)野生群体进行形态差异分析及群体遗传多样性的研究中, 遗传多样性水平较高, 其中微山湖群体相对于其他三个野生群体表现出较高的遗传多样性水平; 通过遗传多样性来构建进化树从而进行亲子鉴定、种属鉴定具有准确率高、不受年龄限制等优点, 但是其需要提取DNA, 进行引物的筛选再聚类等复杂步骤, 成本也较高。相比较而言, 形态学鉴定成本低, 易操作, 不受设备等因素的影响, 而且在人脸识别中应用优势明显, 故本文拟从形态学的角度进行克氏原螯虾不同地理群体的种属鉴定问题。

3.2 形态差异的原因

由于地理隔离的原因, 使得同一亲本在不同地理环境下其形态、生理甚至遗传结构会出现一定的差异(Gould et al, 1978)。张龙等(2018)研究发现10个不同水域克氏原螯虾群体产生了一定程度的形态差异。蔡晓鹏等(2010)利用多元分析方法, 对5个地理群体间的中国沿海日本囊对虾(Penaeus japonicus)进行形态差异比较分析; 孙悦娜(2007)对我国五大湖日本沼虾(Macrobrachium nipponense)群体进行了比较研究, 发现群体间形态差异显著。本文从5个主养地区收集小龙虾种质资源, 分别采用传统形态测量法和地标点法对其进行分析, 从表型角度看它们之间的差异。

两种方法均显示5个群体形态特征差异体现在克氏原螯虾头胸甲及腹部部位。传统形态测量法中, 雌雄群体前两个主成分贡献较高的分别是X₃、X₅、X₇、X₈、X₁₀, 则其群体形态特征差异主要体现在头胸甲长、头胸甲宽、腹部长、腹部宽。地标点法相对扭曲主成分分析, 雌雄群体Ⅱ型地标点贡献率均较高, Ⅱ型地标点主要代表虾头胸甲及腹部部位。张萌等(2016)对国内长江水系、珠江水系、淮河水系、东南沿海水系等14个自然水系克氏原螯虾的形态差异进行分析, 结果显示雌雄群体前四个主成分累计贡献率分别为79.49%、79.81%, 其形态特征差异主要体现在头胸甲长、头胸甲宽、腹部长、腹部宽等。郑友等(2014)同样证明克氏原螯虾头胸甲高、头胸甲宽、腹部宽和腹部长等是不同群体的形态差异的主要来源。克氏原螯虾头胸甲部位主要是摄食和感觉中心, 对食物、外界环境变化较为敏感; 腹部是运动中心, 克氏原螯虾觅食、打斗, 挖穴、防御等行为中腹部是基本的支撑点, 各个地区由于地理位置、养殖方式、养殖密度、天气等原因造成养殖环境不尽相同进而造成头胸甲部位和腹部出现不同程度的差异(Bergman et al, 2003; 罗福广等, 2010), 因此可以利用克氏原螯虾头胸甲部位及腹部某些部位进行各产地形态差异研究。

3.3 两种方法进行判别分析的比较

冯波等(2011)、苏杭(2016)研究发现, 相较于传统形态测量法, 地标点法更适合区分群体形态差异。本研究采用地标点法和传统形态测量法均能从形态上对5个克氏原螯虾地理群体进行区分。主成分分析时, 两种方法均显示5个群体形态特征差异体现在克氏原螯虾头胸甲及腹部部位, 而地标点法将形态差异可视化, 更直观精确的显示群体形态差异部位。雌雄群体形态比例参数第1、2主成分散点图显示各群体重叠程度较大不易区分与其聚类分析结果不符。而相对扭曲第1、2主成分散点图, 雌雄群体均显示江苏群体与其他群体重叠较少, 与聚类分析结果相同。冯波等(2011)采用传统形态测量法与地标点法区分短吻鲾(Leiognathus brevirostris)群体间差异性, 结果表明传统形态测量法主成分散点图区分效果强于地标点法, 可能是由于作者地标点选取较少, 不能代表短吻鲾的形态特征。苏杭(2016)基于地标点法分析鉴别两种头足类(Cephalopoda)上下颚的研究中发现, 相对于传统形态测量法, 地标点法对不同种类间的头足类上下颚具有良好的判别效果。本研究中克氏原螯虾雌雄群体相对扭曲主成分得分综合判别准确率分别为100%、94%, 高于传统形态测量法判别效果。综合以上结果显示, 地标点法在区分5个克氏原螯虾群体形态差异时效果更好。

3.4 地标点法在地理种群判别中的优势

郑朝臣等(2017)利用地标点法对长江水系的八个自然水域的中华绒螯蟹形态上的差异进行分析, 相对扭曲主成分的判别分析对雄性以及雌性蟹背甲的判别准确率均为100%。且所提取的地标点中Ⅱ型地标点贡献率较高作用较大。姜涛等(2018)利用地标点法对珠江口与九江口的凤鲚(Coilia mystus)与七丝鲚(C. grayii)的耳石特征进行研究, 判别分析正确率均为100%, 其中主凹槽上的地标点相对扭曲贡献率达76.10%, 远高于轮廓上地标点所贡献, 证明主凹槽上的地标点位置在耳石种群形态区分中作用较大。侯刚等(2013)利用地标点法对北部湾4种白姑鱼矢耳形态进行分析, Ⅱ型地标点贡献率较大, 解释了主要形态变异。本研究采用地标点法对不同地区克氏原螯虾的形态进行分析, 雌性群体Ⅰ、Ⅱ型地标点累计贡献率分别为16.69%、78.39%。雄性群体Ⅰ、Ⅱ型地标点累计贡献率分别为20.10%、72.70%, Ⅱ型地标点相较于轮廓上的Ⅰ型地标点累计贡献率更高。克氏原螯虾背面存在很多突出点、凹陷点及各组织间的交点, 形成许多Ⅰ、Ⅱ型地标点, 因此, 相较于其他的形态测量法, 地标点法对克氏原螯虾的形态分析及产地判别效果更好。

4 结论

本研究分别采用地标点法和传统形态测量法对我国五个不同产地克氏原螯虾群体间形态特征进行分析, 结果表明两种方法均将各群体进行了有效的区分, 且地标点法更高效。在后续研究中, 我们还需通过增加样本量及更多地理群体, 筛选最适地标点等更全面的了解两种方法间的优劣和不同产地克氏原螯虾群体间差异, 为筛选优质种苗, 研究种群间差异提供参考资料。