密斑刺鲀(Diodon hystrix)属于鲀形目(Tetraodontiformes)、二齿鲀科(Diodontidae), 主要分布于热带海域, 如大西洋、太平洋、地中海、印度洋等地, 模式产地在印度, 主要栖息于沙石或砾石底质海域(Bandyopadhyay, 2014)。该种鱼身体表面含有长刺, 正常情况下刺向后折叠, 受到攻击时会使身体膨胀, 将刺竖起用以保护自己, 背部、侧面和鳍有许多黑斑点, 主要呈浅棕色(陈燕等, 2019)。尽管密斑刺鲀被认为含有毒素(Trevett et al, 1997), 但因其肉质鲜美, 鱼皮富含胶原蛋白, 属于传统的海洋药用生物, 深受太平洋岛屿国以及中国海南南部地区的欢迎(Bandyopadhyay, 2014; 马军等, 2020)。当前, 由于过度捕捞, 密斑刺鲀野生资源受到了破坏, 由此急需开展密斑刺鲀的人工繁育及资源增殖。

在自然资源下降的情况下, 开发新的海洋鱼类资源是人类获取优质食物蛋白的重要途径, 开发新的海洋鱼种并成功实现其人工养殖, 首要前提是认识该鱼种的生殖特性, 以控制其生殖周期和产卵(柳学周等, 2013)。鱼类的生殖受到脑-垂体-性腺轴的调控, 最先由下丘脑分泌合成促性腺激素释放激素(GnRH), GnRH属于一种多肽类激素, 是性腺发育与性激素合成的关键内分泌调控因子, 同时也是“下丘脑-垂体-性腺”轴的原始动力(Zohar et al, 2010)。它是以脉冲的方式进行分泌, 之后进入垂体门脉系统, 到达垂体前叶和GnRHR特异性结合激活信号传导机制, 刺激垂体黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)的合成及释放, 最后通过血液循环调节性腺的活动(张树芳, 2018; Muñoz-Cueto et al, 2020)。

目前, 研究人员们在脊椎动物中共鉴定出15种不同分子形式的gnrh基因, 在硬骨鱼类中发现了8种不同分子形式的GnRH。不同分子形式的GnRH都具有共同的核心十肽结构, 并在长期的进化过程中显示出保守的结构特征, 从而组成了GnRH多肽家族(Somoza et al, 2002)。在大多数脊椎动物中, GnRH有两种形式, 即GnRH1 (Mammalian-GnRH)和GnRH2 (Chicken GnRH), 部分硬骨鱼除了GnRH1和GnRH2, 还有GnRH3 (Salmon GnRH) (Okubo, 2008; 李婉茹等, 2020)。GnRH2主要功能是调控动物的食欲和性行为, 集中于中脑部位, 聚集在中脑前端和间脑后端的交汇处, 紧挨动眼神经(Tostivint, 2011), 但是关于GnRH2的确切功能现今依然存在很大的争议, 一般认为是发挥了神经递质的作用(Kanda et al, 2010)。GnRH3主要分布于前脑并能延伸到神经末端, 精确定位是在嗅神经和端脑的融合处, 可能间接参与刺激垂体激素释放的生理过程, 虽然GnRH3不能直接刺激垂体, 但是在嗅觉泡和前视觉形成处等区域有和GnRH1共表达的区域, GnRH1的作用是刺激促性腺激素的释放(Wirsig-Wiechmann, 2001)。目前关于GnRH的生理功能在多种鱼类中开展了研究(Chen et al, 2020), 但在鲀形目鱼类中的研究相对较少(Muñoz-Cueto et al, 2020), 有待于进一步研究。

密斑刺鲀虽含有毒素, 但因肉质鲜美而被很多人喜爱, 但目前对于密斑刺鲀的研究较少, 人工繁育也未见报道, 阻碍了密斑刺鲀产业的发展(陈燕等, 2019; 马军等, 2020), 因此, 研究其生长生殖调控并作为人工育种工作的指导是必要的。本研究克隆了密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因, 并分析了其表达模式, 探究了gnrh基因的特性, 分析序列结构特征, 本研究结果为深入探索密斑刺鲀的gnrh基因在生长发育中的调控机理提供了研究基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

密斑刺鲀(Diodon hystrix)实验鱼为三亚近海捕捞, 活体运回实验室后经冰上深度麻醉后取适量脑、垂体、性腺、肌肉、肝脏、心脏、脾、肾脏和鳃组织, 经液氮速冻后转入–80℃冰箱保存, 用于总RNA提取及后续实验。

1.2 实验试剂

总RNA提取Trizol试剂盒; PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒; DNAMarker 2000; rTaq酶; 克隆用载体pMD19-T Vector; 无菌水; DEPC水(0.1%); 1×TAE电泳缓冲液; LB液体培养基; 氨苄青霉素(AMP)溶液; 含AMP抗性的LB固体培养基。

1.3 总RNA的提取和cDNA的合成

总RNA的提取采用Trizol试剂盒进行, 对密斑刺鲀的肌肉、精巢、垂体、肾脏、脑、肝脏、心脏、脾和鳃组织进行提取。RNA检测采用1% (质量体积分数)的琼脂糖凝胶电泳, 使用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白测定仪测定其浓度和质量。所有RNA样品各取1 μg, 按照PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒合成cDNA。

1.4 gnrh2和gnrh3基因的cDNA克隆 1.4.1 引物设计

通过利用高通量测序的方法, 构建密斑刺鲀全脑的转录组文库, 并通过同源比对, 同时也结合密斑刺鲀基因组数据(数据未发表)的比对, 获得密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因的片段scaffold, 根据scaffold序列设计引物进行开放阅读框ORF克隆(表 1), 获得gnrh2和gnrh3基因cDNA序列。

1.4.2 分子克隆

取等量的密斑刺鲀全脑的cDNA作为模板进行PCR克隆。PCR体系为10 μL: 5 μL rTaq酶, 0.4 μL上游引物, 0.4 μL下游引物, 0.4 μL混合cDNA模板, 3.8 μL双蒸水。PCR程序: 预变性95℃、5 min; 变性95℃、30 s, 退火59℃、30 s, 延伸72℃、30 s, 共32个循环; 延伸72℃、10 min; 4℃保存。将PCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行电泳, 切取目的片段回收, 连接到pMD19-T Vector载体, 转化到感受态细胞。挑取阳性菌落, 送生物公司测序。

1.5 生物信息学分析

运用DNAstar软件预测密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因的开放阅读框序列, 翻译成氨基酸序列, 然后与其他脊椎动物GnRH蛋白前体序列进行同源比对。运用在线软件SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽。运用SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析GnRH2和GnRH3的蛋白质结构。运用SoftBerry在线预测工具(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?Topic=psite&group=programs&subgroup=proloc)预测GnRH2和GnRH3氨基酸序列的功能位点。运用Mega 7.0软件对密斑刺鲀的gnrh基因进行系统进化树分析。通过软件Swiss-model进行蛋白质三级结构进行预测与结构分析。

1.6 组织分布

以密斑刺鲀肌肉、精巢、垂体、肾脏、脑、肝脏、心脏、脾和鳃的cDNA作为模板, 进行PCR扩增, 完成gnrh2和gnrh3基因组织分布的半定量分析, 内参为β-actin基因。PCR体系为10 μL: 5 μL Taq酶, 0.4 μL上游引物, 0.4 μL下游引物, 0.4 μL cDNA模板, 3.8 μL双蒸水。目标基因PCR程序: 预变性95 ℃、5 min; 变性95 ℃、30 s, 退火59℃、30 s, 延伸72 ℃、30 s, 共40个循环; 延伸72℃、10 min; 4 ℃保存。PCR产物使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测, 然后对电泳结果进行拍照, 完成半定量分析。

1.7 性腺组织学

将实验鱼经麻醉剂深度麻醉后, 快速取出卵巢, 参考经典石蜡切片的方法进行组织学分析(Chen et al, 2020)。根据性腺的发育时期进行样本的分析与归类。

1.8 实时荧光的定量

参照SYBR^Ⓡ Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japan)试剂盒说明书准备反应体系, 利用RocheLight Cycler 480 real time PCR system检测gnrh2和gnrh3在下丘脑中的表达。具体反应程序为: 首先95 ℃预变性1 min; 95 ℃变性5 s, 58 ℃退火10 s, 72 ℃延伸20 s, 84 ℃收集荧光10 s, 共40个循环; 溶解曲线: 95 ℃ 1 min, 52 ℃ 1 min, 95 ℃延伸。每个样品3次重复, 目标基因的相对定量利用R=2^–ΔΔCt的方法进行计算, 并通过SPSS16.0数据分析软件进行统计分析。

2 结果 2.1 密斑刺鲀gnrh cDNA克隆及序列分析 2.1.1 gnrh2 cDNA克隆及序列分析

本研究从密斑刺鲀中克隆得到gnrh2基因的cDNA序列, 密斑刺鲀gnrh2 cDNA开放阅读框(ORF)共279 bp, 可编码92个氨基酸, 分子量为10.30 kDa。密斑刺鲀GnRH2前体蛋白由4部分组成: 信号肽(30个氨基酸)、GnRH2核心十肽(QHWSHGWYPG)、酶切位点(GKR)以及GnRH相关肽(49个氨基酸) (图 1)。并预测GnRH2前体蛋白具有SCOP domain d1rype功能位点。

2.1.2 gnrh3基因的cDNA克隆及序列分析

本研究从密斑刺鲀中克隆得到gnrh3基因的cDNA序列, 密斑刺鲀gnrh3由325个核苷酸组成, cDNA开放阅读框(ORF)共270 bp, 可编码89个氨基酸, 分子量为9.94 kDa。密斑刺鲀GnRH3前体蛋白由4部分组成: 信号肽(23个氨基酸)、GnRH3核心十肽(QHWSYGWLPG)、酶切位点(GKR)以及GnRH相关肽(56个氨基酸)(图 2)。并预测GnRH3前体蛋白具有SCOP domain d1oaca4以及d1kcgc两个功能位点。

2.2 密斑刺鲀GnRH氨基酸序列比对及同源性分析 2.2.1 GnRH2的氨基酸序列比对及同源性分析

本实验采用Clustal X法对密斑刺鲀与其他物种GnRH2氨基酸序列进行比对。与密斑刺鲀GnRH2氨基酸序列作比较的物种有银大麻哈鱼(Oncorhynchus kisutch)、大西洋鲑(Salmo salar)、白鲑(Coregonus clupeaformis)、红点鲑(Salvelinus alpinus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、竹筴鱼(Trachurus japonicus)、铅点东方鲀(Takifugu alboplumbeus)等13种动物。同源性分析结果发现密斑刺鲀GnRH2核心肽区域(QHWSHGWYPG)与其他物种具有极好的同源性(图 3)。

2.2.2 GnRH3的氨基酸序列比对及同源性分析

本实验采用Clustal X法对密斑刺鲀与其他物种GnRH3氨基酸序列进行比对。与密斑刺鲀GnRH3氨基酸序列作比较的物种有莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)、革首南极鱼(Notothenia coriiceps)、大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)、斑纹隐小鳉(Kryptolebias marmoratus)、军曹鱼(Rachycentron canadum)等16种生物。同样, 同源性分析结果发现密斑刺鲀GnRH3核心肽区域(QHWSYGWLPG)与其他物种具有极好的同源性(图 4)。

2.3 密斑刺鲀GnRH氨基酸序列其他功能位点预测 2.3.1 GnRH2氨基酸序列其他功能位点预测

利用SoftBerry在线预测工具预测GnRH2氨基酸序列的其他功能位点, 包括: 酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰基化位点、酰胺化位点、内质网靶向序列、促性腺激素释放激素特征(表 2)。

2.3.2 GnRH3氨基酸序列其他功能位点预测

利用SoftBerry在线预测工具预测GnRH3氨基酸序列的其他功能位点, 包括: N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰基化位点、酰胺化位点、微体C-末端靶向信号、促性腺激素释放激素特征(表 3)。

2.4 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3系统进化树分析

使用Mega7.0软件的邻位相连法(Neighbor-joining)构建GnRH蛋白系统发育树, 以确定密斑刺鲀GnRH2和GnRH3的进化关系。进化树分析结果显示, 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3分别与其他物种的GnRH2和GnRH3聚类在一起, 其中密斑刺鲀GnRH2与竹筴鱼(Trachurus japonicus)、绿河鲀(Tetraodon nigroviridis)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)和铅点东方鲀(Takifugu alboplumbeus)在一个分支上, 而密斑刺鲀GnRH3与虾虎鱼(Rhinogobius flumineus)和大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)在一个分支上, 结果表明: 与其他物种相比, 密斑刺鲀GnRH2与竹筴鱼、绿河鲀、红鳍东方鲀和铅点东方鲀有较近的亲缘关系, 而密斑刺鲀GnRH3与虾虎鱼和大弹涂鱼有较近的亲缘关系(图 5)。

2.5 密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因的组织表达

本实验采用RT-PCR方法, 对密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在脑、垂体、精巢、肌肉、肝脏、心脏、脾、肾脏和鳃组织的表达模式进行分析。电泳结果显示, 密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在各组织中都有分布, 在脾、鳃和垂体中表达量较高, 在脑和精巢中表达量中等, 而在心脏表达量最低(图 6)。

2.6 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3蛋白质三级结构预测

构建GnRH2和GnRH3的蛋白质核心十肽的三级结构(图 7)。结果表明密斑刺鲀GnRH蛋白质结构和人类的GnRH核心肽结构相同, 均呈现α螺旋, 其中密斑刺鲀的GnRH2与人类的mGnRH的结构更加相似。

2.7 密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在性腺发育过程中的表达模式

根据密斑刺鲀的卵巢和精巢发育的特征进行发育时期的分期与归类, 分别获得密斑刺鲀卵巢和精巢的早、中和晚期3个发育阶段的下丘脑样本(图 8), 每个时期5个样本(n=5)。然后利用实时荧光定量的方法检测密斑刺鲀下丘脑中的gnrh2和gnrh3基因在不同性腺发育时期中的表达模式, 结果显示密斑刺鲀gnrh2基因在卵巢和精巢不同的发育时期中没有显著性变化, 而gnrh3基因随着性腺的发育成熟而不断升高(图 9)。

3 讨论

鱼类的生殖系统从不成熟转变为成熟的整个过程就是其性腺发育的过程, 整个生殖过程共分两个阶段, 首先是神经联系起主要作用, 是指感觉器官捕获外界刺激, 并将其传送到脑, 再通过神经联系传递到下丘脑; 接下来是下丘脑、垂体、性腺三个水平上的激素起主要作用, 下丘脑分泌促性腺激素释放激素(GnRH), 激发垂体分泌促性腺激素, 促性腺激素作用于性腺并促使其分泌性类固醇激素, 以促使性腺发育成熟并排出精子和卵子(王蕴, 2006)。

本研究对密斑刺鲀的gnrh2和gnrh3基因进行克隆和分析, 并通过密斑刺鲀转录组文库和基因组数据比对, 发现密斑刺鲀只存在两种GnRH类型, 与其他鲀型目鱼类一样(Muñoz-Cueto et al, 2020)。利用软件预测密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因的开放阅读框序列, 翻译成氨基酸序列, 然后进行生物学信息分析。密斑刺鲀gnrh2 cDNA开放阅读框(ORF)共279 bp, 可编码92个氨基酸, GnRH2核心十肽(QHWSHGWYPG)位于31—40 aa位置, 具有SCOP domain d1rype功能位点; 密斑刺鲀gnrh3 cDNA开放阅读框(ORF)共270 bp, 可编码89个氨基酸, GnRH3核心十肽(QHWSYGWLPG)位于24—33 aa位置, 具有SCOP domain d1oaca4以及d1kcgc_两个功能位点。通过在线预测氨基酸序列功能位点, 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3的核心十肽均被定义为促性腺激素释放激素特征。与其他脊椎动物GnRH蛋白前体序列进行同源比对, 结果发现密斑刺鲀GnRH2和GnRH3核心肽区域有极好的同源性, 这与其他物种的GnRH研究结果一致(吴旭等, 2005; 丁炜东等, 2006; 王滨等, 2017; Wang et al, 2019)。

进化树分析结果显示, 密斑刺鲀GnRH2和GnRH3分别与其他物种的GnRH2和GnRH3聚为一大分支。有趣的是密斑刺鲀GnRH2先与竹筴鱼聚类, 然后再与绿河鲀、红鳍东方鲀和铅点东方鲀聚在一个分支上。竹䇲鱼为鲈形目鱼类, 而密斑刺鲀、绿河鲀、红鳍东方鲀和铅点东方鲀均为鲀形目鱼类。这与已有的鱼类GnRH进化研究有所不同, 如: 同属于鲈形目石首鱼科的双棘黄姑鱼、美国红鱼和细须石首鱼GnRH最先聚类(杨宪宽等, 2015); 属于鲈形目的金钱鱼, 其三种GnRH的亲缘关系与鲈形目鱼类最近(Chen et al, 2020)。

表达量的组织分布结果显示, 密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在各组织中都有分布, 在脾、鳃和垂体中表达量较高, 在脑和精巢中表达量中等, 而在心脏表达量最低。在经典理论中, gnrh主要在脑中表达(周晓苏, 2012), 在多种鱼类中也发现gnrh主要表达于脑部, 如: 圆斑星鲽(Verasper variegatus) (柳学周等, 2013)、许氏平鲉(Sebastes schlegelii) (周晓苏, 2012)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) (周晓苏, 2012)和金钱鱼(Scatophagus argus) (Chen et al, 2020)。但有研究发现, 在多组织中有gnrh基因表达(Kovacs et al, 2001), 鱼类中鲽形目的牙鲆(Paralichthys olivaceus)在脑、胃、脾脏、眼、垂体、肌肉、肠、卵巢和肾脏中gnrh均有较高表达分布(房保海, 2006)。在不同组织中, gnrh具不同的生物学功能(Huang et al, 2001)。本研究发现密斑刺鲀gnrh2和gnrh3除了在脑和精巢外, 还在多组织中有表达, 说明密斑刺鲀gnrh2和gnrh3与生殖调控有关的同时还存在其他生物功能。

密斑刺鲀下丘脑的gnrh2和gnrh3基因在卵巢和精巢发育不同时期中的表达显示出不同的表达模式和特征。密斑刺鲀gnrh2在卵巢和精巢发育不同时期中的表达没有显著性的变化, 从中暗示了gnrh2可能不是调控密斑刺鲀性腺发育的主要类型。研究表明, 在虹鳟的性腺发育和成熟过程中, 检测到下丘脑有低浓度的gnrh2 mRNA表达, 但是整个发育过程的表达量变化不明显(Madigou et al, 2000), 结果与本文的研究结果相吻合。密斑刺鲀gnrh3基因随着卵巢和精巢的发育成熟而不断显著升高, 与纵痕平鲉(Sebastes rastrelliger) (Collins et al, 2001)、真鲷(Pagrus major) (Senthilkumaran et al, 1999)、大菱鲆(Scophthalmus maximus) (Andersson et al, 2001)和金钱鱼(Chen et al, 2020)等鱼类的表达模式相类似, 从中表明GnRH3可能是密斑刺鲀生殖调节的主要GnRH亚型。

4 结论

综上所述, 本研究克隆获得了密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因的ORF序列, 并通过生物信息学分析, 密斑刺鲀GnRH2核心十肽(QHWSHGWYPG)和GnRH3核心十肽(QHWSYGWLPG)具有促性腺激素释放激素特征, 且在进化过程中表现出高度的保守性。gnrh2和gnrh3除了在密斑刺鲀脑和精巢有表达外, 还在多组织中有表达, 说明了gnrh2和gnrh3在密斑刺鲀中与生殖调控有关的同时还存在其他生物功能。此外, 进一步研究了密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在卵巢和精巢发育不同时期中的表达模式, 表明了GnRH3可能是密斑刺鲀生殖调节的主要GnRH亚型。本研究通过对密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因的探索, 为密斑刺鲀的人工繁殖提供理论基础。