β-Tubulin主要与细胞运动、细胞内细胞器的定位及其迁移、细胞内的物质运输、保持细胞形状以及细胞分裂等有关, 在发生减数分裂时微管蛋白形成二聚体从而组成纺锤体(Mori et al, 2011)。β-Tubulin微管蛋白属于结构物质, 并且作为细胞骨架重要的组成部分广泛分布于动植物的组织与细胞中。β-Tubulin微管蛋白有多方面的功能应用, 例如维持细胞形态和负责运输细胞内物质等。在脊椎动物中, 迄今为止已经在哺乳动物和鸟类中鉴定出六种和七种微管蛋白同种型。两栖动物和鱼类中的微管蛋白的类型鲜为人知(Ludueña, 1997), β-Tubulin在不同生物类群之间既有很高的保守性又存在一定的变异性(Aroca et al, 2008), 来自不同脊椎动物物种的正常细胞或组织已经阐明了差异表达的复杂模式, 表明细胞和功能的特异性和多样性, 以及自由混合和适应性表达的能力, 但是, 尚未完全阐明β-Tubulin同种型的细胞分布和功能(Fulton et al, 1976)。在哺乳动物和禽类的发育过程中, Ⅲ型β-Tubulin被认为是最早的与神经元相关的细胞骨架标记蛋白之一(Katsetos et al, 1993)。Stathmin 1 (STMN1), 也称为癌蛋白18 (Op18), 是一种微管失稳蛋白, 在脊椎动物中普遍表达。STMN1结合β-微管蛋白并调节微管蛋白的二聚化和聚合反应。这些是信号级联反应中的关键过程, 在细胞周期进程和细胞运动过程中控制有丝分裂纺锤体的组装和解体(Ringhoff et al, 2009)。近来的研究表明了III型β-Tubulin在神经发育和疾病中有新的作用, β-Tubulin的突变可导致脑皮层发育畸形和神经元迁移缺陷、干扰微管的动态和轴突的导向(Poirier et al, 2010; Gumy et al, 2011)。

三倍体雌性虹鳟是利用理化手段抑制第二极体的排出制得(王太, 2010)。在养殖生产过程中, 全雌三倍体虹鳟具备存活率高、生长速度快、出肉率高和持续生长等优势(朱龙等, 2018)。然而, 通过人工诱导的三倍体虹鳟能否成功, 要面临和克服的重大问题就是减数分裂, 多一套染色体会扰乱减数分裂进程的正常进行, 减数第一次分裂同源染色体联会时, 可能会引起配对与交叉行为同时发生在三条染色体之间, 导致同源染色体联会发生紊乱(Hollister, 2015)。目前关于三倍体虹鳟性腺发育已在组织学、细胞化学、血液学、雌性激素表达(徐革锋, 2016)、细胞自噬等方面进行研究, 关于三倍体虹鳟性腺发育减数分裂进程中微管蛋白β-tubulin功能研究尚未见报道。前人研究表明, 三倍体雌性虹鳟在240 dpf (受精后天数, days post fertilization, dpf)后, 卵母细胞成熟受阻, 当发育到300 dpf后, 完整卵母细胞结构几乎不存在, 并且染色质集中在细胞核中央或偏向一侧, 即出现破裂或坏死等败育现(韩英, 2008; 柳广昊等, 2016)。本研究采用同源性基因克隆得到β-tubulin基因开放阅读框, 检测分析了β-tubulin基因在虹鳟卵巢中特异性表达情况, 并显示了β-tubulin基因在不同发育阶段二倍体与三倍体虹鳟卵巢组织中的表达差异情况。免疫组化方法观察了在各发育阶段, β-Tubulin蛋白在二倍体与三倍体的卵巢组织中表达的动态变化。研究结果为探明多倍体鱼类性腺发育过程中卵母细胞减数分裂受阻提供基础理论。

1 材料与方法 1.1 实验动物与样品保存

本实验用鱼二倍体和三倍体雌性虹鳟取自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼试验站, 其中三倍体雌性虹鳟由雌核发育获得全雌二倍体, 通过激素诱导使其转变成具有产生成熟精子能力的“伪雄鱼”, 与二倍体虹鳟交配, 后利用理化方法抑制第二极体排出制得全雌三倍体。养殖缸中饲养平均水温为(9.0±0.5) ℃, 自240—330 dpf期间, 每30 d取样1次, 共采取全雌二倍体虹鳟48尾, 全雌三倍体虹鳟36尾。其中采取3尾二倍体虹鳟的肾、肝、鳃、肌、肠、脾、卵巢、心、眼组织, 另取二倍体与三倍体虹鳟各6尾的卵巢组织, 将所得组织均置于RNA保护液中, 并放入–80 ℃冰箱保存备用。同时采取二倍体与三倍体虹鳟各3尾的卵巢组织, 采取卵巢组织时, 保持其形态完好度, 即前部的扁三棱状与后部线状拖尾, 并展平置于4%多聚甲醛, 常温备用。胚胎发育时期卵自受精后2 h内, 间隔15 min采集1次, 在受精后2—48 h, 间隔2 h采集1次, 48—72 h, 间隔12 h采集1次, 72 h之后, 每天采集1次, 直到出膜期, 每次所采卵粒个数为15—25粒, 将二、三倍体受精卵置于Bouin’s液, 固定48 h后, 将受精卵转入75%的酒精中, 常温备用。将受精卵的黏膜除去使胚体暴露, 易于观察, 胚胎发育的时序以镜检50%个体出现新特征为划分发育阶段的标准, 仔稚鱼阶段则直接使用显微照像的方法进行观察。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

利用Simply P Total RNA Extraction Kit试剂盒(BioFlux, 中国)提取总RNA, 通过1%琼脂糖凝胶电泳以及紫外分光光度计检验RNA的完整度, 同时使用ScanDrop核酸分析仪(Analytik Jena, 德国)测量RNA浓度和纯度, 即吸光度值OD_260/280在1.8—2.0是可接受的范围, 可以留作备用。按照Bio RT高灵敏cDNA第一链合成试剂盒(BOER, 中国)说明书合成cDNA, 其反应体系为5 μL Hybrid mix, 0.5 μL Enzyme mix, 根据所测得的RNA浓度添加模板量(1 pg—2 μg), 加入Nuclease-free water补至10 μL。反应程序为37 ℃, 20 min; 98 ℃, 5 min。获得的cDNA置于–20 ℃保存。

1.3 β-tubulin基因cDNA克隆

在NCBI公共数据库中检索到与虹鳟同源性较高的物种β-tubulin基因的序列信息, 根据比对其高度保守区域设计引物, 使用Primer 5.0软件设计特异性引物(表 1), 引物在苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。核心片段的PCR扩增体系为10 μL, 反应体系为5 μL 2×Taq mixture; 0.5 μL上下游引物; 1 μL cDNA; 3.5 μL无菌水。反应程序设置为94 ℃预变性2 min; 94 ℃变性30 s; 59 ℃退火30 s; 72 ℃延伸30 s; 30个循环; 72 ℃延伸5 min。根据SMARTer^® RACE 5′/3′ Kit Components说明书的方法和步骤进行3′ UTR和5′UTR的RACE扩增, PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 根据Biospin Gel Extraction Kit (BioFlux公司)纯化目的片段, PMD18-T载体连接, 转入DH5α感受态细胞, LB培养基(含氨苄)挑取圆形亮白色单菌落送公司完成测序。

1.4 虹鳟β-tubulin基因序列生物信息学分析

利用DNAMAN软件拼接克隆片段, 得到β-tubulin基因完整开放阅读框, 采用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)进行基因开放阅读框预测, 用Blast在线程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析基因与其他物种的同源性。使用DNAMAN6.0软件对序列进行翻译以及与其他物种同一蛋白的氨基酸序列多重比对。蛋白质基本物理化学参数分析和结构使用在线网站(https://web.expasy.org/protparam/)进行分析, 构建氨基酸系统进化树用MEGA 7.0软件的邻接法(Neighbor-joining, NJ)发育树构建工具, 进行1000次自展检验(bootstrap)评估进化树分支可信度。

1.5 实时荧光定量PCR

以各时期采取的二倍体和三倍体雌性虹鳟的肾、肝、鳃、肌、肠等组织和卵巢的cDNA作为实时荧光定量(RT-PCR)的模板, 根据已经克隆出的虹鳟β-tubulin基因序列, 以β-actin作为内参基因, 使用Primer 5.0软件设计特异性引物(表 1), 在苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。反应体系采用Roche公司(瑞士)的SYBR Green Master 10 μL体系, SYBR Green 5 μL, 上下游引物共0.4 μL, cDNA模板0.5 μL, 加ddH₂O至10 μL。利用BIO-RAD CFX96 TOUCH荧光定量仪的2^–ΔΔCt法检测β-tubulin基因在各组织以及不同时期卵巢的相对表达量。反应设置程序为95 ℃, 10 min; 95 ℃, 10 s; 60 ℃, 30 s; 共计40个循环, 熔解曲线从65 ℃上升到95 ℃, 每秒增加0.5 ℃。

1.6 Western blot

将采取的二倍体和三倍体雌性虹鳟各时期卵巢组织剪切成细小碎块并匀浆, 按照每100 mg组织加入1 mL RIPA裂解液(Beyotime, 中国)和10 μL PMSF (Beyotime, 中国), 在冰上使其充分裂解。12 000 r/min离心5 min后, 取上清放入新的EP管。按照1︰5比例加入蛋白上样缓冲液, 煮沸10 min, 即获得各时期卵巢蛋白, 保存于–20 ℃待用。将各时期蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳, 根据蛋白Marker, 切下含有目的条带的下层分离胶, 采用PVDF膜进行转膜。转膜时需定流I = 200 mA, 时间为50 min。然后在5%的脱脂乳中封闭2 h。用PBST洗膜, 共3次, 每次10 min。以β-Tubulin的抗兔多克隆抗体为一抗(Immunoway, 美国), 按1︰1 000比例稀释在4 ℃过夜孵育, 之后用PBST洗膜三次。使用辣根过氧化物酶标记的(HRP)二抗(抗兔IgG) (Immunoway, 美国)用孵育液1︰1 000倍稀释, 37 ℃孵育2 h, 之后利用PBST洗膜三次。使用1 mL ECL超敏发光液(500 μL A+500 μL B)滴到膜上进行显影, 利用化学发光凝胶成像系统(BIO-RAD公司)进行曝光和拍照。

1.7 利用免疫组织化学方法进行切片观察

采取各时期二倍体与三倍体雌性虹鳟卵巢组织, 置于4%多聚甲醛中固定48 h, 然后从50%、70%、80%、85%、90%、95%和100%的乙醇依次进行梯度脱水, 二甲苯透明, 置于硬软蜡中包埋后, 以5 μm厚度切片制成石蜡切片, 后进行脱蜡, 在室温环境下, 将切片避光浸入3%过氧化氢(蒸馏水稀释) 10 min, 以灭活内源性过氧化氢酶, 使用EDTA溶液进行抗原修复, 在85 ℃下浸泡2 min, 在60 ℃下浸泡4 min。以β-Tubulin抗兔多克隆抗体为一抗(Immunoway, 美国), 按1︰200比例稀释在4 ℃过夜孵育, 后用酶标山羊抗兔IgG聚合物(中杉金桥公司)为二抗进行孵育, DAB显色, 苏木素复染, 最后用中性树胶封片, 使用OLYMPUS CX41的正置光学显微镜在物镜40×和目镜10×镜头下观察, 利用IC Capture 2.2软件获取图片。

1.8 数据分析与统计

使用SPSS 17软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan检验进行数据处理, 利用Origin 2017软件对统计结果进行作图, P < 0.01表示具有极显著差异性, P < 0.05表示具有显著差异性。

2 结果与分析 2.1 虹鳟β-tubulin序列分析与多序列比对

本研究通过克隆得到虹鳟β-tubulin基因开放阅读框1 533 bp, GenBank登录号: MN931398, 编码424个氨基酸。通过对其编码的蛋白质进行分析, 虹鳟β-Tubulin蛋白质的相对分子量为47.5 kDa, 理论等电点值为4.73, 不稳定指数为38.85, 此蛋白为不稳定蛋白。利用ExPASy在线分析工具, 预测结果显示该基因无信号肽, 无跨膜螺旋区, 对虹鳟β-tubulin基因的磷酸化位点进行预测, 结果表明, 含有丝氨酸(Ser)磷酸化位点18个[CKІІ(24)unsp(47/74/114/123/137/152/264/301/317/361/392/399)、cdc2(144/275)、PKC(167)、DNAPK(257)、PKA(350)], 苏氨酸(Thr)磷酸化位点18个[PKC(32/148/165/193/217/291/345)、unsp (34/253/388)、cdc2(142/)、CKІ(378)、CKІІ (175/178/408)、PKG(197)、p38MAPK(198)、DNAPK(269)], 络氨酸磷酸化位点10个[unsp(58/105/ 158/201/289/404)、INSR(49/50/162)、EGFR(401)], 其中Ser-301的得分最高为0.998。

利用BLAST在线分析软件对虹鳟β-Tubulin氨基酸与其他物种β-Tubulin氨基酸进行同源性比对, 在硬骨鱼类中, 虹鳟与银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch)同源最高, 为94.37%, 与银鲫(Carassius auratus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、斑马鱼(Danio rerio)相比分别为87.11%、93.22%、92.07%。与哺乳动物和两栖动物相比, 与鸡(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的同源性分别为93.01%、65.05%、61.18%, 与爪蟾(Xenopus tropicalis)的同源性为92.99% (图 1)。

2.2 β-Tubulin系统进化树分析

为了分析β-tubulin基因在不同物种间的进化关系, 利用与上述同种方法对15个物种的氨基酸序列进行进化分析。系统进化树结果显示: 虹鳟β-Tubulin氨基酸序列与其他鲑科鱼类比对单独为一支, 与大西洋鲑(Salmo salar)及大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)的亲缘关系最近, 其次为硬骨鱼类与哺乳类基本分为两支, 其中与鸡的亲缘关系最远, 其他鱼类亲缘关系介于两者之间(图 2)。

2.3 虹鳟β-tubulin基因在mRNA水平的表达模式

β-tubulin基因在二倍体、三倍体雌性虹鳟在胚胎发育时期的相对表达量调查结果显示, 从受精卵到桑葚期, 呈先上升后下降的趋势。2细胞期的表达量最高, 是受精卵、8细胞期、16细胞期和桑葚期的28.4、7.2、7.9和9.5倍。值得注意的是, 2细胞期与8细胞期的表达量没有显著差异(P > 0.05), 与16细胞期、桑葚期、原肠胚期和尾芽期有显著性差异(P < 0.05), 在75%外包期之后, β-tubulin基因的表达量又开始上升, 尾芽期的表达量是75%外包期的86.1倍, 在尾芽期后期出现下降趋势, 然而差异并不显著(P > 0.05)。与二倍体虹鳟相比, 三倍体虹鳟在受精卵到2细胞期有相同的上升趋势且有显著性差异(P < 0.05), 同样在2细胞期表达量最高, 是受精卵、8细胞期、16细胞期和桑葚期的2.6、4.1、6.2和6.1倍, 在2细胞期后, 呈现显著的下降趋势, 并且相对表达量较少。在2细胞期与8细胞期和16细胞期表达量有显著性差异(P < 0.05), 与二倍体虹鳟不同, 2细胞期与桑葚期的表达量无显著性差异(P > 0.05), 在桑葚期之后的发育时期, 相对表达量无显著性差异(P > 0.05)。同一发育时期, β-tubulin基因在二倍体虹鳟的表达量均高于三倍体虹鳟, 在受精卵期到桑葚期均有显著性差异(P < 0.05), 然而在2细胞期, 二倍体和三倍体虹鳟无显著性差异(P > 0.05), 在尾芽期之后的发育阶段, 二倍体与三倍体虹鳟之间均无显著性差异(P > 0.05) (图 3c)。

从实时定量的结果中可以得出, β-tubulin基因在二倍体雌性虹鳟的鳍、肾、肝、脾、肌、鳃、心、眼、肠、卵巢等10个组织中均有表达。卵巢组织与其他各组织的表达量相比有极显著差异(P < 0.01), 且β-tubulin基因在卵巢组织中的表达高于其他各组织。在其他各组织之间如肾、肝、脾、肌肉、鳃、眼、肠、鳍之间相对表达量差异不显著(P > 0.05), 但在眼中的表达, 与其他组织有显著性差异(P < 0.05) (图 3a)。

通过分析β-tubulin基因在二倍体、三倍体雌性虹鳟成鱼卵巢组织中不同发育阶段的相对表达量, 可得出以下结论, 在240—330 dpf发育阶段, 表达量呈现先上升后下降的趋势, 270 dpf表达量最高, 是240、300和330 dpf的1.2、2.2和2.8倍。270与240 dpf表达量有显著性差异(P < 0.05), 与后期表达量之间差异并不显著(P > 0.05)。三倍体虹鳟在240—330 dpf发育阶段, 总体趋势与二倍体虹鳟卵巢相对表达量相同, 在240—270 dpf阶段, β-tubulin基因的相对表达量显著的上升, 在270 dpf表达量最高, 且240与270 dpf存在极显著差异(P < 0.01), 在270 dpf发育阶段后, 呈现下降趋势, 然而270—330 dpf之间差异不显著(P > 0.05)。总体而言, β-tubulin基因在同一发育阶段中, 二倍体虹鳟较三倍体虹鳟表达量相对较高, 且在240—270 dpf阶段差异显著(P < 0.01), 在270 dpf之后, 二、三倍体虹鳟表达量之间差异并不显著(P > 0.05) (图 3b)。

2.4 二倍体与三倍体虹鳟卵巢组织学观察结果分析

在240—330 dpf阶段, 虹鳟卵巢发育时期处于Ⅱ期(韩英, 2008)。β-Tubulin蛋白在240—330 dpf发育阶段, β-Tubulin蛋白有先升高后降低的表达趋势, 在270 dpf发育阶段表达量达到最高, 然而二倍体和三倍体无显著性差异(P > 0.05)。在其他各时期, 二倍体、三倍体虹鳟均有显著性差异(P < 0.05)(图 4)。微管蛋白β-Tubulin在卵巢组织中的表达和定位分析结果如下, 对于二倍体雌性虹鳟卵巢在240 dpf, 阳性信号主要集中在细胞质(图 5A, a), 在270 dpf时, 在胞质的信号减弱, 在核内集中且此时信号最强(图 5A, b), 在300 dpf时期, 核内信号持续增强, 胞质信号明显减弱(图 5A, c), 而330 dpf时, 核内与胞质中信号减弱(图 5A, d)。与二倍体雌性虹鳟相比, 三倍体虹鳟卵巢在240—330 dpf阶段, 在卵原细胞中在细胞核的表达信号呈现先增强后减弱的趋势, 在270 dpf发育阶段, 卵原细胞核上信号最强。信号在其他时期卵原细胞核与胞质较弱, 在卵原细胞簇间隙的滤泡细胞存在较强信号(图 5B)。

3 讨论

本文以三倍体虹鳟减数分裂的发生进程中微管作用角度切入进行研究, 由于减数分裂确保了基因组的稳定性, 并在所有有性的二倍体生物中创造了遗传多样性, 多倍体物种被认为是非常难以完成正常的减数分裂和减数分裂重组, 因为它们有超过2对基因组。在单性脊椎动物多倍体, 存在几种减数分裂出现偏差情况, 包括卵原细胞融合, 减数分裂前的内复制(Neaves et al, 2011), 无融合生殖或无丝分裂, 使得获得不育卵(Monaco et al, 1984)。并且雌核发育和孤雌生殖被证明是可以繁殖可育子代, 其包含母本的所有染色体基因组, 因此是母本的克隆。在目前的研究中已观察到正常减数分裂完整模型, 而且也发现六倍体克隆单性和有性生殖模式的各种精子应答机制, 表明减数分裂完成与精子不同应答反应导致多种单性雌核发育模式和有性生殖(Zhang et al, 2015)。事实上, 在不同基因组倍性水平的绿蟾蜍(Bufoviridis亚群)和水蛙(Pelophylax esculentus)中也观察到正常的减数分裂和有性生殖(Christiansen et al, 2009; Stöck et al, 2010)。同时, 还发现有性生殖的全三倍体蟾蜍同时发生孟德尔遗传和无性基因组传递。此外, 两个对称的异源四倍体群体在经历了非有性生殖的中间过程后恢复了正常的减数分裂, 从而导致由二倍体杂交种、三倍体和四倍体组成的小型鲤科鱼(Squalius alburnoides)中形成了一个新的有性生殖多倍体(Cunha et al, 2008)。在由二倍体、三倍体和四倍体的泥鳅复合体中, 也发现了一些克隆的二倍体系可以通过孤雌生殖来繁殖, 这种多倍体泥鳅杂种可以通过减数分裂前的内复制机制产生未减数的二倍体卵。与目前分析的异育银鲫(Carassius gibelio)相似, 以上所有的多倍体谱系都是异源多倍体, 这意味着在这些多倍体动物中可能发生了类似的进化方式(Arai et al, 2013)。减数分裂的完成进一步发展并主要达到有性生殖和单性生殖等多种生殖方式。基因组复制植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)最近的一项发现表明, 适应减数分裂是成功形成多倍体的必要步骤。因此, 减数分裂的完成对多倍体脊椎动物的生殖成功和进化潜力具有重要意义(Yant et al, 2013)。

微管是包括纺锤体组装、线粒体分布、减数分裂成熟、合配和早期胚胎发育在内的一系列事件所必需(Serra et al, 2018)。其中β-Tubulin微管蛋白参与各种细胞过程, 包括减数分裂, 形态发生以及纤毛和鞭毛的运动。在发生减数分裂时微管蛋白形成二聚体, 向纺锤体和极体聚集, 进而组成纺锤体(张林等, 2014)。一般认为, 进入分裂期时, 胞质微管解聚, 重新组装形成纺锤体微管, 负责细胞中染色体排列、同源染色体与姐妹染色单体分离和极体排放; 分裂结束后, 纺锤体微管解聚, 重新组装形成胞质微管星体, 胞质微管星体在原核迁移和维持细胞亚群中起着至关重要的作用(Mori et al, 2011)。鱼类卵母细胞在减数分裂的前期I阻滞, 然后在排卵前恢复减数分裂, 并在MII再次停滞(Choi et al, 2017)。研究发现早期卵母细胞正常进行减数分裂是促进驯化斑马鱼卵巢发育的关键生殖细胞阶段。若mps1、tdrd1、vasa等基因突变, 会引起卵母细胞减数分裂异常或早期生殖细胞丢失。并且雌激素对雌性虹鳟的发育起重要作用, 激活雌激素通路能抑制卵母细胞凋亡的发生(Campbell et al, 2015)。

本研究克隆得到了虹鳟微管β-tubulin基因开放阅读框, 预测编码蛋白分析发现不存在信号肽, 且无跨膜螺旋区。在细胞周期的调控中, 蛋白磷酸化和去磷酸化发挥重要作用, β-tubulin基因可能存在的磷酸位点可知, 丝氨酸得分最高。随着脊椎动物微管蛋白由多个基因编码的发现, 提出了关于不同的微管蛋白基因产物对微管功能多样性的贡献问题。迄今为止已经在哺乳动物和鸟类中鉴定出六种微管蛋白同型。两栖动物和鱼类中的微管蛋白同种型的cDNA库与功能验证的研究较少。β-Tubulin在组织分布中研究可知, II型β-Tubulin主要在脑中, 在其他体细胞组织中仍处于较低水平。III型β-Tubulin在啮齿动物的脑和睾丸中有高水平表达, 例如猪精子鞭毛的细胞骨架(Ludueña, 1997; Pěknicová et al, 2001), β-Tubulin存在于人肿瘤亚群中, 但不存在于正常分化的神经胶质、体细胞或上皮细胞中(Katsetos et al, 2003)。在本实验实时定量结果证实, β-tubulin基因在卵巢中有特异性高表达, 且与其他组织有显著性差异。微管β-tubulin基因在虹鳟胚胎发育时期, 2细胞期二倍体虹鳟显著高于其他各时期, 在2细胞期后呈现无差异显著性低表达, 三倍体虹鳟一直呈现低表达状态。虹鳟纺锤体因子Spindlin基因在胚胎发育阶段, 二倍体虹鳟在受精期表达显著高于三倍体虹鳟, 且三倍体虹鳟同样呈现低表达状态(史秀兰等, 2021)。推测三倍体虹鳟β-tubulin和Spindlin基因低表达如何影响减数分裂及早期胚胎发育还未有定论。研究表明, 微管异常是由衰老、体外成熟、化学暴露和突变引起的。秋水仙碱等药物会造成微管异常, 进而影响卵母细胞减数分裂成熟过程(Zhang et al, 2017)。在鱼类三倍化过程中, 是否打破了微管形成的动态平衡, 从而造成微管异常还需进一步研究。在240—330 dpf, β-tubulin基因在三倍体虹鳟中的表达显著低于二倍体虹鳟。由于三倍体虹鳟存在第三套染色体, 在同源染色体联会阶段发生紊乱, 使得减数分裂不能正常进行, 卵母细胞成熟受阻, 推测与三倍体虹鳟的β-tubulin基因低表达有关。在黄天晴(2017)的研究中发现, β-tubulin基因在此发育阶段与肿瘤抑制基因p53 (Tumor suppressor gene, p53)在二倍体、三倍体虹鳟卵巢组织的表达量变化趋势一致, p53对调控细胞自噬的机制有重要作用, p53 的靶基因是DRAM (Damage-regulated autophagy modulator), 其编码的溶酶体蛋白能够诱导细胞自噬, 是p53诱导细胞凋亡的效应器, p53通过DRAM途径来调节细胞自噬, 由此引起细胞凋亡(黄天晴, 2017)。纺锤体是一个动态的微管结构, 对于正常体细胞, 有丝分裂染色体错误分离可能引起肿瘤, 对于生殖细胞, 减数分裂染色体的分离异常, 引起不育(Marlow, 2018)。然而β-Tubulin微管蛋白与肿瘤发生和细胞自噬调节机制关系, 与三倍体虹鳟性腺败育的关联还需进一步探讨。

在三倍体虹鳟在300 dpf以后发育阶段, β-tubulin基因表达有上升趋势, 在前期的研究中表明, 由于发生性腺败育而形成的卵原细胞簇, 进行再分化形成类生精细胞囊, 此时与卵原细胞簇并存, 且类生精细胞囊成为性腺结构的主要组成成分, 卵巢呈现类雄性化, 无法排出精子, 最终会出现大量败育的精子细胞(韩英等, 2010), 推测为上升的主要原因。虹鳟卵母细胞内的骨架结构, β-Tubulin蛋白主要集中于卵细胞细胞质及滤泡细胞和支持细胞中, 研究表明, 在240—330 dpf发育阶段, 二倍体虹鳟卵巢发育时期处于Ⅱ期, β-Tubulin蛋白呈现与Spin较一致的变化趋势, 这证实了β-Tubulin微管蛋白在减数分裂期间, 微管集中分布在纺锤体组装区域, 这与哺乳动物卵母细胞成熟中微管的分布模式基本一致, 生发泡期在细胞质中分布均匀, 发生生发泡破裂后, 迅速向卵母细胞皮层集中; 减数分裂纺锤体和极体形成时, 微管向纺锤体和极体聚集, 推测这可能与维持纺锤体和中心体位于细胞周边位置有关。

4 结论

本文研究了微管β-tubulin基因在二倍体与三倍体虹鳟胚胎与240—330 dpf时期在卵巢中的表达与定位情况, 结果表明三倍体虹鳟中β-Tubulin微管蛋白的异常表达可能是导致性腺败育的原因之一, 研究结果为探明多倍体鱼类性腺发育过程中卵母细胞减数分裂受阻提供基础理论。