颜色多态性是指在自然环境中, 一个物种的不同或同一群体中不同个体呈现出两种或两种以上可遗传的分离且不连续的颜色表型(Mckinnon et al, 2010)。贝壳颜色的不同会影响消费者的选择, 日常生活中, 消费者更倾向于购买颜色鲜艳的海产品(Brake et al, 2004)。研究发现, 贝壳颜色的不同对软体动物的生长、繁殖、抗氧化等多个方面都会产生影响(Adzigbli et al, 2020)。Ge等(2015)发现, 紫壳长牡蛎家系的存活率显著高于其他壳色。近年来, 随着软体动物选择育种研究的发展, 贝壳颜色作为一种重要的性状被广泛应用于多种软体动物的选育, 例如: 长牡蛎(Crassostrea gigas), 虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)(Sun et al, 2015)、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)(Chen et al, 2017), 其中长牡蛎已被成功选育出黑壳、紫壳、橙壳、金壳和白壳等多种壳色的新品系(Zhu et al, 2018)。

软体动物的壳色通常是因不同色素沉积所形成, 例如: 吡咯、黑色素、卟啉、胆汁素、类胡萝卜素等, 其中黑色素的分布最为广泛(Stemmer et al, 2014; Williams, 2017; Liu et al, 2020)。黑色素可以保护生物免受寄生虫、污染物、低温、氧化应激和紫外线的影响, 参与器官的发育调控, 具有极为重要的作用(Dubey et al, 2014)。黑壳长牡蛎不仅外壳黑, 其外套膜及闭壳肌痕均呈现黑色, 富含黑色素, 具有较高的价值。研究表明, 高浓度双酚A (Bisphenol A, BPA)暴露后, 富含黑色素的黑壳长牡蛎组织未出现较为明显的病理变化, 表明黑壳长牡蛎与白壳长牡蛎相比可能具有更强的免疫力(姜秋云, 2019)。

微生物在动物的生存、生长代谢、营养物质吸收等过程中发挥着重要的作用(Bang et al, 2018)。随着高通量测序技术的发展, 越来越多的研究采用高通量测序的方法从种群结构、进化关系、群落多样性与环境之间的协作关系等多个方面对微生物进行研究。King等(2012)首次利用16S rRNA基因测序技术对美洲牡蛎(Crassostrea virginica)肠道和消化腺内的微生物种群组成进行探究。目前高通量测序技术在双壳贝类微生物多样性研究的应用主要集中在不同环境软体动物各组织微生物群落组成情况及差异细菌的作用分析(Madigan et al, 2014; Dubé et al, 2019; Horodesky et al, 2020); 致病菌对软体动物生长发育的影响等方面(Labare et al, 1990; Stevick et al, 2019)。对双壳贝类壳表面微生物的研究相对较少。已有的研究表明, 变形杆菌是双壳贝类壳表面的主要优势细菌, 美洲牡蛎壳表面微生物群落主要由α变形杆菌(Alphaproteobacteria)组成, 而加州贻贝(Mytilus californianus)壳表面微生物则以γ变形杆菌(Gammaproteobacteria)为主(Pfister et al, 2014; Arfken et al, 2017)。

在黑壳长牡蛎的繁育过程中发现, 成体长牡蛎(壳长10—12 cm左右)经过约30 d室内养殖后, 其外壳表面颜色会变浅, 失去光泽, 出现壳褪色现象。在自然海区中养殖的黑壳长牡蛎则未发生外壳褪色的现象(图 1)。一般而言, 不同的海区、不同的季节海洋水体理化性质具有较大的差异, 水体中微生物组成和丰度随季节等因素的变化有所改变(Wang et al, 2020)。受水环境的影响, 长牡蛎壳表面微生物组成上可能存在较大的差异。本研究以海区正常养殖及发生褪色现象的黑壳长牡蛎的壳表面微生物为研究对象, 对壳表面微生物的16S rRNA基因Ⅴ3—Ⅴ4区进行扩增并测序, 比较其微生物群落组成上的差异。从微生物多样性的角度, 探究了长牡蛎壳色的维持机制及褪色现象发生的原因。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验用黑壳长牡蛎均来自于山东省长岛县南长山岛连城湾海区养殖的个体选育家系。选取12只壳长(10—12 cm)、壳宽(4—6 cm)、壳高(2—3 cm)无显著差异的个体作为实验对象。随机挑选其中6只黑壳长牡蛎转入室内养殖实验室, 使用50 L玻璃缸养殖, 定时投喂密度为5.0×10⁵个/mL的优质金藻, 喂食后3 h内换水一次, 养殖用海水取自山东省烟台市周边海区; 另外6只则继续在南长山岛海区中吊笼养殖。养殖期间, 自然海区及室内环境的盐度、温度及pH如表 1所示。养殖30 d后, 分别对自然海区养殖未褪色黑壳长牡蛎样本(B组), 实验室内养殖褪色黑壳长牡蛎样本(F组)外壳表面微生物进行取样。取样时, 使用消毒棉签蘸取牡蛎壳表面的微生物, 随即将棉签保存至2 mL的冻存管中, 置于-80 ℃低温冰箱保存。

1.2 壳色差异分析

利用Image-Pro Plus图像分析软件对实验所用黑壳长牡蛎外壳的光密度值(optical density values, ODV)进行测量, 用以表征壳表面的颜色变化。将长牡蛎外壳清洗干净后, 使用数码相机拍摄牡蛎壳照片。拍照时, 在相机的两边放置同等功率的日光灯, 以去除阴影的影响。测量/计数/尺寸/比例调节器设置为牡蛎壳的轮廓, 选定测定区域, 进行光密度的测定。强度校准设定为标准光密度, 灰度值转换为光密度值(ODV), 范围从0 (完全白色)到2.0 (完全黑色)。

1.3 DNA的抽提与PCR扩增测序

使用DNeasy®Power Water®Kit试剂盒(QIAGEN)进行基因组DNA的提取, 利用1%的琼脂凝胶电泳对基因组DNA的质量进行检测。16S rRNA Ⅴ3-Ⅴ4区的PCR扩增引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′)。反应程序: 95 ℃ 30 min; 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s, 27个循环; 72 ℃ 10 min。PCR反应体系如表 2所示。

利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的质量, 使用AxyPrep DNA胶回收试剂盒(Axygen Biosciences)切胶回收PCR产物, 最后使用Illumina MiSeq PE2500测序平台进行测序。

1.4 16S rRNA基因测序数据分析

为减少干扰数据的存在, 对原始测序数据进行如下的预处理: (1) 数据质控与优化统计, 使用Prinseq软件对测序数据质量进行控制, 去除序列长度小于50 bp的短片段和低复杂度序列。使用FLASH软件对测序数据进行拼接。(2) 去除嵌合体及靶区域外序列, 采用Mothur软件进行测序错误的矫正及去除嵌合体的操作。(3) 操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)注释, 提取优化序列的非重复序列, 按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行聚类。(4) 分类学注释, 利用Silva数据库(https://www.arb-silva.de/版本号: 132)进行16S rRNA基因的比对。使用RDP classifier数据库(http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp)进行物种分类学分析, 统计在各分类水平下微生物群落的组成情况。

预处理完成后, 进行如下的统计分析: (1) 使用Mothur软件对微生物群落进行Alpha多样性分析。使用Shannon指数绘制稀疏曲线, 以反映测序量的合理性。(2) 使用Qiime软件进行Beta多样性分析。(3) 利用Wilcox秩和检验(Wilcoxon rank-sum test)进行组间显著性差异检验, 使用FDR (false discovery rate)对P值进行校正。(4) 利用线性判别分析(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)筛选出在两组之间存在显著性差异, 具有生物学意义的物种, 并估算每个物种所产生的影响。比较策略选择all-against -all。(5) 基于皮尔逊相关系数分析环境因素与壳表面微生物群落之间的关系。

2 结果 2.1 壳色变化分析

ODV值的大小可间接反映黑壳表面的色素变化情况, 测定结果如图 2所示。B组长牡蛎外壳表面的平均ODV值为0.68, F组长牡蛎外壳表面的平均ODV值为0.34, B组平均ODV值是F组的2倍, 两组样本平均ODV值存在极显著的差异(P < 0.01)。相比于自然海区养殖的长牡蛎, 室内养殖的长牡蛎外壳颜色变浅, 出现较为明显的褪色现象。

2.2 细菌群落Alpha多样性分析

测序结果显示, 有效序列数目在43 782—52 116之间, 序列平均长度为417.20 bp。本次测序共获得的4 728个OTU, 涵盖43个门, 99个纲, 199个目, 362个科、665个属, 1 271个种。两组样本的平均覆盖度(Coverage)均在98%以上, Coverage指数接近于1, 测序深度基本覆盖样本中的所有物种。Alpha多样性指数可反映微生物群落的丰富度与均匀度, 常使用Shannon指数、Simpson指数、ACE指数和Chao指数的大小表征。结果显示: B组的Shannon指数、ACE指数和Chao指数略高于F组, 而F组Simpson指数更高(表 3)。Wilcoxon秩和检验显示, 两组样本的各Alpha多样性指数之间无显著性差异。稀疏曲线显示, 随着测序数据量的增加, 曲线逐渐趋于平缓, 当测序数据量在10 000时, 测序数据达到饱和(图 3)。上述分析结果表明, 两组长牡蛎壳表面微生物群落物种组成较为丰富, 微生物群落的丰富度、均匀度均较高。

2.3 Beta多样性分析

在OTU水平上, 基于Bray-Curtis距离算法, 利用非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)反映细菌群落的Beta多样性。NMDS分析结果显示, 组内各个样本点分布区域比较密集, 微生物群落结构相似, 差异较小(图 4)。B组和F组的细菌形成了两个不同的群落空间结构, Beta多样性存在显著差异(Stress=0.124, P < 0.01)。使用相似性分析(analysis of similarities, ANOSIM), 探究两组样本间的微生物群落组成的差异性。ANOSIM分析结果表明, 两组样本的组间差异明显大于组内差异, 两组间的微生物群落结构差异显著(R=0.307, P < 0.05)。上述分析结果显示, B组与F组之间的微生物群落分布差异较大, 而分组内的样本差异较小。

2.4 微生物群落结构组成分析

Venn图可以直观的反映两组样本细菌群落OTU组成的差异性和重叠关系。两组样本微生物共有OTU数目为3 456 (图 5)。在B组中, OTU的数目共计4 130, 独有OTU的数目674, 独有OTU占B组OTU总数的16.32%。独有OTU多隶属于酸杆菌门(Acidobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、俭菌超门(Parcubateria)等。在F组中, OTU数目共计4 054, 独有OTU的数目为598, 独有OTU占F组OTU总数的14.75%。F组独有OTU多隶属于变形杆菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、Latescibacteria菌及浮霉菌门(Planctomycetes)等。从微生物的组成上看, 两组之间独有的OTU数目相对较少, 所占比例较小, 但分类较为丰富, 隶属于多个细菌门类。

对长牡蛎壳表面的微生物群落组成分析, 主要在门(phylum)和属(genus)两个分类学水平上展开。门水平上, 微生物群落主要由10个细菌门组成, 各样本中细菌丰度的差异如图 6a所示。变形杆菌是主要的优势菌, 在两组样本中的丰度超过50.00%, 且以α变形杆菌的红杆菌科(Rhodobacteraceae)为主。拟杆菌门为第二优势菌, 在B组和F组中的丰度分别为19.70%和20.20%。其他优势菌如: 蓝细菌(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)及浮霉菌门(Planctomycetes)等, 在样本中的丰度均超过1.00%, 但丰度较低(表 4)。

属水平上, 丰度排名为前25的细菌丰度差异结果如图 6b所示。norank_c_Cyanobacteria的丰度超过7.00%, 是主要的优势细菌。属水平上, 两组中丰度均超过1.00%的细菌有4种隶属于变形杆菌门, 它们分别是: unclassified_f_Rhodobacteraceae、norank_f_ JTB255marine_benthic_group、Candidatus_Tenderia和norank_f_OCS116_clade, 其中unclassified_ f_Rhodobacteraceae的丰度超过4.00%。Aquimarina细菌在两组样本中的丰度仅次于norank_c_ Cyanobacteria和unclassified_f_Rhodobacteraceae (表 5)。

2.5 组间差异显著性检验

Wilcox秩和检验结果显示: 放线菌门、俭菌超门和Bacterial rice cluster 1 (BRC1)在两组之间存在较为显著的差异(P < 0.05)。放线菌门和俭菌超门的细菌在F组的丰度极显著高于B组的丰度(P < 0.01), 且放线菌门和俭菌超门细菌的丰度之间存在极显著的相关性(P < 0.01)。而BRC1菌则在B组的丰度(0.03%)显著高于F组(0.01%)(P < 0.05)。皮尔逊相关分析表明, 放线菌门、俭菌超门细菌的丰度与黑色素含量之间存在显著的负相关性(P < 0.05), BRC1细菌的丰度与黑色素的含量无明显的相关性。

属水平上, 67个属在两组间存在显著性差异(P < 0.05), 其中有19个属在两组间存在极显著性差异(P < 0.01)。如图 7所示, 属水平上, 平均丰度处于前25的细菌, 有7种在两组之间存在显著差异, 其中norank_f_ OCS116_clade、norank_f_Sav0996_marine_group、norank_o__Acidimicrobiales、norank_f_Parcubacteria、norank_c__OM190在F组中丰度较高, 与B组存在较大差异。B组中, 玫瑰变色菌属(Roseovarius)、Robiginitomaculum的丰度较高, 与F组存在显著差异(P < 0.05)。除此之外, 科尔维尔氏菌属(Colwellia)在B组的丰度显著高于F组, 其相对丰度仅次于norank_o_NB1-j。norank_f_OCS116_clade、norank_f_ Sav0996_marine_group和norank_f_Parcubacteria细菌丰度与长牡蛎黑色素含量之间存在显著的负相关关系(P < 0.05)。其他几种差异细菌的丰度与长牡蛎黑色素含量之间无显著的相关性。在两组中, 存在显著差异的细菌属多隶属于变形杆菌门、放线菌门、浮霉菌门及拟杆菌门等, 变形杆菌门是丰度最高的细菌。在两组样本中丰度较高的物种, 比如: norank_c_ Cyanobacteria菌、unclassified_f_Rhodobacteraceae和Aquimarina则在两组样本中不存在显著性差异。

LDA分布柱状图表明: 当LDA阈值设定为3.00时, 两组样本间共有17个物种的丰度存在显著差异(P < 0.05)(图 8)。B组中Robiginitomaculum、科尔维尔氏菌属、玫瑰变色菌属和OM60_NOR5_clade等细菌分值较高, 其中Robiginitomaculum的LDA分值最大(LDA=3.75), 产生的影响较大。F组的norank_f_ OCS116_clade、norank_o_Acidimicrobiales、norank_f_ Sav0996_marine_group、norank_p_Parcubacteria等细菌的分值较高, 与B组存在显著差异(P < 0.05), norank_ f_OCS116_clade是LDA分值最大的细菌(LDA=3.88)。

2.6 环境因素对微生物群落的影响

利用皮尔逊相关系数反映微生物群落与水体环境之间的正负相关性。如图 9所示: 属水平上, 相对丰度在前25的细菌中, 有5种细菌丰度与水体环境之间存在相关性。norank_c__OM190、norank_f__ OCS116_clade、norank_f__Sva0996_marine_group、norank_o__Acidimicrobiales、norank_p__Parcubacteria与盐度和温度之间存在显著的正相关, 与pH之间存在显著的负相关(P < 0.05)。而Roseovarius与pH之间存在显著的正相关, 与盐度和温度则呈现负相关关系(P < 0.05)。

3 讨论

研究表明, 外壳表面沉积不同种类的色素使贝类呈现出多彩的颜色。外壳表面黑色素的沉积使长牡蛎呈现黑色(Williams, 2017)。本实验所用长牡蛎富含黑色素, 不仅外壳黑, 外套膜和闭壳肌痕均呈现黑色。目前, 对于长牡蛎黑色素的发生机制尚未有明确的结论。Yu等(2017)的研究表明, 视黄醛脱氢酶、酪氨酸酶和细胞色素P450等基因家族可能在长牡蛎黑色素沉积过程中发挥重要作用。

已有对长牡蛎微生物群落的研究多集中在不同组织之间。在长牡蛎鳃、外套膜和血淋巴中, 变形杆菌为主要优势细菌; 而消化腺中变形杆菌、拟杆菌及放线菌的丰度较高(Fernández et al, 2014; Lokmer et al, 2016)。针对牡蛎壳表面微生物的研究相对较少。例如: Arfken等(2017)发现, 美国大西洋沿岸的美洲牡蛎(Crassostrea virginica)壳表面微生物群落组成主要以α变形杆菌中的鞘氨醇单胞菌科(Sphingomonadaceae)、Erythrobacteraceae科和红杆菌科(Rhodobacteraceae)为主。在韩国沿海废弃牡蛎壳表面, 变形杆菌所占比例达到了41%, 其次为拟杆菌(36.4%), 厚壁菌(Firmicutes)所占比例不足10%(Math et al, 2010)。本研究显示, 两种不同环境中的长牡蛎壳表面的主要优势菌同样为变形杆菌门, 其丰度超过50%, 以α变形杆菌为主。变形杆菌是海洋细菌中最重要的类群, α变形杆菌占海洋微生物总数的10%左右(Park et al, 2014; 张作峰等, 2020)。并且山东烟台周边海域海洋水体中α变形杆菌亦是第一优势菌(张艳, 2010)。因此, 长牡蛎所处水体环境与壳表面优势细菌的组成具有极大的相似性。

进一步的分析显示, 在微生物群落的组成上, 两种水体环境中长牡蛎壳表面的微生物群落组成上存在一定差异。门水平上, BRC1细菌在B组的丰度远高于F组, 而放线菌门和俭菌超门在F组的丰度更高。

BRC1细菌广泛存在于富含有机物的环境中(Kadnikov et al, 2019), 目前尚未成功培养出BRC1细菌门的菌株, BRC1细菌的具体功能尚不清晰, 仍需进一步的研究。在F组中, 放线菌所占比例达到了6.14%, 约是B组的两倍。放线菌广泛存在于各种环境中, 具有强大的生物合成潜力, 能够产生具有较强抗菌活性的次级代谢产物。放线菌还具有降解有机物的作用, 其产生的水解酶可降解各种生物聚合物, 例如: 纤维素、木聚糖和几丁质, 在氮碳循环过程中发挥着重要的作用(Manivasagan et al, 2013; Fernández et al, 2014)。除放线菌外, 在F组的长牡蛎壳表面发现, 俭菌超门的丰度(2.19%)高于B组(1.20%)。俭菌超门细菌的基因组几乎都在1 Mb以下, 缺乏能量代谢的关键基因。因此, 俭菌超门细菌无法单独生活, 需要与其他微生物共生生活, 例如放线菌等(Nelson et al, 2015)。相关性分析结果表明, 俭菌超门与放线菌的丰度存在极显著的相关性(P < 0.01)。俭菌超门的部分细菌同样具有降解功能, 可以降解环境中的纤维素和甲壳素(Nelson et al, 2015; 陶晔等, 2020)。长牡蛎壳中的黑色素不溶于水, 与蛋白质、多糖等生物聚合物结合紧密(何成等, 2017)。F组中, 放线菌和俭菌超门细菌的大量聚集可能促进了长牡蛎壳表面生物聚合物的降解过程, 从而发生了壳褪色现象。

门水平上, 存在显著差异的细菌的数目较少, 多数细菌的丰度无较大的差异。属水平上, 差异细菌的数目较多, 超过50个属在两组之间存在显著的差异。相比于F组, 玫瑰杆菌属、科尔维尔氏菌属和Robiginitomaculum在B组长牡蛎黑壳表面的丰度均较高。

玫瑰杆菌属广泛存在于各种海洋介质中, 比如海水、沉积物、海冰等。玫瑰杆菌属通过脱甲基途径和裂解途径将海洋中的有机硫化物二甲基疏基丙酸内盐(Dimethylsulfoniopropionate, DMSP)代谢分解, 参与硫循环(Sun et al, 2016)。在本次测序中, 玫瑰杆菌属在B组的丰度为1.64%, 高于F组的1.00%。推测其可能的原因是水体环境的不同造成细菌丰度的差异。科尔维尔氏菌属是嗜冷菌, 在海冰、极地沉积物、深海海沟中均有发现(Nogi et al, 2004)。科尔维尔氏菌属具有降解碳氢化合物的作用, 在溢油环境中, 可大量检出(Gutierrez et al, 2013; Mason et al, 2014)。Robiginitomaculum与科尔维尔氏菌的作用相似, 同样具有降解碳氢化合物的作用。富含碳氢化合物的沉积物中Robiginitomaculum菌的丰度和多样性都会升高(Guibert et al, 2012; Hestetun et al, 2015)。

在南长山岛养殖的黑壳长牡蛎壳表面, 科尔维尔氏菌和Robiginitomaculum的丰度均高于室内养殖的长牡蛎。可能是由于外源水体的排放, 导致渤海湾水体中的碳氢化合物含量较高, 促进了具有降解功能细菌的繁殖, 例如科尔维尔氏菌和Robiginitomaculum。因此, 水体环境可能对细菌的丰度产生较大的影响。然而, 由于科尔维尔氏菌属和Robiginitomaculum属细菌难以独立培养, 在长牡蛎壳色维持方面所起到的作用尚不明确, 仍需进一步的探索。

微生物群落的组成是动态的, 受地理环境的影响较大, 随盐度、温度、pH值等环境因素的变化而变化(Prieur et al, 1990; Harris, 1993; Jing et al, 2019)。自然海区养殖的长牡蛎生活环境复杂多变, 在潮汐、波浪等风力或水力的作用下, 水体不断混合, 水体微生物处于不断的变化之中。皮尔逊相关性分析结果表明, 在两组样本中存在显著差异细菌的丰度与水体环境之间存在较强的相关性。其中norank_c__ OM190、norank_f__OCS116_clade、norank_f__ Sva0996_marine_group、norank_o__Acidimicrobiales、norank_p__Parcubacteria细菌的丰度与盐度和温度之间存在显著的正相关关系, 与pH之间存在显著的负相关关系(P < 0.05)。而Roseovarius细菌的丰度与pH之间存在显著的正相关关系, 与盐度和温度则呈现显著的负相关关系(P < 0.05)。因此, 环境条件与微生物丰度之间相关性较强, 并可影响微生物的丰度。

4 结论

与自然海区相比, 室内养殖的长牡蛎发生了壳褪色现象, 且黑色素含量显著下降。壳表面微生物多样性分析表明, 两种环境中养殖的长牡蛎微生物群落在种类组成上无较大的差异, 但是细菌的丰度有所不同。变形杆菌门是长牡蛎壳表面微生物群落的主要优势菌, 其丰度在两组中超过50%。褪色黑壳长牡蛎表面具有降解作用的细菌丰度较高, 例如放线菌门和俭菌超门, 推测其可能参与长牡蛎壳褪色过程, 环境条件的不同可影响长牡蛎壳表面细菌的丰度。本研究从微生物多样性的角度, 解析了黑壳长牡蛎壳表面褪色现象的可能原因。