米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)是世界广布种, 能够产生毒素, 无需大量细胞就可以严重危害当地生态环境。近年来在我国珠江口、闽江口和长江口频发赤潮, 给养殖业造成了巨大损失, 受到广泛关注(郜钧璋等, 2017; 李晓东, 2018; 吕颂辉等, 2019)。通常认为赤潮的暴发与富营养化有关, 但是米氏凯伦藻赤潮常发生在潜在的磷限制海区(Xu et al, 2008; Liu et al, 2009), 可见其对于低磷环境可能有着特殊的适应机制。

目前学者认为浮游植物的低磷适应策略, 主要有三个方面: 提高对外界磷源的吸收水解利用能力(Ou et al, 2015)、利用胞内磷储库(Martin et al, 2014)和减少细胞磷需求(Martin et al, 2011)。已有对米氏凯伦藻耐低磷机制的研究多集中在对胞外磷源利用方面, 如米氏凯伦藻通过5′-核苷酸酶水解ATP, 吸收利用水解产物磷酸盐基团(Luo et al, 2017); 直接吸收利用葡萄糖-6-磷酸(Zhang et al, 2017); 吞噬细菌和微藻获得颗粒态的磷源(Zhang et al, 2011)。目前, 有关米氏凯伦藻对胞内磷储库利用机制的研究很少, 无法揭示其对胞内磷储库的利用能力和机制。

多聚磷酸盐(polyphosphate, polyP)作为胞内磷储库的重要组成部分, 由几个到上百个磷酸基团经高能磷酸酐键连接形成的链状无机化合物, 是细胞内重要的磷酸盐储库, 也是细胞内能量储库及ATP来源(Achbergerová et al, 2011)。在环境中无机磷酸盐基团(inorganic phosphate, Pi)充足时, 大多数浮游植物具有过量吸收Pi的能力, 在满足细胞代谢和生长的同时, 将多余的Pi以polyP的形式储存起来。这部分磷将保证细胞在低磷时继续维持短时间的高生长速率(Rao et al, 2009)。然而浮游植物调控polyP的机制并不完全清楚。近年来, 对于polyP的研究大多是大尺度的环境调查(Martin et al, 2014, 2018; Diaz et al, 2016)。有必要开展更精细的室内研究, 在复杂的磷变化下, 研究polyP的动态响应。本研究通过分析外界环境磷浓度变化下米氏凯伦藻的生理生长状态, 分析细胞polyP含量变化, 阐明米氏凯伦藻对polyP储存和利用策略, 以期从磷营养盐动力学角度为米氏凯伦藻赤潮的发生提供科学解释。

1 材料与方法 1.1 藻种来源与培养条件

米氏凯伦藻(No. HK-5)由暨南大学赤潮与海洋生物学研究中心藻种室提供, 采用人工海水L1培养基进行培养, 温度(20±1) ℃, 光照条件为100 μmol/(m²·s), 光暗周期为12 h : 12 h。培养期间添加抗生素合剂(氨苄青霉素200 μg/mL、链霉素100 μg/mL和卡那霉素100 μg/mL)抑制细菌的生长。正式实验前, 培养藻液经5 µg/mL DAPI (Sigma)染色过滤到黑膜上(Millipore), 置于荧光显微镜(Olympus, BX61)下用100×镜观察计数, 检测藻液是否受到细菌污染。

1.2 不同磷浓度及磷恢复下对米氏凯伦藻的影响实验设计

米氏凯伦藻的起始细胞密度为5.0×10³ cells/mL, 设置2个实验组别: 高磷组(NaH₂PO₄终浓度为40 μmol/L)和低磷组(NaH₂PO₄终浓度为5 μmol/L), 每组3个平行样。每天检测细胞密度、溶解态无机磷(dissolved inorganic phosphorus, DIP)含量。选择在第0、3、4、7和10 d检测颗粒磷(particulate phosphorus, PP)和polyP含量。待低磷组DIP浓度低于检出限(0.10 μmol/L) 7 d后, 进行磷恢复实验。两组处理组同时添加NaH₂PO₄恢复DIP含量至~32 μmol/L, 在添加后的0、24和48 h, 检测细胞密度、叶绿素a (chl a)含量、最大光化学量子效率(F_v/F_m)、碱性磷酸酶活性(alkaline phosphatase activity, APA)、polyP和PP含量。

1.3 磷酸盐及生理参数检测方法

浮游植物细胞样品经酸性Lugol’s试剂固定后, 采用100 μL浮游计数框在光学显微镜(Olympus CX23, Janpan)下计数。微藻培养液经离心(2 400 g, 5 min)收集, 用于polyP测定; 微藻培养液经GF/F滤膜(450 ℃煅烧2 h)过滤, 滤液和滤膜分别用于DIP和PP测定。采用磷钼蓝法(Murphy et al, 1962)检测DIP、Solórzano等(1980)方法测定PP、Ou等(2015)方法测定APA、丙酮萃取法测定chl a含量(Jespersen et al, 1987), 以及Phyto-PAM法测定光化学效率F_v/F_m。PolyP样品通过离心(2 400 g, 5 min)方法收集。测定方法参照Martin等(2013) DAPI荧光定量法: 收集的藻细胞超声破碎细胞后, 添加DNA酶、RNA酶和蛋白酶K, 重复萃取3~4次; 取500 μL萃取液加入60 μL 100μmol/L DAPI溶液, 黑暗染色7 min, 摇匀定容至1.5 mL, 采用荧光分光光度计(HITACHI, F-4600)在Ex: 415 nm和Em: 550 nm条件下检测。

1.4 polyP净产生速率计算及数据分析

参考Anderson等(1990)毒素净产生速率的计算公式计算polyP净产生速率, 如下:

式中P_t1、P_t0代表t₁和t₀时polyP含量, N为细胞密度均值对数, N_t1、N_t0代表t₁和t₀时细胞密度。

实验数据采用Sigmaplot 14作图, 采用One-way ANOVA(Turkey test)分析显著性水平(P < 0.05)。

2 结果 2.1 米氏凯伦藻的生长和生理活性

高磷组和低磷组DIP浓度均随时间逐渐下降, 从第4 d起低磷组DIP浓度低于检出限, 而高磷组至第10 d DIP浓度为(8.02±0.64) μmol/L; 在第11 d重新添加NaH₂PO₄, 恢复DIP含量至~32 μmol/L, 添加后低磷组DIP被快速消耗, 至第13 d DIP浓度再次低于检出限(图 1a)。低磷组细胞生长与高磷组无显著差异(P > 0.05), 均以0.15 d^–1生长速率生长, 细胞密度从(5.17±0.26)×10³ cells/mL增至(2.22±0.14)×10⁴ cells/mL, 约增长4.29倍(图 1b); 在磷恢复阶段, 低磷组米氏凯伦藻以0.12 d^–1生长速率持续生长, 在实验结束时达到最大细胞密度(4.64±0.26)×10⁴ cells/mL, 而高磷组在第12 d进入稳定期, 最大细胞密度到达(3.68±0.12)×10⁴ cells/mL, 高、低磷组最大细胞密度无显著差异(P > 0.05)。

在长时间的磷饥饿后, 低磷组第11 d检测到APA为(208.58±27.56) fmol/(cell·h), 约为高磷组的25倍(P < 0.05, 图 2a); 加磷恢复后, 低磷组APA迅速降至(73.04±10.67) fmol/(cell·h), 但仍显著高于高磷组(P < 0.05)。磷恢复当天和之后两天, 两组间的单位细胞chl a含量及F_v/F_m无显著性差异(P > 0.05, 图 2b, 2c)。

2.2 米氏凯伦藻细胞PP和polyP含量

第1 d, 高磷组细胞PP含量显著上升至(2.13±0.13) pmol/cell, 维持在1.84~1.97 pmol/cell至第11 d (图 3); 加磷恢复后, 小幅下降至1.41~ 1.64 pmol/cell。第1 d, 低磷组细胞PP含量达到最大(1.63±0.06) pmol/cell, 之后持续下降至(0.42±0.08) pmol/cell; 这个过程中低磷组细胞PP显著低于高磷组(P < 0.05), 最大差别可达3.88倍。添加NaH₂PO₄后24 h即第12 d, 低磷组单位细胞PP含量恢复至高磷组水平(P < 0.05), 第13 d又开始下降, 与高磷组有显著差异(P < 0.05)。

整个实验过程中, 高磷组和低磷组的米氏凯伦藻单位细胞polyP含量均呈现下降、上升再下降的变化趋势, 两组之间没有显著差异(P > 0.05, 图 4a)。但低磷组polyP : PP比值在DIP耗尽时(第4 d)开始高于高磷组, 约为高磷组的2.9~3.3倍(P < 0.05)至第11 d磷恢复前。加磷恢复后, 低磷组polyP : PP比值因PP上升而回落, 与高磷组无差异(P > 0.05, 图 4b)。对比不同磷浓度下polyP净产生率, 发现环境磷酸盐富余时米氏凯伦藻合成polyP。第3 d高磷组polyP净产生率到达(8.57±1.14)×10^–7 neq/(cell·d), 随后迅速下降达到稳态; 而低磷组在第3和4 d维持较高净产生率, 最大值为(3.85±2.93)×10^–7 neq/(cell·d), 第7 d达到稳态, 第11 d时再次发生下降(图 4c)。

3 讨论

本研究发现米氏凯伦藻有较强的耐磷特性。在环境中DIP耗尽(< 0.12 μmol/L)后的7 d内, 仍以0.15 d^–1生长速率维持生长, 细胞密度增长4.29倍, 其生物量及F_v/F_m与同时期高磷组无显著差异, 同时, 缺磷条件下, 米氏凯伦藻单位细胞PP含量逐渐下降, 不断接近最低阈值, 为米氏凯伦藻细胞最低磷需求, 高低磷组间PP含量最大差别可达3.88倍, 表明米氏凯伦藻在DIP不足时能够立刻转向利用胞内磷储库来维持生长, 满足细胞分裂将近2次, 同时光合速率不受影响。该结果与冯青靓(2021)研究一致。而在磷补充后, 经过一段时间磷胁迫下的米氏凯伦藻从环境中快速获取DIP, 单位细胞PP含量迅速恢复至磷饱和水平, 这表明在外界波动的磷环境条件下, 米氏凯伦藻的胞内磷储库有具有重要的调节作用。

PP作为浮游植物总磷储库概念, 包括细胞内绝大部分磷组分, 能够在磷匮乏时提供磷源(Karl, 2014)。本研究中, PP能够支持米氏凯伦藻至少7 d的生长, 该结果与黄银爽(2018)和冯青靓(2021)研究相近, 两者结果均显示PP能够满足米氏凯伦藻5 d生长。若将胞内磷储库细分, 一般认为浮游植物中有4种重要的磷储库: polyP、磷脂、核酸和胞内DIP (Karl, 2014)。其中, polyP作为重要的胞内磷储库, 广泛存在于原核和真核细胞中(Kulaev et al, 2004)。在外界环境营养充足的情况下, 浮游植物会过量摄取Pi, 满足自身生长分裂需求后, 将多余的磷以polyP形式储存(Rao et al, 2009)。此外, polyP也是能量储库, 是ATP的主要来源(Achbergerová et al, 2011)。本次实验米氏凯伦藻中检测到polyP含量约4×10^–5 neq/cell, 第4 d后单位细胞polyP含量逐渐下降, 即使磷恢复也无明显增加。推测磷恢复后, 米氏凯伦藻细胞分裂加快, 稀释细胞polyP含量增加, 掩盖了其变化趋势。

细胞polyP净产生率较细胞polyP含量更好地反映细胞内polyP合成与利用。通过polyP净产生率结果发现, 米氏凯伦藻可能通过利用胞内polyP度过适应阶段, 随后吸收DIP合成polyP以补充消耗及储存, 即磷的过量吸收(luxury uptake, Elizabeth et al, 2010)。磷饱和状态下, 米氏凯伦藻先达到稳态, polyP净产生率0.33×10^–7 neq/(cell·d), polyP合成与利用达到平衡。磷胁迫状态下, 米氏凯伦藻前期维持相对较高polyP净产生率[4.72×10^–7 neq/(cell·d)], 以充分利用外界的磷酸盐, 直至环境中磷耗尽, 合成过程终止。此时polyP : PP比值上升, 这与Martin等(2014)的研究结果一致。若浮游植物受到磷胁迫时主要动用polyP储库来维持生长, polyP : PP应下降, 相较于传统观点认为胞内polyP是浮游植物在磷胁迫下利用的最重要的胞内磷库, 可见polyP不是米氏凯伦藻优先利用且唯一的磷储库。这可能与细胞大小有关, polyP相比Pi所需的空间要小(聚集形成颗粒), 小细胞的浮游植物更加需要累积polyP做为磷储库(Raven et al, 2010)。因此polyP对大细胞的米氏凯伦藻可能不是首选, 只有达到极度磷限制时才被利用[polyP的净产生率为−1.98×10^–7 neq/(cell·d)]。在实验后期的磷补充恢复阶段, 极度磷限制的米氏凯伦藻吸收大量DIP, 此时polyP净产生率为−0.76×10^–7 neq/(cell·d), 未出现过剩反应(overplus response, 即磷胁迫下因另补充Pi出现polyP累积现象(Elizabeth et al, 2010)), 表明吸收入细胞内的磷并未用于合成polyP, 而是优先补充其他磷储库。如甘油磷脂是细胞膜的基本组成部分, 占细胞总磷10%~20%, 在营养限制条件下是一个可被利用潜在的磷库(Liang et al, 2019)。假威海链藻(Thalassiosira pseudonana)添加磷恢复后能够快速将非磷脂转换回磷脂(Martin et al, 2011)。米氏凯伦藻也可能存在这种能力, 随后将富余的磷酸盐逐渐合成polyP。

4 结论

米氏凯伦藻有较强的耐磷特性能, 利用胞内磷储库应对低磷环境, 维持生长速率并保持生理活性。PP能够支持米氏凯伦藻至少7 d, 比生长速率0.15 d^–1的生长, 可以满足细胞分裂将近2次, 同时光合速率不受影响。一旦磷恢复, 米氏凯伦藻会迅速吸收DIP补充自身PP消耗。磷胁迫状态下米氏凯伦藻polyP : PP比值上升, 可见polyP不是米氏凯伦藻优先利用且唯一的磷储库, 相较于传统观点认为胞内polyP是浮游植物在磷胁迫下利用的最重要的胞内磷库, 米氏凯伦藻对胞内磷资源的分配利用上可能存在其他更为经济、高效的通路, 值得进一步研究。