仿刺参(Apostichopus japonicus), 又名刺参, 隶属于棘皮动物门、海参纲、辛那参目、刺参科、仿刺参属, 因其含有较高的营养和食用价值, 深受广大消费者的喜爱(Xu et al, 2018; Liu et al, 2022)。仿刺参是我国重要的经济海水品种, 自2003年开展“北参南养”试验以来, 海参(仿刺参)养殖在南方取得蓬勃发展, 福建省已成为我国南方重要的海参养殖产区, 但北参南养过程中的海参疾病也时常困扰其养殖业的发展。研究表明, 灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、假交替单胞菌(Pseudomonas sp.)、塔式弧菌(V. tubiashii)、哈维氏弧菌(V. harveyi)和伯麦罗氏弧菌(V. pomeroyi)等细菌是南移仿刺参养殖过程中的常见病原菌(葛辉等, 2012; 方旅平等, 2014; 杨求华等, 2014)。在传统的细菌性疾病防治中, 常采用化学类药物和抗生素类药物治疗, 但药物的频繁使用所带来的负面影响已引起众多学者的关注, 如抗生素的过度使用不仅破坏水体环境、造成宿主肠道菌群紊乱, 而且容易产生耐药菌(方旅平等, 2014)。随着食品质量安全越来越受关注, 研发人员纷纷致力于抗生素替代物的开发, 其中益生菌制剂因其副作用少、无残留等特点而成为研究热点(Subedi et al, 2020; Wang et al, 2021)。研究发现, 从健康宿主体内分离的宿主源益生菌, 能够调节宿主肠道内菌群平衡, 促进宿主生长, 提高宿主免疫力, 从而达到预防相关疾病的效果, 在水产养殖中备受重视(刘敏等, 2003)。

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB), 是一类能够利用碳水化合物发酵, 且代谢产物主要为乳酸的一类革兰氏阳性菌统称(Yang et al, 2019), 其广泛存在于健康的鱼类和虾蟹类肠道中(Mohapatra et al, 2012; Nordin et al, 2013)。乳酸菌不仅可以调节动物肠道菌群平衡、改善肠道功能, 促进动物健康生长, 同时能降低动物肠道pH, 提升消化酶活性, 从而提高饲料利用率(王芳芳等, 2016)。此外, 乳酸菌代谢过程中产生的各种活性物质, 可以增强宿主免疫, 提高抗病能力(Yang et al, 2019)。目前, 水产养殖中常见的乳酸菌包括有: 肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(L. plantarum)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)等(Huang et al, 2013; 刘君等, 2015; Alonso et al, 2019; 徐国辉等, 2020; 李祎等, 2021)。

本研究利用选择性培养基从健康的养殖仿刺参肠道中分离乳酸菌, 采用病原拮抗法获得对仿刺参病原菌具有拮抗作用的候选益生菌株, 综合形态特征、生理生化和16S rRNA序列分析特征进行鉴定, 并探索其培养条件, 以及对模拟人工胃液和肠液的耐受性、药物敏感性、抑菌特性、菌株表面疏水性与自聚率和体外抗氧化能力等益生特性, 以期为仿刺参源肠道益生菌的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验用仿刺参取自福建霞浦海上吊笼养殖基地, 选择体色正常、体质健壮、体表无损伤, 平均体质量(171.6±16.6) g的个体用于肠道菌株的培养分离。

1.2 乳酸菌的分离纯化

无菌条件下取出仿刺参肠道, 去除肠道内容物, 将肠壁置于无菌试管中, 加入无菌生理盐水, 充分研磨, 用无菌生理盐水对样品按10^–1~10^–5梯度稀释, 每个梯度取100 μL研磨液在选择性培养基(MRS)上涂布, 置于生化培养箱30 ℃培养48 h, 观察菌落形态, 挑取典型优势菌落纯化培养2~3次, 将纯化后的菌落接种于LB培养基上, 挑选单菌落用30%甘油生理盐水保存于–80 ℃冰箱, 备用。

1.3 分离菌株对病原菌的拮抗性分析

为了评价筛选菌株对病原菌是否具有拮抗作用, 以仿刺参病原菌灿烂弧菌(Vibrio splendidus)、副溶血弧菌、塔氏弧菌、哈维氏弧菌、伯麦罗氏弧菌(V. pomeroyi), 以及水产病原菌迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda, Et)、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌(V. alginolyticus)、创伤弧菌(V. vulnificus)等为指示菌, 采用牛津杯法筛选分离菌株对病原菌的拮抗性(杜佗等, 2017)。指示菌采用LB肉汤在30 ℃条件下培养16 h后, 取100 μL均匀涂布于LB固体平板上, 随后插入牛津杯, 待30 ℃培养2 h后, 往牛津杯孔中加入100 μL用MRS液体培养基在30 ℃条件下培养16 h的候选菌株菌液, 以无菌MRS培养基作为对照, 30 ℃培养24 h后观察抑菌圈, 并测量抑菌圈的直径。

1.4 菌株鉴定 1.4.1 菌株和菌落形态观察

将1.3中保存的候选菌株分别接种于MRS和LB平板上, 30 ℃恒温培养24 h后, 观察菌落形态, 采用扫描电子显微镜观察菌株个体形态。

1.4.2 菌株生理生化特性分析

参考《伯杰氏鉴定细菌学手册》(Buchanan et al, 1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等, 2001)等文献, 并结合梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统分析候选菌株的生理生化特性。

1.4.3 16S rRNA序列分析

以候选菌株DNA为模板, 参考文献(Lane, 1991)设计16S rRNA通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′), 1492R (5′-ACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 送至厦门铂瑞生物科技有限公司测序, 采用BLAST在NCBI数据库中在线比对, 下载相似序列采用MEGA 5.0软件Neighbour-Joining方法构建系统进化树(bootstrap=1000)。

1.5 候选菌株培养条件优化 1.5.1 菌株生长曲线绘制

取活化后的菌株按5%的接种量接种至50 mL的LB肉汤中, 30 ℃ 180 r/min摇床培养, 每隔8 h取样测定OD₆₀₀值, 每次3个生物学重复, 绘制生长曲线图。

1.5.2 不同温度对菌株生长的影响

用生理盐水将菌液稀释成浓度为1×10⁸ CFU/mL, 分别以2%的接种量接种于LB液体培养基后分别置于18 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃, 恒温培养24 h, 随后测定菌液OD₆₀₀值。

1.5.3 不同pH对菌株生长的影响

用无菌HCl和NaOH调节LB液体培养基pH至pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0, 接种培养24 h, 测定各组菌液的OD₆₀₀值。

1.5.4 对人工胃、肠液的耐受性

参照文献(丁诗瑶等, 2021)配置人工胃液和人工肠液, 将浓度为1×10⁸ CFU/mL的菌悬液按照10%的接种量接种于模拟胃液培养基中, 设置0.9%生理盐水为对照组, 30 ℃摇床培养(180 r/min), 在培养0 h、1 h、2 h、3 h后以无菌生理盐水按1︰9梯度稀释, 进行平板菌落计数, 每个稀释度3个重复。以0 h的活菌数作对照, 计算每个处理条件下的存活率。

1.6 药物敏感性

参照文献(李忠琴等, 2017)采用纸片扩散法检测候选菌株对10种常用抗菌药物的敏感性。采用微量肉汤稀释法测定候选菌株对8种可用药物的最小抑菌浓度(MIC)值。

1.7 候选菌株益生特性分析 1.7.1 表面疏水性和自聚率

疏水性: 将过夜培养的菌悬液用无菌PBS洗涤两次, 调节OD₆₀₀值为0.5±0.02, 加入2 mL二甲苯或氯仿, 涡旋混匀1 min; 37 ℃静置共培养2 h; 两相分层后取水相, 于600 nm处测定吸光度值并计算菌株疏水率。

自聚率: 将过夜培养的菌悬液用无菌PBS洗涤两次, 调节OD₆₀₀值为0.5±0.02, 取4 mL菌悬液于37 ℃静置放置2 h; 取上层液体于600 nm处测定吸光度值并计算菌株自聚率。

1.7.2 体外抗氧化能力分析

DPPH自由基清除能力检测: 参照文献(黄元霞等, 2020)取益生菌细胞悬浮液2 mL (无细胞提取物2 mL), 加入1 mL 0.2 mmol/L的DPPH·无水乙醇溶液, 摇匀, 避光反应30 min, 9 000 r/min离心10 min, 取上清液于517 nm处测定吸光度值并计算DPPH自由基清除率。

羟基自由基清除能力的检测: 参照文献(黄元霞等, 2020)在2 mL待测菌液中加入1 mL 5 mmol/L硫酸亚铁(FeSO₄)溶液, 1 mL 5 mmol/L水杨酸乙醇液, 1 mL 3 mmol/L过氧化氢溶液, 用超纯水补至10 mL, 37 ℃, 水浴15 min, 9 000 r/min, 离心10 min, 取上清在510 nm处测定吸光度值并计算羟基自由基清除率。

超氧阴离子清除能力的检测: 参照文献(黄元霞等, 2020)取待测菌液1 mL, 加入pH 8.0的Tris-HCl缓冲液4.5 mL, 邻苯三酚0.4 mL, 混匀后在25 ℃水浴中静置10 min, 并用1滴盐酸终止反应, 之后在325 nm处测定吸光度值, 并计算超氧阴离子清除率。

1.8 数据统计与分析

实验数据用SPSS软件进行差异显著性分析, 用Microsoft Excel软件和Origin 8.0软件作图并进行分析。

2 结果 2.1 菌株AJC-XP-15的分离与鉴定 2.1.1 菌落及菌株形态

采用MRS选择性培养基从南移养殖的仿刺参肠道壁中分离得到1株优势菌株, 命名为AJC-XP-15。经30 ℃恒温培养24 h后, 菌株AJC-XP-15在MRS培养基上形成表面光滑、边缘整齐的微黄色圆形菌落, 单菌落直径1~2 mm; 在LB培养基上形成中央隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐的白色圆形不透明菌落, 菌落直径1~2 mm (图 1a)。扫描电镜观察显示, 该菌株呈多个排布, 近圆球状, 菌体大小约为(1.7~1.9)×(1.4~1.8) μm (图 1b)。

2.1.2 生理生化特征

菌株AJC-XP-15在D-苦杏仁甙、亮氨酸芳胺酶、丙氨酸芳胺酶、D-核糖、新生霉素耐药、奥普托欣耐药、6.5% NaCl中生长、D-海藻糖、多粘菌素B耐药、杆菌肽耐药试验等指标中呈现为阳性, 在D-棉子糖、L-乳酸盐碱化、磷脂酰肌醇磷脂酶C、β-半乳糖苷酶、乳糖、D-甘露醇、尿素酶、磷酸酶、支链淀粉试验等指标中呈现为阴性(表 1)。采用梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定系统分析, 鉴定菌株AJC-XP-15为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis), 鉴定可能性为86%。

2.1.3 16S rRNA序列分析

经PCR扩增获得片段长度为1 452 bp的菌株AJC-XP-15 16S rRNA序列, 通过GenBank数据库比对分析, 菌株AJC-XP-15与乳酸乳球菌Lactococcus lactis NBRC 100933 (序列登录号NR 113960.1)的相似度最高, 为98.8%。从GenBank数据库中下载其他菌株16S rRNA相关序列, 利用MEGA 5.0软件采用N-J法构建系统发育进化树, 菌株AJC-XP-15与同为乳球菌属的乳酸乳球菌聚为一支(图 2)。

2.2 菌株AJC-XP-15对病原菌的抑菌效果分析

菌株AJC-XP-15对仿刺参病原菌哈维氏弧菌和塔氏弧菌具有较好的拮抗作用, 其抑菌圈直径大小分别为(19.67±0.57) mm和(17.67±1.15) mm (图 3)。菌株AJC-XP-15对常见病原菌无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌和河流弧菌(V. fluvialis)等均有拮抗抑制作用, 其中对副溶血弧菌的抑制作用最明显; 菌株AJC-XP-15发酵上清液对大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等病原菌具有抑制性, 其中对副溶血弧菌的抑制作用最明显(表 2)。

2.3 菌株AJC-XP-15的生长特性分析 2.3.1 生长曲线

菌株AJC-XP-15的生长曲线如图 3所示, 在0~8 h菌体缓慢生长, 为迟缓期; 8 h后可以看到菌液OD值迅速上升, 进入对数生长期; 接种后0~24 h时迅速生长, 菌体浓度迅速升高, 24~32 h增长逐渐变缓, 进入稳定期, 32 h后OD值逐渐减小, 进入衰退期(图 4)。

2.3.2 不同温度对菌株AJC-XP-15生长的影响

在不同温度(18 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃)条件下, 随着温度的上升, 菌株AJC-XP-15的菌体生物量呈先上升后下降的趋势, 其中在温度为30 ℃时, 菌株生长量最大, 此时菌株OD₆₀₀值为14.14 (图 5)。

2.3.3 不同pH对菌株AJC-XP-15生长的影响

在不同pH (5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)条件下, 随着pH的上升, 菌株AJC-XP-15的菌体生物量也呈先上升后下降趋势, 在pH 7时, 菌株生长量最大, 此时菌株OD₆₀₀值为14.66 (图 6)。因此, 菌株AJC-XP-15在温度为30 ℃、pH 6.5条件下的生长情况较好。

2.3.4 对模拟人工胃液和人工肠液的耐受性

模拟人工胃液、肠液的耐受性分析结果如表 3所示。在pH 3.0的模拟人工胃液环境下, 菌株AJC-XP-15的存活率随着处理时间的增加, 其存活率逐渐降低, 在处理3 h后, 存活率为71.43%, 显示出较强的耐受能力; 而在pH 6.8的模拟人工肠液环境下, 菌株AJC-XP-15在处理3 h后的存活率仍为92.1%, 耐受性强。

2.4 菌株AJC-XP-15的药物敏感性

菌株AJC-XP-15对四环素、诺氟沙星、呋喃唑酮、链霉素、氯霉素等5种药物敏感, 对红霉素、复方新诺明、庆大霉素、青霉素G、氨苄青霉素等5种药物表现耐受; 最小抑菌浓度(MIC值)测定结果显示, 恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺间甲嘧啶钠、磺胺甲恶唑+甲氧苄啶等8种药物对菌株AJC-XP-15的MIC值分别为0.5、0.125、4、8、0.06、64、64、304/16 μg/mL。

2.5 菌株AJC-XP-15的益生特性分析 2.5.1 表面疏水率与自聚率

菌株AJC-XP-15的表面疏水率为34.56%, 菌株自聚率为35.61%, 均高于其他测定菌株(表 5)。

2.5.2 对DPPH自由基的清除能力

如图 7所示, 菌株AJC-XP-15三种处理方式后, 其无细胞提取物对DPPH的清除率最强、菌悬液次之, 而发酵上清液最低, 三者对DPPH的清除率分别为(82.67±6.92)%、(48.33±5.28)%、(18.33±4.32)%。

2.5.3 对羟基自由基的清除能力

如图 8所示, 菌株AJC-XP-15无细胞提取物对羟自由基的清除能力最强, 为(15.36±2.95)%, 其次为菌悬液的(12.82± 1.56)%, 最弱的是发酵上清液, 为(8.18±2.02)%。

2.5.4 对超氧阴离子的清除能力

如图 9所示, 菌株AJC-XP-15的菌悬液(8.73±1.32)%、无细胞提取物(12.64±2.56)%、发酵上清液(26.36±2.58)%对超氧阴离子的清除能力依次增强, 其中发酵上清液表现出最强的超氧阴离子清除能力。

3 讨论

乳酸菌是公认的益生菌, 不仅具有改善消化道微环境、提高宿主免疫力作用, 还能抑制病原微生物的生长。研究发现, 益生菌乳酸片球菌M7能够通过产生乳酸对铜绿假单胞菌产生抑制作用(Kiymaci et al, 2018)。乳酸乳球菌是乳酸菌中一个典型模式菌株, 在人和动物的肠道中发挥着重要的生理功能, 是公认的安全级微生物(generally recognized as safe, GRAS) (Liu et al, 2005; 刘淑杰等, 2021), 被广泛应用于水产养殖、畜牧养殖, 及食用制品的生产。乳酸菌通过分泌乳酸和乙酸等有机酸, 产生细菌素或者产生过氧化氢(H₂O₂)等物质来抑制病原菌的生长(Vázquez et al, 2005; Campos et al, 2006; Sugita et al, 2007)。刘君等(2015)采用病原拮抗筛选法, 以嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌等水产常见病原菌为指示菌, 筛选得到包括乳酸乳球菌、戊糖片球菌和格氏乳球菌等11种不同的乳酸菌菌株。本研究发现, 采用MRS选择性培养基从健康仿刺参肠道分离获得的乳酸乳球菌AJC-XP-15对无乳链球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、河流弧菌等几种条件病原菌均有一定的抑制作用, 菌株AJC-XP-15发酵上清液对大肠杆菌、嗜水气单胞菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等病原菌具有抑制作用, 表明该菌株对能够针对性抑制导致仿刺参病害的主要病原菌, 具有作为仿刺参病害生态防控制剂的潜质。综合菌落形态、生理生化和16S rRNA序列分析特征鉴定菌株AJC-XP-15为乳酸乳球菌。

由于环境中的pH、温度和盐度对细菌生长具有显著影响, 乳酸菌在消化道中的生长也与菌株对温度、pH和盐度等环境因素的耐受能力有关。分离到的菌株AJC-XP-15的最适培养温度为30 ℃, 在15 ℃生长速率虽有所下降, 但仍可正常生长; 仿刺参为变温动物, 成年仿刺参生长的适宜水温在18~20 ℃, 分离菌株AJC-XP-15在20 ℃下仍能保持较好的生长, 因此适合在海参养殖中应用。研究表明, 仿刺参的适宜pH范围为7.8~8.7之间, 当pH值低于6.0或高于9.0时, 仿刺参收缩呈球状濒于死亡(郭成秀等, 2010; 李明等, 2016), 本研究表明, 菌株AJC-XP-15在pH为5.5~7.5的范围内, 均能保持较好的生长, 其中最适宜生长pH值为7.0, 因此可以在仿刺参健康养殖中应用。益生菌是否耐酸也是筛选标准之一, 筛选出的益生菌将用于动物体, 就要面临各种体内环境, 能否在肠道中存活也是筛选标准。菌株AJC-XP-15在pH 3.0的模拟人工胃液中存活率随处理时间增加而降低, 处理3 h后, 其存活率为71.43%; 而在pH 6.8的模拟人工肠液经过3 h, 菌株存活率仍达到92.10%, 表现出了较好的耐受性能。

研究表明, 细菌的表面疏水性会影响其与肠道粘膜表面受体结合, 疏水性高的菌株通常与黏膜细胞有较强的黏附性(Kwak et al, 2016; 于小番等, 2017)。乳酸菌的疏水性存在显著差异, 占萌等(2018)在15株受试乳酸菌中, 耐久肠球菌KLDS6.0933的表面疏水性最高, 为30.00%, 而嗜酸乳杆菌KLDS1.0902的疏水性仅为1.07%。在本研究中, 乳酸乳球菌AJC-XP-15的疏水性为34.56%, 略高于耐久肠球菌KLDS6.0933 (占萌等, 2018), 但低于保加利亚乳杆菌的43.57% (黄晓棠, 2020)。此外, 在本研究中乳酸乳球菌AJC-XP-15的自聚率为35.61%, 低于文献报道中植物乳杆菌72.04%的自凝率。

近年来, 随着耐药菌的出现, 对耐药菌的研究和解决方法受到越来越多的关注。长期以来细菌耐药性和耐药基因的研究多集中在病原菌上, 对益生菌的耐药性研究相对较少。本研究对菌株AJC-XP-15的药敏结果显示, 菌株AJC-XP-15对红霉素、复方新诺明、庆大霉素、青霉素G和氨苄青霉素等5种药物表现为耐药。草鱼源乳酸乳球菌CR1和CR2的药敏结果发现, CR1对四环素、氯霉素、青霉素、阿莫西林、哌拉西林、头孢他啶和头孢哌酮敏感, 对恩诺沙星中度敏感, 对丁胺卡那耐药; CR2对四环素、氯霉素、青霉素、哌拉西林和头孢哌酮敏感, 对阿莫西林中度敏感, 对恩诺沙星、头孢他啶和丁胺卡那耐药(肖俊等, 2022), 这可能与不同的养殖生长环境以及不同的抗生素使用等因素有关, 本研究结果反映了养殖仿刺参肠道中乳酸菌的药物耐受性情况, 也为乳酸菌应用于水产养殖提供理论参考。

DPPH是一种以氮为中心的稳定自由基, 能够吸引电子或氢自由基的单电子, 形成稳定的抗磁分子; 羟基自由基对机体有很强的损伤作用, 大量存在的情况下可对机体DNA、蛋白质和脂质发生损伤, 引发一系列疾病; 正常情况下的一定量的超氧阴离子不会对宿主造成损伤, 但一旦机体处于氧化应激状态时, 超氧阴离子会与羟基发生结合, 引发宿主出现DNA损伤, 并导致疾病的发生(Sridhar et al, 2019)。菌株清除羟基自由基的活性物质主要是菌体细胞及胞内物质, 而清除DPPH和超氧阴离子自由基主要是乳酸菌的代谢产物(张开屏等, 2021)。本研究中, 菌株AJC-XP-15对DPPH自由基清除能力最强, 其次是羟基自由基、超氧阴离子自由基; 菌株AJC-XP-15三种处理方式后的抗氧化活性, 无细胞提取物对DPPH自由基清除率(82.67±6.92)%最高, 菌悬液(48.33±5.28)%, 发酵上清液(18.33±4.32)%; 羟基自由基中, 无细胞提取物(15.36±2.95)%, 菌悬液(12.82±1.56)%, 发酵上清液(8.18±2.02)%; 而发酵上清液对超氧阴离子的清除能力最强, 最弱是菌悬液。益生菌的抗氧化能力差别较大, 既具有种属特异性, 又有菌株特异性; 在40株不同受试益生菌中, 乳酸乳球菌清除自由基能力最强, 其次是嗜热链球菌, 乳杆菌和双歧杆菌最弱(白明等, 2009)。

4 结论

乳酸乳球菌AJC-XP-15是一株分离自仿刺参肠道的乳酸菌株, 具有较好的病原拮抗性、人工胃肠耐受性和抗氧化活性。其最适生长温度为30 ℃, 最适生长pH为6.5; 表面疏水性和自聚率分别为34.56%和35.61%; 在模拟人工胃液和模拟人工肠液处理3 h后的成活率分别为71.43%和92.1%; 是一种较好的候选益生菌种, 可用于益生菌制剂的研制应用于海参养殖。