内脏白点病, 也称内脏结节病, 主要症状为肝、脾及肾脏出现大量白色肉芽肿, 近年来已经成为鱼类常见疾病之一(Chen et al, 2000), 在大口黑鲈(Micropterus salmoides) (吕丽丽等, 2021)、大黄鱼(Larimichthys crocea) (Wang et al, 2005)、乌鳢(Channa argus) (王二龙等, 2015)等鱼类养殖过程中均有报道。该病潜伏期长、发病慢, 前期症状主要在内脏, 不易被察觉, 且无特效治疗药物, 往往因治疗不及时导致病鱼大规模死亡, 对水产养殖业造成了严重的经济损失。

引起内脏白点病的致病菌主要有假单胞菌(Pseudomonas sp.) (陈卓等, 2018)、爱德华氏菌(Edwardsiella sp.) (刘春等, 2013)和诺卡氏菌(Nacardia sp.) (Chen et al, 2018)等。其中, 诺卡氏菌属于放线菌目(Actinomycetales)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardia), 兼性胞内寄生的革兰氏阳性菌, 为人畜共患菌, 会引起组织化脓、坏死(Wang et al, 2014)。在水产养殖中, 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是造成鱼类感染的诺卡氏菌病的主要病原(多甜等, 2017), 在乌鳢(王二龙等, 2015)、大口黑鲈(吕丽丽等, 2021)等养殖品种较为常见, 主要通过表皮伤口或者鳃进入鱼体, 在肝、脾、肾等器官引起免疫应答产生白色结节(王文基等, 2019)。

小黄鱼属鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Larimichthys), 是一种养殖潜力巨大的经济鱼类。2021年9月, 在舟山市登步岛附近网箱养殖基地小黄鱼陆续发病, 主要表现为离群、反应迟钝、活力下降, 病鱼体表出现溃疡、部分眼睛溃烂失明、内脏器官肝脏、脾脏肿大且有肉眼可见白色结节, 其中脾脏内白色结节较为集中, 死亡率高达50%以上, 根据症状可以出初步断定是由细菌引起的内脏白点病。因此, 本研究对患病小黄鱼病原菌进行分离鉴定, 通过形态学、分子特征鉴定、生理生化特性、药敏性及回归感染试验对分离菌的生物学特性进行分析, 旨在查明引起小黄鱼内脏白点病的病因, 为小黄鱼养殖过程中应对内脏白点病的早期预防和治疗提供数据依据。

1 材料与方法 1.1 实验用鱼

小黄鱼病鱼样本采集于舟山市普陀区登步岛附近海水网箱内, 平均体长(13.44±1.25) cm, 体重(36.77± 11.28) g, 主要用于病原菌的分离纯化实验。患病小黄鱼的主要症状表现为眼球红肿、糜烂, 体表溃疡, 鳃、肾脏、肝脏和脾脏等部位出现大量白色结节。

健康小黄鱼样本采集于浙江省海洋水产研究所试验场内, 挑选皮肤完整、活力好的个体(n=105)用于后续感染实验, 平均体长(12.50±1.56) cm, 体重(35.08± 10.30) g。实验前随机挑选10尾健康小黄鱼进行细菌、病毒和寄生虫检测, 确保无病原微生物携带。

1.2 病原菌分离纯化

挑选患病严重的小黄鱼, 于无菌环境解剖, 用接种环在眼球、鳃、肾脏、肝脏和脾脏病灶白色结节取样, 在血琼脂培养基(广东环凯生物科技有限公司)上划线后培养于隔水式电热恒温培养箱内, 28 ℃恒温培养5 d后从优势菌群中挑取单菌落进一步纯化培养3代, 将分离纯化的菌株编号为ZHNK2101。

1.3 分离菌形态学观察

将分离纯化后的细菌接种于血琼脂培养基, 28 ℃恒温培养5 d后挑取单菌落观察菌落形态, 同时对纯化细菌进行革兰氏染色和观察。

1.4 分离菌的分子特征鉴定

使用细菌基因组提取试剂盒(TaKaRa公司)提取纯化细菌的全基因组DNA作为扩增模板, 利用PCR SuperMix (北京全式金公司) DNA聚合酶和细菌16S rRNA通用引物(上游引物5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′、下游引物5′-TACGACTTAACCCCAAT CGC-3′), 完成目标片段PCR扩增, 引物由上海生工公司合成。PCR循环参数: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 10 s, 54 ℃ 5 s, 72 ℃ 10 s, 30个循环; 72 ℃, 5 min。预计目标片段约1 400 bp, 经过琼脂糖凝胶电泳检测后回收PCR产物, 送至上海华大基因有限公司进行测序。测序结果经DNAMAN分析后与GenBank上已公布的基因序列进行比较, 采用MEGA 11及EVOLVIEW软件进行系统发育树的构建。

1.5 分离菌的理化特征鉴定及药物敏感性试验

根据《常用细菌系统鉴定手册》(东秀珠等, 2001)方法, 以鰤鱼诺卡氏菌菌株JCM3360为参考, 将分离菌ZHNK2101接种于细菌微量生化鉴定管(杭州微生物试剂有限公司)中, 主要对碳源利用、酶活性及水解活性等理化指标进行检测分析。

药物敏感性测定采用纸片琼脂扩散法, 将培养的细菌用PBS调整至1.0×10⁸ CFU/mL, 取100 μL均匀地涂布于血琼脂培养基, 10 min后贴上不同的药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司), 28 ℃恒温培养3 d后测量抑菌圈直径。

1.6 回归感染实验

将健康的小黄鱼暂养于700 L养殖桶内, 水温(25±1) ℃, 连续充气, 日换水量100%, 每日投饵2次, 驯化一周, 实验前随机挑选总数10%的小黄鱼进行病原检测, 无病原检出方可用于回归感染实验。将分离的菌株接种于BHI培养基, 28 ℃恒温、200 r/min培养7 d后离心收集细菌。健康小黄鱼随机分为4组(3个感染组, 1个对照组), 每组20尾, 利用PBS缓冲液将菌液浓度调整为1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸ CFU/mL三个浓度, 感染组每尾腹腔注射300 μL菌液, 对照注射相同体积PBS缓冲液。实验期间水温控制在(25±1) ℃, 正常投喂、换水, 连续观察21 d, 每天记录小黄鱼发病状况, 用MS-222 (Sigma-Aldrich公司)麻醉濒死的小黄鱼后进行剖检及病原菌分离, 收集濒死的小黄鱼肝脏、脾脏、肾脏等器官用Bouin’s液固定, 经石蜡包埋切片、H.E染色及中性树脂封片后于显微镜下观察各组织病理变化情况。

2 结果与分析 2.1 患病小黄鱼剖检观察

患病小黄鱼体表鳞片脱落, 出现多处溃疡并伴随着出血, 眼球红肿、糜烂(图 1a, 1b)。剖检发现腹中有大量黄绿色腹水, 肝脏开始肿大, 鳃、脾脏、肝脏、脾脏等器官表面出现不同数量的白色结节(图 1c, 1d, 1e), 其中脾脏表面白色结节分布最为密集(图 1f)。

2.2 病原菌分离与形态学观察

取脾脏、肝脏等结节病灶组织接种于血琼脂培养基, 经分离和纯化后得到一优势菌株ZHNK2101。分离得到的病原菌生长缓慢, 在血琼脂培养基培养3 d后出现少数菌落, 菌落呈白色或淡黄色, 形状为不规则的雪花状、不透明、干燥、粗糙, 表面有菌膜覆盖(图 2a)。在100倍镜下观察菌体呈杆丝状, 革兰氏染色后该菌呈蓝色, 故初步判断为革兰氏阳性菌(图 2b)。

2.3 分离菌株的理化特征

生理生化试验结果显示, 分离菌株ZHNK2101能以D-葡萄糖和柠檬酸盐作为唯一碳源生长, 无法利用阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇。酶活性方面, 分离菌过氧化氢酶呈阳性, 氧化酶、脲酶和溶菌酶呈阴性, 无法还原硝酸盐。此外, 该菌能够水解七叶苷, 不能水解明胶、淀粉、酪素、黄嘌呤和酪氨酸, 无法在35 ℃及以上环境生长。分离菌理化性质同参考菌株鰤鱼诺卡氏菌JCM3360基本相同, 符合诺卡氏菌属的基本特征(表 1)。

2.4 分离菌株的分子特征鉴定

分离菌株ZHNK2101的16S rRNA基因扩增结果如图 3所示, 在1 500 bp处出现单一明显条带, 测序结果显示该DNA片段长度为1 365 bp (GenBank登录号为OP741014)。此外, 从GenBank数据库中选取11条诺卡氏菌属的参考菌株16S rRNA基因序列, 利用MEGA11和ClastalX软件构建系统进化树(图 4), 结果显示分离菌株ZHNK2101和Nacardia seriolae (MT052585和AF380938)聚为一支, 序列相似度为100%。结合菌落形态、理化特性和分子特征结果, 可以确定分离菌株ZHNK2101为鰤鱼诺卡氏菌。

2.5 分离菌株ZHNK2101药敏实验结果

对分离菌株ZHNK2101进行29种抗生素药敏实验, 结果显示, 该菌株对哌拉西林、头孢曲松、丁胺卡那、庆大霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、盐酸多西环素、四环素、米诺环素、红霉素、麦迪霉素、氧氟沙星、诺氟沙星、盐酸环丙沙星、复方新诺明和氯霉素16种抗生素敏感, 对青霉素、苯唑西林、氨苄西林、羧苄西林、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢呋辛、头孢他啶、头孢哌酮、万古霉素、呋喃唑酮和克林霉素表现耐受(表 2)。

2.6 回归感染实验

以腹腔注射的方式将分离菌株ZHNK2101注射至小黄鱼体内, 结果显示对照组小黄鱼未出现任何症状, 死亡率为0; 在各实验组中小黄鱼均出现了发病和死亡情况且死亡率均为100%, 但是不同浓度组发病死亡情况有所不同。其中, 1.0×10⁸ CFU/mL组小黄鱼感染3 d开始出现了死亡个体, 9 d全部死亡; 1.0×10⁷ CFU/mL组小黄鱼感染4 d开始出现死亡个体, 16 d全部死亡; 1.0×10⁶ CFU/mL组小黄鱼发病持续时间较长, 感染7 d开始出现死亡个体, 19 d全部死亡(图 5)。对各个实验组死亡小黄鱼数量进行统计分析, 利用寇氏法计算得到该菌株对小黄鱼7d的LD₅₀为7.28×10⁴ CFU/尾, 即LD₅₀为2.19×10² CFU/g。回归感染实验中发病小黄鱼感染前期(第1 d至第7 d)体表无明显症状, 但是脾脏、肾脏和肝脏陆续出现细小的白色结节, 其中脾脏表面白色结节出现时间最早、数量最多。到感染后期(第10 d以后), 发病小黄鱼体表开始出现溃疡, 眼体发生红肿糜烂, 内脏白色结节数量明显增多, 症状与之前自然病例相似。另外, 从感染死亡的小黄鱼病灶处分离出的病原菌, 对其菌落形态及革兰氏染色观察, 与自然发病分离的病原菌一致, 表明所分离病株ZHNK2101为此次患病小黄鱼的致病菌。

2.7 感染小黄鱼组织病理变化

对回归感染实验中濒死的小黄鱼多个组织进行病理切片观察, 结果显示患病小黄鱼的鳃、肝脏、脾脏和肾脏都出现了不同程度的病变, 具体表现为: 发病小黄鱼鳃丝排列整齐(图 6a), 而患病小黄鱼鳃丝排列紊乱, 呈现凋萎不整的弯曲, 鳃丝末端有红细胞增生, 鳃小片上的呼吸上皮细胞开始出现不同程度的脱落(图 6b); 健康小黄鱼肝胰腺组织中细胞排列规则均匀, 细胞边缘清晰(图 6c), 而患病小黄鱼肝脏细胞出现不同程度的形变, 细胞界限变得模糊, 有空泡出现, 胰腺处有纤维细胞包裹住的明显结节且结节中心有典型的病灶, 经H.E染色为红色, 结节周围伴有红细胞浸润(图 6d); 健康小黄鱼脾脏细胞形态均匀, 主要有淋巴细胞和红细胞组成(图 6e), 而患病小黄鱼脾脏组织中出现大量结节, 结节边界清晰且伴有细胞纤维化出现, 结节内部细胞出现不同程度的损伤, 结节中心病灶呈红色, 结节周围细胞坏死严重, 铁黄素大量沉积(图 6f); 健康小黄鱼肾脏中肾小管上皮细胞排列整齐紧密, 管腔通畅(图 6g), 而患病小黄鱼肾脏肾小管上皮细胞明显减少且分布散乱, 甚至出现坏死脱落, 并有与脾脏、肝脏组织相同的结节(图 6h)。

3 讨论

诺卡氏菌是一种革兰氏阳性菌, 需氧腐生, 广泛存在于土壤和水中, 是人和动物的机会致病菌(张媛等, 2012)。在水产动物中, 能够引起疾病的主要是鰤鱼诺卡氏菌、杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmoncide)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroides)和粗形诺卡氏菌(Nocardia crassostreae) (满其蒙等, 2013)。其中, 鰤鱼诺卡氏菌是引起鱼类内脏白点病主要致病菌, 最早分离于五条鰤(Seriola quinqueradiata) (袁思平等, 2006)体内, 可以感染包括大黄鱼(Wang et al, 2005)、花鲈(Lateolabrax japonicus) (Chen et al, 2000)、牙鲆(Lutjanus erythropterus) (Kudo et al, 1988)等多种养殖经济性鱼类。本研究从患内脏白点病的小黄鱼病灶中分离、纯化到菌株ZHNK2101, 根据菌落形态、理化特征及16S rRNA基因片段序列比对, 可鉴定为鰤鱼诺卡氏菌, 并进行了药敏试验和回归感染试验, 确定了该菌株是引起本次小黄鱼发病的病原菌, 这也是首例鰤鱼诺卡氏菌感染小黄鱼引起内脏白点病并出现死亡的报道。

诺卡氏菌生长缓慢, 在BHI培养基上培养7 d才有少数菌落出现, 菌落呈白色或淡黄色, 边缘不规则, 成沙粒状, 随着培养时间的延长会出现较大的褶皱。在液体培养基中, 诺卡氏菌呈现絮状沉淀, 会形成菌膜浮于液面之上(滕建等, 2022)。本研究选取了血琼脂培养基来培养鰤鱼诺卡氏菌ZHNK2101, 发现培养速度明显快于LB (基本不生长)、TSB (10 d)、BHI (7 d)培养基, 3 d出现菌落, 这可能与鰤鱼诺卡氏菌容易在血液中传播的特点有关(Wang et al, 2017)。另外, 该菌株能够以D-葡萄糖和柠檬酸盐作为唯一碳源生长, 无法利用阿拉伯糖、甘露醇和山梨醇, 与其他诺卡氏菌的理化特性相似(罗愿等, 2021), 对后续培养基配方优化过程中碳源选择具有一定的参考意义。该菌株形成的菌落呈不规则、不透明的雪花状, 表面干燥且粗糙, 菌落形态学上与之前报道的鰤诺卡氏菌菌落相似(吕丽丽等, 2021; 滕建等, 2022)。

本研究发现鰤鱼诺卡氏菌菌株ZHNK2101回归感染小黄鱼的发病症状为鱼体表面有溃疡、鳃丝发白、眼睛溃烂失明, 内脏器官表面多见白色结节状肉芽肿, 尤其在脾脏数量最多, 结节质地偏硬, 直径约为1~2 mm, 这与鰤鱼诺卡氏菌感染乌鳢(王二龙等, 2015)、大口黑鲈(吕丽丽等, 2021)等症状相似。鰤鱼诺卡氏菌菌株ZHNK2101引起的白色结节和其他细菌有着较为明显的差异, 变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)感染大黄鱼引起的结节更为细小, 直径约为0.4~1 mm, 主要出现在肾脏和脾脏(Liu et al, 2018); 舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertii)引起的结节质地偏软且结节间边缘模糊(徐春霞, 2021), 杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)感染大口黑鲈引起结节相互连接且形状不规则(Fogelson et al, 2016), 和本研究分离的病株生产边缘清晰的结节有着较大的区别, 可以作为不同类型内脏白点病的区分依据。本研究中菌株ZHNK2101对小黄鱼7 d的LD₅₀为7.28×10⁴ CFU/尾, 明显低于菌株NI对大口黑鲈(吕丽丽等, 2021)、ZJ0503对斑马鱼(Danio rerio) (夏立群等, 2016)的LD₅₀ (分别为2.58×10⁶、3.39×10⁶ CFU/尾)。这种差异可能是不同分离株之间致病性、不同种鱼类抗病能力以及实验条件的不同而导致的。

通过对产生结节的器官进行了病理切片观察发现, 患病小黄鱼内脏病理变化主要出现在鳃、肝脏、肾脏和脾脏, 具体表现为鳃丝排列紊乱、鳃丝末端细胞出现增生和纤维化且开始出现脱落, 肝脏细胞出现变形、细胞界限变得模糊且伴随有空泡出现, 肾小管上皮细胞明显减少且分布散乱, 脾脏中出现细胞纤维化形成大量结节。有研究表明诺卡氏菌可通过呼吸、消化道以及体表创伤感染鱼类(王文基等, 2019), 鳃作为最重要的呼吸器官, 是气体交换的主要场所, 可能存在较高的感染风险。此外, 诺卡氏菌会被白细胞吞噬并在其体内增殖, 通过血液传播并定植于各个器官, 进而导致白细胞聚集、死亡和肉芽肿的形成(Wang et al, 2017), 而肝脏、脾脏和肾脏作为造血和血液循环密切相关的器官, 因此极易成为发病最为集中的部位。针对该特点, 以白细胞作为靶标可为治疗诺卡氏菌引起的内脏白点病的药物和疫苗研究提供了新思路。另外, 结节形成本质是一种免疫反应, 在外源病原体入侵时, 机体通过识别和包裹病原体形成结节, 后续利用巨噬细胞吞噬病原体或者诱导各种免疫蛋白的分泌等途径完成免疫应答(Kim et al, 2021)。

与其他来源的诺卡氏菌相似, 本研究分离的菌株对氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氟喹诺酮类等广谱类抗生素表现敏感, 对大部分青霉素类、头孢菌素类以及万古霉素、呋喃唑酮和克林霉素等抗生素表现一定程度的耐药性。目前, 在鱼类养殖中对于诺卡氏菌的防治主要依靠抗生素, 诸如氟苯尼考、盐酸多西环素等(孟思妤等, 2017; 王友娟等, 2021), 但是治疗效果均不明显, 和耐药性试验结果存在差异。这种耐药性差异的产生和养殖地区和抗生素种类等因素密切相关(雷宁等, 2022), 不同菌株在分裂繁殖及针对药物不断选择的过程中, 已对大部分抗生素产生了耐药性(李忠琴等, 2017)。此外, 耐药性实验中细菌和抗生素发生了有效接触, 抗生素能够直接作用于细菌而抑制其繁殖生长。而在养殖生产中, 鰤鱼诺卡氏菌往往以胞内寄生的形式存在鱼的各个器官组织中(刘文文等, 2022), 而药物通过浸泡、内服等形式进入体内无法直接作用于细菌, 同时白色结节处的细胞发生纤维化, 可能对抗生素等药物也产生了一定的阻挡作用。另外, 由于生产过程中抗生素滥用往往也会导致细菌耐药性增强, 导致常规的单一用药治疗方案收效欠佳。结合鰤鱼诺卡氏菌引起的内脏白点病在鱼体内潜伏期长, 前期症状主要集中肝脏、脾脏以及肾脏等器官的特点, 待到体表出现溃疡、糜烂时已经为感染后期, 使用抗生素无法有效降低小黄鱼的死亡率。因此, 在小黄鱼养殖过程中应该做好前期预防工作, 发现小黄鱼行动迟缓、食欲下降应该立即进行剖检, 在感染前期及时使用药物进行治疗。此外, 在药物的选择上尽量根据鰤鱼诺卡氏菌随着血液传播的特点, 选择能够通过血液转运至各组织器官的药物。

4 结论

本研究从患内脏白点病的小黄鱼体内分离到一病株ZHNK2101, 经形态学观察、生理生化分析和16S rRNA基因片段序列比对鉴定为鰤鱼诺卡氏菌。回归感染试验显示该病株会引起小黄鱼鳃、肝、肾和脾脏发生病理变化, 并确定其对小黄鱼的半致死浓度(LD₅₀)为7.28×10⁴ CFU/尾。药敏试验显示对哌拉西林、头孢曲松等16种抗生素敏感, 为小黄鱼养殖过程中应对内脏白点病的早期预防和治疗提供数据依据。