嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)在自然界中分布广泛, 是一种典型的人鱼共患病的条件致病菌, 感染致病性嗜水气单胞菌可导致人腹泻、食物中毒和继发感染(杨守明等, 2006)。嗜水气单胞菌感染鱼类种类众多, 可以引起罗非鱼(Oreochromis mossambicus)、鲶鱼(Silurus asotus)、鲤鱼(Cyprinus carpio)等鱼类细菌性败血症, 其致死率高、流行广, 严重制约了中国水产养殖业的发展(Jones et al, 1995; Da Silva et al, 2012; Prayitno et al, 2021; Chen et al, 2022)。因此, 研究嗜水气单胞菌对鱼类的致病性特征及其可能的致病机理, 对渔业生产具有重要意义。

气单胞菌的致病性与环境的变化(温度变化、含氧量降低、氨氮升高)有关(白晓倩, 2016; 孟令杰, 2017; 孙元琛等, 2022)。目前有研究表明, 气单胞菌感染的同时往往存在混合感染的情况(聂慧慧, 2016), 肠道微生物存在的共生菌通过竞争营养物质和肠黏膜的附着点即生态位来抑制病原菌的生长增殖(查继伟, 2019)。有研究表明, 芽孢杆菌益生菌添加在饲料中, 能够增加中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌致病菌的抵抗力(陈文典, 2009), 气单胞菌与其他细菌存在相互作用, 而它的致病性可能依赖于肠道菌群的组成(查继伟, 2019)。

肠道是机体一种重要的免疫器官, 其中, 肠道微生物与肠道黏膜间的交流和免疫系统密切相关(徐绍刚等, 2019), 但目前人们对肠道微生物与肠道黏膜屏障的调控机制研究仍在初级阶段。稳定的肠道微生物区系影响着宿主的多种功能, 在宿主的生长发育、营养、食物消化、免疫反应以及抵抗病原菌等方面发挥了重要作用(郭军等, 2019; 盛鹏程等, 2020)。研究嗜水气单胞菌对鱼类肠道黏膜屏障及肠道微生物的影响, 对评价嗜水气单胞菌毒性, 以及从肠道健康的角度, 探索嗜水气单胞菌的致病机制具有重要意义。

斑马鱼因其体型小、生长快、完备的遗传系统和基因组资源, 已成为脊椎动物发育和人类疾病的重要模型(Neely et al, 2002)。本研究使用嗜水气单胞菌暴露成年斑马鱼后, 采用ELISA和16S rRNA高通量测序, 检测斑马鱼肠道生理指标及肠道微生物的变化, 评价嗜水气单胞菌对肠道健康的影响, 探索嗜水气单胞菌可能的毒性机制。

1 材料与方法 1.1 材料

嗜水气单胞菌(J5L09)来源于合肥养殖基地的患细菌性败血症异育银鲫(Carassius auratus gibelio)体内分离并保存于实验室。实验所用的4月龄成年斑马鱼(Danio rerio, AB株), 从中国科学院水生生物研究所的斑马鱼育种中心(武汉, 中国)购买, 在安徽省农业科学院水产研究所进行室内循环水养殖实验。

1.2 养殖及暴露实验

成年斑马鱼的养殖依据Yu等(2010)提出的养殖方案进行。养殖过程中保持水温在(28±0.5) ℃, 光暗周期为14 h : 10 h, 每日喂食丰年虫两次。4月龄成年斑马鱼暂养14 d无死亡后开始暴露实验。麻醉后, 用无菌手术刀沿胸鳍后方侧面刮除几片鳞片, 并刮伤皮下真皮。麻醉恢复后用(10⁵ CFU/mL)嗜水气单胞菌浸泡6 h后转入清水中, 分别在暴露前和暴露后6 h、12 h、24 h时进行取样。

1.3 肠道采集

取样前需禁食24 h, 用0.03%的间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)对斑马鱼进行麻醉, MS-222是一种经过美国食品与药物管理局(FDA)认可的渔用麻醉剂, 且对人体和水产品没有副作用。麻醉后使用无菌的剪刀和镊子解剖, 取得的斑马鱼肠道放在无菌的EP管中。随后立即使用液氮冷冻, 放置在–80 ℃, 用于后续提取DNA。

1.4 肠道生理指标的测定

把5条肠道混作一个样, 加入9倍组织体积的生理盐水。匀浆研磨充分后在3 000 r/min离心15 min, 取上清液。使用紧密连接蛋白ZO-2(TJP2)和乙氧基异戊二烯-O-脱乙基酶(EROD)的鱼特异性酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒, 按照说明书检测肠道中TJP2含量和EROD活性, 试剂盒购买于南京建成。

1.5 肠道微生物群落总DNA提取

把10条肠道混作一个样, 向每管样品加入1 mL裂解液, 在37 ℃下水浴30 min, 加入蛋白酶K (100 µg/mL), 随后55 ℃水浴下裂解12 h, 在室温下恢复温度后, 离心取其上清液, 再进行抽提纯化, 用氯化钠(0.1倍体积)和无水乙醇(2倍体积)沉淀DNA, 3 h后用70%乙醇清洗DNA沉淀, 将DNA干燥后溶解于40 µL TE, 回收得到的DNA进行测序分析。

1.6 16S rRNA高通量测序和分析

提取好的肠道菌群DNA用微量核酸蛋白分析仪测定其浓度和纯度, 以肠道细菌DNA为模板, 采用通用引物341F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)扩增出细菌16S DNA序列。在进行数据处理过滤时(Fadrosh et al, 2014), 使用内部撰写的程序对原始的测序数据进行处理, 基于OUT (Operational Taxonomic Units)聚类的Vsearch方法进行序列拼接, 质量过滤, 去重, 聚类(Rognes et al, 2016)。使用朴素贝叶斯(Naive Bayes)分类器完成注释, 根据注释结果统计各样本在不同分类水平中的分类单元数量(唐亚鹏等, 2022)。

2 结果与分析 2.1 嗜水气单胞菌暴露对斑马鱼肠道生理的影响 2.1.1 肠道中TJP2的含量

对暴露前后肠道中紧密连接蛋白TJP2的含量进行检测, 结果如图 1, 在嗜水气单胞菌暴露斑马鱼12 h和24 h后, 肠道中TJP2的含量显著降低(P < 0.05, P < 0.01)。

2.1.2 肠道中EROD酶活

检测暴露前后肠道中EROD活性, 代表解毒能力的EROD活性随暴露时间的增加而降低, 在嗜水气单胞菌暴露24 h后, 斑马鱼肠道中EROD的活性显著降低(P < 0.01)。

2.2 嗜水气单胞菌暴露对斑马鱼肠道微生物的影响 2.2.1 样本数据统计和测序质量分析

高通量测序后, 如表 1所示, 共获得有效序列条数为475 434条。把序列按照随机抽样的方法, 通过测序数据量以及OTU数量构建稀释曲线, 可见图 3中各样本的曲线趋于平缓, 说明测序的数据量合理, 目前的OTU数量可以代表各组的微生物信息。

2.2.2 基于OTU的VENN图

VENN图显示样本中共有和独有OTU数目, 表明样品OTU数目的组成相似性和重叠情况, OTU的丰度能够初步体现样品的物种丰富程度。如图 4所示, 未暴露前, 斑马鱼肠道细菌获得OTU 368个, 在暴露后6 h、12 h、24 h后, 斑马鱼肠道细菌分别获得OTU 246、253个、226个。

2.2.3 肠道菌群的Alpha多样性

Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析(Schloss et al, 2009), 反映样品中群落的丰富度和物种均匀度。包括ACE指数、Chao指数和Richness指数等。它们的指数越大, 说明样品中的物种越丰富。相比未暴露嗜水气单胞菌的对照组, 在暴露6 h、12 h、24 h后, 暴露组的Alpha多样性显著降低(图 5)。

2.2.4 Rank曲线

Rank曲线能够展现样品的物种多样性, 也能够反映物种的均匀程度和丰富程度。样品曲线越宽表示样品中物种组成越丰富, 样品曲线越平坦表示样品中物种组成的均匀度越高。由此可见, 暴露嗜水气单胞菌后, 斑马鱼样品中物种组成丰富度降低(图 6)。

2.2.5 门和属水平物种丰度

如图 7所示, 在门水平上, 对照组肠道菌群中, 变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)和放线菌门(Actinobacteriota)占主导地位, 但相对丰度不同。其中, 变形菌门所占比例为36.87%, 拟杆菌门所占比例为36.11%, 放线菌门所占比例为26.53%。值得注意的是, 在嗜水气单胞菌暴露斑马鱼12 h和24 h后, 放线菌门所占比例分别降低了28.95%和17.75%。

在属水平上(图 8), 与对照组相比, 暴露6 h、12 h、24 h后, 肠道菌群中Reyranella显著降低(P < 0.05, P < 0.05, P < 0.05), 分枝杆菌属(Mycobacterium)在暴露12 h、24 h后显著降低(P < 0.05, P < 0.05), 肠道菌群中的不动杆菌属(Acinetobacter)在暴露24 h后也明显增加。

2.2.6 主成分分析(PCA)

采用无参数多变量方差分析, 比较样本的群落组成。图 9的结果显示, 在暴露嗜水气单胞菌12 h、24 h之后, 斑马鱼肠道菌群的相似度发生了偏移, 样品在OTU水平上的群落组成存在差异。

3 讨论

肠道是消化和吸收营养的主要器官, 其完整性对鱼类的健康至关重要(Jutfelt et al, 2007)。肠黏膜屏障功能的损伤与多种肠道疾病的发生密切相关(关玮, 2011), 紧密连接(tight junction, TJ)蛋白是肠上皮屏障的关键成分(Chasiotis et al, 2012), TJP2是最重要的TJ蛋白之一, 常被用作肠上皮屏障完整性和通透性的指标(Rhee et al, 2009)。本研究中, 在暴露嗜水气单胞菌12 h、24 h后, 斑马鱼肠道中TJP2的含量显著降低, 这表明, 嗜水气单胞菌暴露损伤了肠上皮屏障的完整性, 提示了嗜水气单胞菌对肠道功能有潜在的干扰作用。有研究表明, 感染嗜水气单胞菌的斑马鱼, 肠道组织切片上可观察到有明显的肠道上皮损伤, 肠道上皮结构被破坏, 表现为上皮细胞脱落, 缘状纹减少(Wang et al, 2016)。嗜水气单胞菌可导致鲤鱼肠道黏膜屏障损伤(Jung-Schroers et al, 2018)。嗜水气单胞菌引起的金钱鱼(Scatophagus argus)细菌性疾病的发病金钱鱼, 与正常的金钱鱼相比, 其肠绒毛结构消失, 肌肉层疏松明显(张庆华等, 2016)。

本研究中, 在暴露嗜水气单胞菌24 h后, 斑马鱼肠道中EROD活性显著降低。EROD活性变化能够反映机体解毒代谢的能力(肖国强等, 2013), 是公认的鱼类生物效应标记物(Kammann et al, 2005), 其活性可以指示暴露损伤(Whyte et al, 2000; Jönsson et al, 2003)。研究表明, 成年斑马鱼中, 暴露于50 mg/L对羟基苯甲酸甲酯(Methylparaben)会导致EROD活性显著降低(De Carvalho Penha et al, 2021)。最高温度导致暴露于除草剂丁硫脲(Butylthiourea)的美国牛蛙蝌蚪肝脏中EROD活性降低(Grott et al, 2021)。将黄盖鲽(Pseudopleuronectes yokohamae)暴露于污染沉积物(低浓度多氯联苯), 其EROD活性在140 d后下降22% (Livingstone et al, 1993)。本研究中, 暴露后肠道EROD活性的降低, 指示了嗜水气单胞菌对斑马鱼肠道的生理损伤。

研究表明鱼类在环境变化后, 一些从门到属的OTUs会在肠道中大量改变(Adamovsky et al, 2018)。在本实验中, 嗜水气单胞菌暴露斑马鱼后, 肠道菌群中OTU数量明显下降。Rank曲线表明, 暴露后组别比暴露前组别分布更窄, 物种组成丰富度降低。PCA分析结果显示, 暴露改变了斑马鱼肠道菌群的结构。通过Chao指数、Richness指数和ACE指数可以看出, 与对照组相比, 嗜水气单胞菌暴露斑马鱼后的Alpha多样性显著降低。很多研究也表明, 环境中的有害物质暴露能够导致肠道菌群的改变以及Alpha多样性的变化(Chen et al, 2018; Qiao et al, 2019)。重复损伤导致斑马鱼肠道屏障功能恢复受损, 肠道菌群失调(Chuang et al, 2019)。用含有二氯苯氧氯酚的食物暴露成年斑马鱼4~7 d, 可导致斑马鱼肠道菌群结构快速变化、Alpha多样性显著降低(Gaulke et al, 2016)。本研究中嗜水气单胞菌暴露后, 斑马鱼肠道菌群失调, 表现为微生物物种组成减少, Alpha多样性快速降低, 这指示了嗜水气单胞菌暴露对斑马鱼的肠道损伤。与本研究结果不同的是, 采用长期浸泡的方法使嗜水气单胞菌感染草鱼, 导致草鱼物种丰富度指数增加, Alpha多样性有所增加(李东亮, 2016)。

在门水平上, 斑马鱼肠道菌群中变形菌门、拟杆菌门和放线菌门占主导地位, 但相对丰度不同。Roeselers等(2011)研究了在不同国家和地区的斑马鱼肠道菌群组成, 发现斑马鱼肠道中的核心菌群为变形菌门、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、放线菌门和拟杆菌门。在嗜水气单胞菌暴露斑马鱼12 h和24 h后, 放线菌门所占比例有所降低。本研究中, 在暴露嗜水气单胞菌24 h后, 肠道菌群中的不动杆菌属(Acinetobacter)大量增加。动杆菌属是一种机会致病菌, 常存在机体呼吸道、消化道, 当机体抵抗力较低时可致病(袁秀梅等, 2001)。人工感染结果表明, 不动杆菌属分离株对泥鳅、斑马鱼和线虫(Caenorhabditis elegans)都具有致病性和高毒性(Wang et al, 2020)。本研究中肠道菌群不动杆菌属的大量增加, 可能是导致肠道健康受损的原因。

肠道健康, 包括黏膜上皮屏障功能完整和微生物平衡(Bischoff, 2011), 肠道黏膜屏障将宿主内部与外部环境分隔开, 并阻挡潜在的有害物质(姚鹏等, 2021), 肠道微生物对维持肠黏膜屏障功能、调节免疫功能和促进营养物质的代谢吸收等具有重要作用(段云峰等, 2022)。研究表明, 牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)通过IL9产生CD4+T细胞, 改变肠道菌群、破坏上皮屏障功能, 间接引发肠道炎症(Sohn et al, 2022)。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌可改善拉氏鱥(Rhynchocypris lagowskii)肠道形态、消化和吸收酶活性, 增强肠道黏膜免疫和屏障功能, 维持肠道微生物平衡(Lei et al, 2022)。黏膜屏障功能障碍可能与肠道菌群失调有关(Xia et al, 2022), 石斛多糖能通过改善肠道屏障功能, 调节小鼠的肠道微生物群(胡乃华, 2022)。我们的研究结果表明, 嗜水气单胞菌暴露引起了斑马鱼肠道生理损伤, 表现为肠道TJP2含量、EROD酶活性在暴露后显著下调。分析斑马鱼体内的肠道菌群种类发现, 暴露后斑马鱼肠道内致病菌不动杆菌大量增加, 增加了肠道受损的可能性。进一步对肠道微生物群落结构分析表明, 嗜水气单胞菌暴露显著降低了斑马鱼肠道中的微生物Alpha多样性。肠道中微生物的多样性与改善肠道上皮和黏膜屏障功能紧密相关, 在本研究中, 肠道中致病菌的增加、Alpha多样性的降低可能与TJP2含量、EROD酶活性降低有关。

4 结论

本研究用嗜水气单胞菌暴露斑马鱼, 在暴露后24 h内, 采用ELISA、16S rRNA高通量测序检测肠道生理健康和肠道微生物变化情况。结果表明, 在嗜水气单胞菌暴露后, 斑马鱼肠道健康受损。表现为斑马鱼肠道TJP2含量、EROD酶活性降低, 肠上皮屏障受损。同时, 肠道致病菌增加, Alpha多样性降低, 菌群失调。本研究结果提示了嗜水气单胞菌对肠道健康的损害与风险, 为肠道微生物与肠道生理健康的相互作用提供研究基础。