2023, Vol. 54
中国海洋湖沼学会主办。
文章信息
- 孙凤芝, 吕珍立, 刘福云, 邢强, 连姗姗, 王师, 包立随. 2023.
- SUN Feng-Zhi, LYU Zhen-Li, LIU Fu-Yun, XING Qiang, LIAN Shan-Shan, WANG Shi, BAO Li-Sui. 2023.
- 双壳贝类CK1基因家族的鉴定及表达分析
- GENOME-WIDE IDENTIFICATION AND EXPRESSION PROFILING OF THE CK1 GENE FAMILY IN BIVALVES
- 海洋与湖沼, 54(5): 1401-1412
- Oceanologia et Limnologia Sinica, 54(5): 1401-1412.
- http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20221200336
文章历史
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收稿日期：2022-12-20
收修改稿日期：2023-02-28
2. 崂山实验室海洋生物学与生物技术功能实验室 山东青岛 266237;
3. 中国海洋大学热带海洋生物种质资源开发与种业工程中心 海南三亚 572000;
4. 中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所 山东青岛 266003
2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Laoshan Laboratory, Qingdao 266237, China;
3. Laboratory of Tropical Marine Germplasm Resources and Breeding Engineering, Ocean University of China, Sanya 572000, China;
4. Institute of Evolution & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
酪蛋白激酶1 (Casein kinase 1, CK1)是生物体内一种丝氨酸/苏氨酸特异性激酶家族, 是最早鉴定的激酶之一, 其在多种动物类群中均有报道。在脊椎动物中, 哺乳类共鉴定出7种CK1家族成员(α、αlike、γ1、γ2、γ3、δ和ε)以及α、δ、ε和γ3的几种剪接变体(Gross et al, 1998; Knippschild et al, 2005; Fulcher et al, 2020)。在斑马鱼(Danio rerio)中存在6个成员(α、γ1、γ2a、γ2b、δ和ε) (Albornoz et al, 2007), 但在无脊椎动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现了52个CK1基因, 其中可能含有很高比例的假基因, 并不行使功能(Manning et al, 2002a, 2002b; Hirst et al, 2020)。所有CK1家族成员在其激酶结构域序列都表现出高度保守性, 经典的CK1蛋白激酶基序由序列Ser/Thr-X-X-(X)-Ser/Thr构成(Flotow et al, 1990; Meggio et al, 1992)。它们的差异存在于N端和C端的非催化结构域, 其中N端分子量较小且主要由β-转角组成, C端分子量较大且主要是由α-螺旋组成。尽管在组织分布和亚细胞定位方面存在差异, 但CK1基因家族各成员在功能上具有一定的相似性, 主要参与DNA损伤应答和修复、细胞增殖和凋亡、胚胎发育和稳态等重要的生物学过程(Cheong et al, 2011)。
CK1激酶家族是面对应激源时介导细胞快速、充分进行应激反应的重要介质(Knippschild et al, 1997; Xu et al, 2019)。有研究表明, 极端温度下CK1可以介导Hsp70和Hsp90的磷酸化参与组织稳态调控(Muller et al, 2013), 同时CK1α还参与细胞程序性凋亡的过程(Zelenak et al, 2012); 在杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)中, CK1可以磷酸化Hsp23以维持其温度应激敏感性(Kröber-Boncardo et al, 2020); 在布氏锥虫(Trypanosoma brucei)中, CK1能够与RNA结合蛋白ZC3H11发生作用以应对温度应激和维持细胞生长(Minia et al, 2016)。哺乳动物在缺氧应激状态下, CK1δ能够将缺氧诱导因子(HIF-1α)磷酸化, 以控制HIF-1的活性从而维持稳态(Kalousi et al, 2010)。另外有研究表明, 细胞处于基因毒性应激状态时, CK1通过对肿瘤抑制因子p53的磷酸化作用介导DNA损伤的修复(Huart et al, 2009), 这对于调控细胞生长和基因组完整性具有重要作用(Winter et al, 2004; MacLaine et al, 2008)。
扇贝、长牡蛎等双壳贝类是我国的重要经济贝类, 适宜的环境温度是维持其正常生命活动的必要条件, 近年来夏季海水温度上升引起高温应激成为导致双壳贝类出现大规模死亡的重要原因(Said et al, 2022)。作为机体高温应激时重要的调节激酶, 开展双壳贝类CK1基因的鉴定和研究, 明确其在高温应激时的表达规律, 有助于深入了解其在机体高温应激的调节机制, 为双壳贝类良种选育与养殖提供理论基础。因此, 本研究对虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、长牡蛎(Crassostrea gigas)和侏儒蛤(Mulinia lateralis)等4种双壳贝类物种的CK1基因家族进行了全基因组鉴定和特征分析。通过结构比对和时空表达分析探究双壳贝类中CK1蛋白结构、表达模式和高温应激反应规律。这是首次对双壳贝类动物中CK1基因家族的系统筛查和特征描述研究, 为深刻理解双壳贝类CK1的基因特性、进化关系和调控功能提供了重要的研究基础。
1 材料与方法 1.1 双壳贝类CK1基因家族鉴定为了鉴定双壳贝类CK1家族成员基因, 在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Uniprot (https://www.uniprot.org/)和ENSEMBL (http://ensemblgenomes.org/)数据库中下载代表性的脊椎动物: 人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(D. rerio)和无脊椎动物秀丽隐杆线虫(C. elegans)的全长CK1蛋白序列(表 1), 将以上蛋白序列与四种双壳贝类的基因组和转录组进行比对以鉴定CK1家族基因(e < 1×10–5) (Altschul et al, 1990)。为了确保CK1基因家族鉴定的完整性, 通过HMM搜索方法(http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/phmmer)进行序列分析, 并对所有潜在的双壳贝类CK1蛋白的保守结构域进行了比对。
| 物种 | 基因 | 登录号 | 物种 | 基因 | 登录号 | |
| 人 | CK1α | P48729 | 斑马鱼 | CK1α | Q8JGT0 | |
| H. sapiens | CK1αlike | Q8N752 | D. rerio | CK1δ | Q7T2E3 | |
| CK1δ | P48730 | CK1ε | Q6P109 | |||
| CK1ε | P49674 | CK1γ1 | Q5PRD4 | |||
| CK1γ1 | Q9HCP0 | CK1γ2 | B0S605 | |||
| CK1γ2 | P78368 | 海鞘 | CK1α | BAD54833.1 | ||
| CK1γ3 | Q9Y6M4 | C. intestinalis | CK1αlike | CDW38362.1 | ||
| 小鼠 | CK1α | Q8BK63 | 文昌鱼 | CK1α | XP_035672526.1 | |
| M. musculus | CK1δ | Q9DC28 | B. floridae | CK1δ | XP_035696210.1 | |
| CK1ε | Q9JMK2 | CK1ε | XP_035696211.1 | |||
| CK1γ1 | Q8BTH8 | CK1γ3 | XP_035666971.1 | |||
| CK1γ2 | Q8BVP5 | 光滑双脐螺 | CK1α | XP_013070859.1 | ||
| CK1γ3 | Q8C4X2 | B. glabrata | ||||
| 非洲爪蟾 | CK1α | P67963 | 赤拟谷盗 | CK1αlike | KYB25276.1 | |
| X. laevis | CK1δ | AAX22003.1 | T. castaneum | |||
| CK1ε | AAF01032.1 | 秀丽隐杆线虫 | CK1ε | Q20471 | ||
| CK1γ1 | Q6NRT0 | C. elegans | CK1γ1 | AAW21314.1 | ||
| CK1γ2 | NP_001086018.1 | 柱状珊瑚 | CK1γ3 | A0A2B4RJK2 | ||
| CK1γ3 | NP_001090597.1 | S. pistillata | ||||
| 青鳉鱼 | CK1α | H2N284 | ||||
| O. latipes | CK1δ | H2MS42 | ||||
| CK1ε | H2MHK0 | |||||
| CK1γ1 | H2L7T9 | |||||
| CK1γ2 | A0A3B3HJ60 | |||||
| CK1γ3 | XP_023810057.1 |
将候选的双壳贝类CK1家族成员序列提交给ORF Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测ORF (开放阅读框), 并将预测的ORF翻译成氨基酸序列。使用SMART (Letunic et al, 2021)程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)对翻译后的蛋白质序列进行CK1保守结构域的识别。Sequence Manipulation Suite工具(http://www.bioinformatics.org/sms2/color_align_cons.html)用于序列比对分析, ProtParam(Wilkins et al, 1999)工具(https://web.expasy.org/protparam/)用来预测等电点(PI)、分子量(MV)不稳定指数(Instability index)和疏水性(Gravy)。用IBS1.0.3(Liu et al, 2015)软件绘制了所有已鉴定的CK1基因家族成员的蛋白结构。使用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org)对所有双壳贝类CK1基因家族成员进行蛋白质三级结构的预测。
1.3 系统发育分析在NCBI数据库、Uniprot数据库和Ensembl数据库中下载人(H. sapiens)、小鼠(M. musculus)、非洲爪蟾(X. laevis)、青鳉鱼(Oryzias latipes)、斑马鱼(D. rerio)、海鞘(Ciona intestinalis)、文昌鱼(Branchiostoma floridae)、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、秀丽隐杆线虫(C. elegans)和柱状珊瑚(Stylophora pistillata)共11个物种的CK1蛋白全长序列(表 1), 与鉴定到的4种双壳贝类的CK1蛋白全长序列共同用于构建系统发生树, 使用MEGA7(Kumar et al, 2016)软件中的ClustalW(Larkin et al, 2007)方法进行多序列比对, 使用NJ方法对CK1进行系统发生树构建, Bootstrap法进行重复检验, 重复1 000次。使用iTOL进行优化与展示。
1.4 双壳贝类CK1基因家族时空表达分析为了进行表达分析, 从已发表的虾夷扇贝(Wang et al, 2017)、栉孔扇贝(Li et al, 2017)、长牡蛎(Zhang et al, 2012)和侏儒蛤(实验室未发表数据)的不同胚胎发育阶段和成体组织的转录组数据中计算CK1基因家族的表达量TPM (Transcript per Million)值。其中胚胎发育阶段包括受精卵、多细胞、囊胚、原肠胚、担轮幼虫、D型幼虫、壳顶幼虫前期、壳顶幼虫中期、壳顶幼虫后期、匍匐幼虫、稚贝; 成体组织包括肝胰腺、鳃、外套膜、肌肉、雄性性腺和雌性性腺。为了可视化CK1基因家族在四种双壳贝类动物中的表达模式, 通过R软件包进行绘制热图。
1.5 双壳贝类胚胎发育基因共表达网络构建利用R中的WGCNA软件包(Langfelder et al, 2008)构建了双壳贝类个体发育的基因共表达网络, 虾夷扇贝、栉孔扇贝、长牡蛎和侏儒蛤分别有20 418、22 179、23 573、22 941个基因参与构建基因共表达网络, 基因模块最小基因数为300。基因共表达网络不同模块使用不同颜色进行标记, 未分配的基因用灰色标记, 模块中基因的关键程度通过计算模块内基因连通度来决定, 并对CK1家族成员所在模块进行连通度以及KEGG富集分析。
1.6 高温应激实验采集活性好的40只2龄虾夷扇贝个体进行高温应激实验。实验前, 将所有个体随机平分成两个平行组, 并在实验室分开暂养7 d, 使其适应实验室养殖环境, 期间水温维持在10 ℃, 每天换水1/2, 投喂扁藻等单胞藻, 投饵量为5×104 ind./mL。实验时, 将两个平行组个体由10 ℃暂养水体分别同时迅速转移至两个23 ℃水体当中(充足供氧)。在温度骤变后的0、3、6、12和24 h分别从两个平行组中随机取3只虾夷扇贝, 迅速解剖并收集其鳃, 组织分离后立刻使用液氮冷冻, –80 ℃保存以备总RNA的提取。
1.7 RNA提取和实时定量PCR (qPCR)分析使用实验室前期发表RNA提取方法(Hu et al, 2006), 从采样的虾夷扇贝的鳃中提取总RNA, 然后用DNaseI消化。使用Nanovue Plus分光光度计测定RNA的浓度和纯度, 通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性。使用莫洛尼小鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶在20 μL的体系中合成第一链cDNA, 每个样本总RNA含量2 μg作为模板, 0.5 mg的Oligo(dT)18作为引物。混合体系在65 ℃下变性5 min, 然后在冰上立即冷却。加入反转录酶、反应缓冲液和dNTPs后, 在以下条件下扩增cDNA: 42 ℃ 90 min, 72 ℃ 10 min。将cDNA稀释至10 ng/μL, 保存在–20 ℃, 作为qPCR的模板。EF1A被用作反应所需的内参基因(Santerre et al, 2013; Li et al, 2016), 所有引物都是用Primer 5.0软件设计的, 使用BLASTN (1×10–10)将所设计的引物与虾夷扇贝基因组进行比较以验证其特异性, 并列于表 2。使用LightCycler 480实时定量PCR仪(Roche)进行扩增。
| 基因名称 | 引物序列(5'~3') |
| PyCK1α-F | TTGCGTATCGGGCAGTTC |
| PyCK1α-R | CCTGACAATTTCTTAATGGG |
| PyCK1αlike-F | CCTTGTTGCAGTGACGACC |
| PyCK1αlike-R | GCAGATCAGATGATAAACAGG |
| PyCK1δ-F | GCAAGGAGGAGTGGGAAT |
| PyCK1δ-R | GCTTATCAACTGATCTGCCAG |
| PyCK1γ3-F | GCCAAGTTCAAATCAAAGGG |
| PyCK1γ3-R | GGAACTGACCACCTGAACTGA |
| EF1A-R | GTTCACGTTCAGCCTTCAGT |
| EF1A-F | GCGGTGGTATTGACAAGAGA |
实时定量PCR反应过程如下: 取2 μL cDNA作为反应模板, 加入10 μL SYBR Green I Real-time PCR Master Mix, 上、下游引物(2 μmol/L)各4 μL, 最终得到20 μL的反应体系。反应程序如下: 95 ℃ 10 min; 95 ℃ 15 s, 53 ℃ 60 s, 40个循环; 95 ℃ 15 s, 1个循环。进一步通过熔解曲线验证引物特异性, 使用2–ΔΔCt的方法计算CK1基因的相对表达量。基于各基因的相对表达水平, 使用SPSS软件进行数据的统计分析, 使用独立t检验的统计软件包, 分析各CK1基因表达变化的规律。
2 结果 2.1 双壳贝类CK1基因家族全基因组的鉴定和结构分析通过多物种、多组学的系统比对策略, 从虾夷扇贝、栉孔扇贝、长牡蛎、侏儒蛤的全基因组中均鉴定出4个CK1家族成员, 包括CK1α, CK1αlike, CK1δ, CK1γ3, 并发现CK1ε, CK1γ1, CK1γ2在双壳贝类中发生了丢失。根据CK1蛋白结构(表 3), CK1δ和CK1γ3氨基酸序列长度(> 400 aa)明显大于CK1α和CK1αlike (300~400 aa)。各CK1家族成员均是疏水性蛋白质且稳定性较好。另外, 蛋白质的二级结构信息显示, 除了CgCK1δ中的α-螺旋数目最多, 其他的蛋白二级结构中的无规卷曲的数目最多, 其次是α-螺旋数目, β-折叠和β-转角的数目相似。通过对双壳贝类CK1的保守结构域的多重序列比对发现CK1最佳的磷酸化基序均为T-G-T (图 1)。
| 长度/aa | 蛋白分子量/kDa | 等电点 | 不稳定性指数 | 疏水性 | α-螺旋数目 | β-折叠数目 | β-转角数目 | 无规卷曲数目 | |
| PyCK1α | 327 | 37.57 | 9.83 | 39.88 | –0.407 | 17 | 12 | 14 | 25 |
| PyCK1αlike | 347 | 39.83 | 9.74 | 49.36 | –0.301 | 21 | 13 | 16 | 27 |
| PyCK1δ | 419 | 47.79 | 10.25 | 39.48 | –0.639 | 18 | 13 | 16 | 33 |
| PyCK1γ3 | 461 | 52.73 | 8.59 | 38.07 | –0.790 | 21 | 16 | 18 | 32 |
| CfCK1α | 329 | 37.67 | 9.77 | 42.51 | –0.388 | 14 | 12 | 13 | 23 |
| CfCK1αlike | 332 | 38.25 | 9.96 | 44.70 | –0.407 | 20 | 13 | 14 | 27 |
| CfCK1δ | 419 | 47.67 | 10.25 | 38.63 | –0.656 | 17 | 12 | 15 | 31 |
| CfCK1γ3 | 460 | 52.87 | 9.26 | 44.80 | –0.563 | 20 | 15 | 12 | 30 |
| CgCK1α | 323 | 37.28 | 9.88 | 45.20 | –0.423 | 20 | 11 | 16 | 22 |
| CgCK1αlike | 386 | 44.75 | 10.06 | 38.72 | –0.244 | 22 | 16 | 17 | 26 |
| CgCK1δ | 483 | 54.28 | 10.44 | 37.55 | –0.710 | 21 | 17 | 18 | 17 |
| CgCK1γ3 | 467 | 53.21 | 8.95 | 46.20 | –0.791 | 19 | 16 | 15 | 32 |
| MlCK1α | 323 | 37.16 | 9.80 | 42.00 | –0.411 | 15 | 12 | 15 | 24 |
| MlCK1αlike | 351 | 40.45 | 9.71 | 47.36 | –0.500 | 18 | 14 | 14 | 24 |
| MlCK1δ | 467 | 52.52 | 10.12 | 38.66 | –0.637 | 20 | 16 | 17 | 31 |
| MlCK1γ3 | 425 | 49.14 | 9.46 | 41.97 | –0.800 | 20 | 16 | 14 | 28 |
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| 图 1 双壳贝类CK1蛋白序列比对 Fig. 1 CK1 protein sequences alignment in four bivalve species 注: 红色三角形标注的是CK1经典磷酸化基序 |
4种双壳贝类动物的CK1均包括一个分子量较小的N端, 主要由β-折叠组成, 和一个分子量较大的C端、主要由α-螺旋状组成。其中N-末端的分子量范围0.95~5.80 kDa, C-末端的分子量范围4.57~22.77 kDa。保守结构域分子量范围28.20~31.16 kDa, 其中双壳贝类CK1α保守结构域分子量范围为30.87~30.92 kDa, CK1αlike保守结构域分子量范围为30.87~30.99 kDa, CK1δ保守结构域分子量范围为29.99~31.16 kDa, CK1γ3保守结构域分子量范围为28.2~29.97 kDa, 是保守结构域分子量最小的家族成员(图 2)。各CK1蛋白的序列存在差异, 但它们的蛋白质三级结构具有相似性(图 3)。
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| 图 2 双壳贝类CK1蛋白结构域 Fig. 2 Structure of CK1 proteins in four bivalve species |
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| 图 3 双壳贝类CK1蛋白三级结构预测 Fig. 3 Tertiary structure prediction of CK1 proteins in four bivalve species |
为了确定双壳贝类CK1基因的系统发生关系, 我们构建了15种物种的CK1系统发生树(图 4)。系统发育分析表明, 所有的CK1基因被细分为7个成员簇, 包括CK1α, CK1αlike, CK1δ, CK1ε, CK1γ1, CK1γ2, CK1γ3, 且都按照成员分类聚在一起。在每个成员聚类过程中, 原口动物与后口动物分别产生了独立进化枝, 其中在软体动物形成的相对独立的进化枝中, 虾夷扇贝的CK1基因和栉孔扇贝的CK1基因都具有最近的亲缘关系, 同时与长牡蛎、侏儒蛤存在相对较近的亲缘关系, 符合物种之间的系统发生关系。
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| 图 4 CK1基因家族系统发生树 Fig. 4 The phylogenetic tree of CK1 gene family 注: 不同颜色范围代表不同的CK1成员。Hs: 人; Mm: 小鼠; Xl: 非洲爪蟾; Ol: 青鳉鱼; Dr: 斑马鱼; Ci: 海鞘; Bf: 文昌鱼; Py: 虾夷扇贝; Cf: 栉孔扇贝; Cg: 长牡蛎; Ml: 侏儒蛤; Bg: 光滑双脐螺; Tc: 赤拟谷盗; Ce: 秀丽隐杆线虫; Sp: 柱状珊瑚 |
基于双壳贝类胚胎发育各时期的转录组数据分析(图 5a), 所有双壳贝类CK1基因均在担轮幼虫时期之前呈现出不同水平的高表达。其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1δ、CfCK1γ3、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1α、MlCK1δ、MlCK1γ3、主要在受精卵到多细胞期具有相对较高的表达量, 并在囊胚期的表达量下降; CgCK1α、MlCK1αlike在多细胞期开始具有较高的表达量, CgCK1α在原肠胚期表达量开始下降, 而MlCK1αlike在囊胚和原肠胚期的表达量相对较低, 在担轮幼虫期表达量再次上升; PyCK1α、CfCK1α在囊胚期至担轮幼虫期具有相对较高的表达量, 其中原肠胚时期达到最高, 从担轮幼虫期开始其表达量开始逐渐下降; CfCK1αlike、CgCK1αlike从囊胚到担轮幼虫期有相对较高的表达量, 在原肠胚时期具有最高表达量。
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| 图 5 双壳贝类CK1基因家族时空表达谱 Fig. 5 Spatio-temporal expression profiles of CK1 family genes in four bivalve species 注: a. 双壳贝类CK1基因家族各胚胎发育时期表达谱; b. 双壳贝类CK1基因家族成体组织表达谱。Zyg: 受精卵; Mut: 多细胞; Bls: 囊胚期; Gas: 原肠胚期; Tro: 担轮幼虫期; Dst: D型幼虫期; E-umb: 壳顶幼虫前期; M-umb: 壳顶幼虫中期; L-umb: 壳顶幼虫后期; Ped: 匍匐幼虫期; Juv: 稚贝。Hep: 肝胰腺; Gill: 鳃; Man: 外套膜; Mus: 肌肉; M-gd: 雄性性腺; F-gd: 雌性性腺 |
对CK1家族基因在双壳贝类成体组织中的表达分析显示(图 5b), 不同的基因在成体组织中的表达模式较为多样, 其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1αlike、CfCK1δ、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1αlike、MlCK1δ、MlCK1γ3在双壳贝类的鳃中表达量明显高于其他组织。另外PyCK1α、CfCK1α、CfCK1γ3、CgCK1α和MlCK1α表达模式相似, 均在双壳贝类的雄性性腺中具有最高的表达量。而值得注意的是, CgCK1αlike在长牡蛎的肌肉中具有最高的表达量。
2.4 双壳贝类胚胎发育基因共表达网络及功能富集我们构建了虾夷扇贝、栉孔扇贝、长牡蛎和侏儒蛤个体发育时期的基因共表达网络(图 6a), 网络模块数目分别为12、14、9和10个, 将模块中的前10% 连通度的基因定义为关键基因。在虾夷扇贝中PyCK1αlike、PyCK1δ和PyCK1γ3划分在turquoise模块(PyM1), 其中PyCK1δ是该模块的关键基因, PyCK1α在yellow模块(PyM2); 在栉孔扇贝中CfCK1α和CfCK1αlike在brown模块(CfM1), CfCK1δ和CfCK1γ3分别被划分至yellow (CfM2)和pink (CfM3)模块, 均为关键基因; 在长牡蛎中CgCK1α和CgCK1αlike划分在blue模块(CgM1)且为关键基因, CgCK1δ和CgCK1γ3在yellow模块(CgM2)。在侏儒蛤中MlCK1α、MlCK1δ和MlCK1γ3划分在yellow模块(MlM1), MlCK1αlike是侏儒蛤网络turquoise模块(MlM2)的关键基因。对CK1为关键基因的模块(PyM1、CfM2、CfM3、CgM1、MlM2)进行KEGG功能富集分析结果显示, PyCK1δ、CfCK1δ、CgCK1α和CgCK1αlike在胚胎发育时期除了DNA复制、RNA转运和降解等基本生物过程, 还参与了碱基切除修复、核苷酸切除修复以及错配修复等与DNA损伤修复相关的过程。CfCK1γ3主要参与了核糖体过程, MlCK1αlike参与调控蛋白质转运、MAPK信号通路、钙信号通路和Wnt信号通路。
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| 图 6 双壳贝类个体发育的基因共表达网络及KEGG富集 Fig. 6 Gene co-expression network and KEGG enrichment in individual development 注: a. 双壳贝类个体发育的基因共表达网络; b. CK1相关关键模块KEGG富集 |
本研究采用qPCR方法, 在虾夷扇贝受到高温应激后0、3、6、12和24 h检测鳃中CK1基因的表达水平变化(图 7), 其中误差线表示平均值±SE (n=6)。结果显示, PyCK1α、PyCK1αlike和PyCK1δ在高温应激后总体表达趋势相似, 均在应激3 h时显著上调(分别为0 h的1.08、1.50、2.39倍, P < 0.05), PyCK1α在应激6 h时持续上调达到最高值, 随后表达量开始下降并于24 h时显著低于0 h (P < 0.05)。而PyCK1αlike和PyCK1δ从应激3 h后表达量开始有所下降, 12 h和24 h时相对表达量均低于0 h, 在24 h时下调最为显著(PyCK1αlike P < 0.05, PyCK1δ P < 0.01)。值得注意的是PyCK1γ3显示出不同的响应模式, 在应激后不同时间点的相对表达量均呈现了下调趋势, 3 h、6 h、12 h和24 h的相对表达量均低于0 h, 并在12 h和24 h时显著下调(P < 0.05)。
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| 图 7 高温应激后CK1基因在虾夷扇贝鳃中表达情况 Fig. 7 Gene expression profiling of CK1 genes in the gill after heat stress treatment 注: 竖线表示平均值±SE(n=6); *表示差异显著(P < 0.05); **表示差异极显著(P < 0.01) |
本研究联合基因组和转录组数据对4种双壳贝类CK1基因家族进行了全基因组鉴定, 并探究了其时空表达特征和高温应激条件下的表达规律。双壳贝类CK1基因均在担轮幼虫时期之前有相对较高的表达, 其中PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1δ、CfCK1γ3、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1α、MlCK1δ、MlCK1γ3在受精卵中呈现相对较高的表达量, 可能是来自于母源性mRNA, 并在囊胚或原肠胚时期基本降解完全; PyCK1α、CfCK1α、CfCK1αlike、CgCK1α、CgCK1αlike、MlCK1αlike在多细胞或囊胚时期开始具有相对较高的表达量, 具有合子表达特征。Albornoz等(2007)在研究CK1基因家族在斑马鱼胚胎发育时期的表达模式中也发现类似规律, 除了CK1ε, 其他CK1基因在胚胎发育的早期阶段普遍表达, 并且具有母源和合子表达的特征。
PyCK1δ、CfCK1δ、CgCK1α、CgCK1αlike显著富集到修复DNA损伤的相关通路, 暗示了双壳贝类胚胎早期细胞分裂与DNA复制活动旺盛, CK1家族基因的高表达可能对于其维持正常细胞周期活动、DNA修复等具有重要作用。Puigvert等(2013)研究发现CK1α可以通过磷酸化作用调控促凋亡和抗凋亡信号途径竞争以响应DNA损伤来调节细胞存活。另外, CK1δ在DNA修复和细胞周期调节中起着重要作用(Knippschild et al, 2014), Greer等(2017)研究发现CK1δ的表达有助于DNA损伤的有效修复和维持有丝分裂检查点的正常功能。另外有研究表明, CK1α可以通过磷酸化Wnt受体相关蛋白Dvl增加与Wnt受体的亲和力来完成对细胞行为和细胞命运的严格控制, 从而维持正常的胚胎发育(Cruciat, 2014; Banerjee et al, 2019; Lau et al, 2019)。而MlCK1αlike在Wnt相关通路的显著富集也印证了以上发现。
在成体组织中, PyCK1αlike、PyCK1δ、PyCK1γ3、CfCK1αlike、CfCK1δ、CgCK1δ、CgCK1γ3、MlCK1αlike、MlCK1δ和MlCK1γ3在鳃中有较高的表达。纤毛是双壳贝类动物的鳃行使呼吸、营养吸收等重要生理功能的结构基础(Gómez-Mendikute et al, 2005)。有研究表明, CK1激酶能够通过调节I1 dynein的保守调节因子维持纤毛的正常活动(Fu et al, 2018)。CK1在双壳贝类鳃中普遍的高表达现象可能对维持其纤毛的正常生理活动有重要的作用。另一方面, CK1基因家族在细胞应激反应中具有突出贡献, 双壳贝类生存环境复杂, 鳃丝作为双壳贝类与外界直接接触的器官之一, 外界的有害刺激会直接影响鳃细胞的状态和活力(Nogueira et al, 2013)。故推测CK1在鳃中的高表达可能对于其抵御外界不良刺激具有重要的意义。PyCK1α、CfCK1α、CfCK1γ3、CgCK1α和MlCK1α在雄性性腺中具有最高的表达量。有研究表明, CK1可以通过磷酸化作用促进减数分裂过程的同源重组(Sakuno et al, 2015)。它们可能在双壳贝类精子细胞的减数分裂过程中调节染色体行为。值得注意的是, 虽然4种双壳贝类之间整体CK1基因的表达趋势相似, 但仍存在强烈的物种特异性, 这可能反映了4个物种的适应性差异。例如, 虽然CgCK1αlike在长牡蛎肌肉中表达最高, 但在其他贝类的肌肉中几乎没有表达。这可能与长牡蛎在潮间带中的附着生活方式密切相关, CgCK1αlike或参与氧化应激反应以避免肌肉萎缩(Oh et al, 2021)。
Nielsen等(2021)通过对北极潮间带贻贝(Mytilus edulis)高温应激实验明确了高温可以激发细胞产生热休克蛋白以增加细胞抵抗能力, Muller等(2013)发现CK1基因可以磷酸化Hsp70和Hsp90维持细胞蛋白的折叠和降解的平衡。这或许暗示着PyCK1α、PyCK1αlike和PyCK1δ参与磷酸化热激蛋白来响应高温应激反应。另一方面, 也有研究表明高温应激会导致DNA损伤(Cheng et al, 2018), PyCK1α、PyCK1αlike和PyCK1δ可能参与高温应激引起的DNA损伤反应。有研究表明, CK1γ3活性的下降, 能够减少细胞坏死性凋亡(Lee et al, 2019), 故推测PyCK1γ3在高温应激条件下的表达下调, 有利于维持鳃细胞的稳态从而避免细胞发生坏死性凋亡。持续的高温应激条件下, 会使虾夷扇贝的细胞生存状态遭到破坏, PyCK1表达量开始下降。以上结果暗示了CK1是参与细胞应激反应的重要基因, 参与了虾夷扇贝处于高温环境时的应激反应。
4 结论本研究首次系统鉴定了虾夷扇贝、栉孔扇贝、长牡蛎和侏儒蛤4种双壳贝类中的CK1基因, 包括CK1α、CK1αlike、CK1δ和CK1γ3, 并全面分析了其蛋白结构、蛋白质性质以及系统发生关系。通过胚胎、组织转录组分析和高温应激实验探究了双壳贝类CK1基因家族的时空表达和高温应激条件下的表达规律。结果表明, 双壳贝类CK1可能参与维持早期胚胎发育的基因组稳定性和成体组织稳态。此外, CK1基因家族在高温应激反应中的潜在响应机制也得到了细致的描述。本研究结果为更好地理解双壳贝类动物CK1基因家族的进化关系、发育调节和应激反应机制奠定重要研究基础。
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