高通量测序已成为一种广泛用于动植物基因组测序技术(孟刚等, 2021; 王子寅等, 2023)。通过高通量测序技术可以进行基因组survey研究, 包括基因组大小估计、重复序列比例和GC含量计算, 以及对遗传多样性、基因组结构和遗传改良的了解(Barchi et al, 2011; Rowe et al, 2011; Xu et al, 2014; Shi et al, 2018), 其结果可用于调查基因组图谱和提取线粒体基因组。对于缺乏基因组数据的非模式物种来说, 针对基因组的survey分析是分子机理研究和基因资源开发的前提(Kim et al, 2011)。

线粒体是半自主细胞性细胞器, 普遍存在于真核细胞内(Boore, 1999)。脊椎动物的线粒体DNA (Mitochondrial DNA, mtDNA)基因结构紧凑, 长度一般在15~20 kb之间, 并且编码的基因库非常保守(张方等, 1998)。脊椎动物的线粒体基因组中一般包括了22个tRNA基因、2个rRNA基因、13个蛋白质编码区(PCGs)、1个非编码区包括D-loop区和1个轻链复制起始区(O_L) (Satoh et al, 2016)。线粒体基因组具有结构简单、编码区域高度保守、母系遗传、进化速率快、拷贝数高等鲜明特征(Ruan et al, 2020), 被广泛应用于群体遗传学、进化生物学和谱系遗传学等方面(Ko et al, 2018; Zeng et al, 2018; 匡卫民等, 2019; Chan et al, 2019)。线粒体物种特异性DNA片段, 如核糖体RNA (12S rRNA和16S rRNA)、细胞色素b (Cyt b)和细胞色素c氧化酶I (COI)通常用于鱼类物种鉴定(Cutarelli et al, 2018)。目前有较多的学者用线粒体基因组全序列构建系统发育树来比较进化关系, 相比于其他的COI、12S rRNA和16S rRNA等单一基因序列构建的系统发育树可以减少因信息分布的不均一性和序列长度太短而造成的进化树置信度降低带来的影响, 使得研究结果更精确、可靠(肖家光, 2015)。

瑞氏红鲂(Satyrichthys rieffeli)隶属鲉形目(Scorpaeniformes)、黄鲂科(Peristediidae)、红鲂属(Satyrichthys) (中坊徹次, 2013; 陈大刚等, 2015; 赵盛龙等, 2016), 广泛分布于黄海南部、东海、台湾海域、海南岛、日本、加里曼丹和西北太平洋海域(伍汉霖等, 2021)。目前关于瑞氏红鲂的研究报道较少, 主要是对其分类特征方面的描述(Bussing, 2010; Ono et al, 2014), 遗传学方面, 仅在GenBank中发现2条COI基因片段序列。本研究采用高通量测序技术, 对瑞氏红鲂的全基因组大小、杂合度等指标进行测定和评估; 通过基因组survey结果挖掘出线粒体基因组序列并对其进行注释分析, 为制定全基因组测序方案提供理论依据; 结合GenBank中18种鲉形目鱼类的线粒体基因组全序列构建系统发育树, 为瑞氏红鲂分类及其系统发育关系深入研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 样品采集与保存

本研究所用瑞氏红鲂样品于2021年12月采自东海大陆坡1955海区至1956海区, 共采集6尾样品, 冷冻保存运至实验室, 常规生物学测定后, 取1 g背部肌肉于–80 ℃保存, 用于后续DNA提取; 选取其中一尾进行survey测序。

1.2 实验方法 1.2.1 基因组survey测序

用标准的苯酚-氯仿法提取肌肉组织的总基因组DNA (Maniatis et al, 1982)。检测合格的DNA样本通过超声波破碎仪随机打断成长度为300~350 bp的片段, 经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。构建好的文库通过Illumina nova进行PE150测序。使用fastp软件对测序数据进行数据过滤与去冗余操作(Kajitani et al, 2014), 过滤后得到的高质量数据将用于后续的杂合度、GC含量以及基因组大小等信息分析。

1.2.2 基因组大小预估和K-mer分析

利用过滤后的数据, 取K=17, 参照Liu等(2013)的K-mer分析方法对瑞氏红鲂基因组大小、杂合率和重复率等基因特征进行进一步分析。基于K-mer分析的结果, 获得了关于峰的深度和预测的最佳K-mer数量的信息, 并用于估计基因组的大小。

1.2.3 基因组组装

使用SOAPdenovo软件(Luo et al, 2012)对过滤去除低质量数据之后的高质量测序数据进行基因组预组装分析。采用K=48构建Contig和Scaffold, 利用高质量数据进行全基因组装, 使用SOAPdenovo软件将过滤后的reads比对拼接到该组装序列上, 获得原始基因组序列及碱基深度。

1.2.4 线粒体基因组组装和注释

借助NOVOPlasty 2.6.3软件从原始的基因组测序数据中提取线粒体基因组序列(Dierckxsens et al, 2017), 参数采用默认设置, 参考序列为GenBank瑞氏红鲂 COI序列(GenBank No.MK777566.1)。通过MitoFish将得到的数据进行注释和可视化(Iwasaki et al, 2013)。利用MEGA 11计算基因组碱基组成､氨基酸使用频率及同义密码子相对使用频率(匡卫民等, 2019)。

1.2.5 系统进化分析

GenBank中下载18种鲉形目鱼类的线粒体基因组, 以豹鲂 (Dactylopterus volitans)为外群, 基于12种蛋白质编码基因(除ND6)进行系统发育分析, 确定瑞氏红鲂的分类地位。利用MEGA X和贝叶斯法(Bayesian)构建最大似然树(ML)和贝叶斯树(BI) (Ronquist et al, 2003), 采用MEGA X方法估计了最优核苷酸替换模型(Kumar et al, 2018), 基于BIC标准得到最优GTR+G+I模型, 确定构建系统发育树的最佳模型。利用MEGA X软件构建了1 000个重复的最大似然系统发育树, 探究系统进化关系｡

2 结果 2.1 基因组survey结果 2.1.1 测序数据统计及质量评估

使用Illumina nova测序平台进行双末端测序, 使用瑞氏红鲂基因组总DNA构建300 bp的文库, 测序得到raw reads 57.59 Gb, 质控后得到约49.13 Gb的clean reads。瑞氏红鲂质控后其Q₂₀值为96.73%, Q₃₀值为91.72% (表 1), 显示本次瑞氏红鲂的高通量测序结果有较高的准确性, 结果可用于后续的分析。

2.1.2 污染评估及处理

为了验证瑞氏红鲂的DNA是否存在污染, 从350 bp文库中对过滤后的高质量数据随机抽取10 000对reads数据, 通过Blast软件比对NCBI核苷酸数据库(NT库), 将前80%比对上的物种展示出来(表 2)。其中比对结果最高的是石斑鱼属的鱼类, 占比19.93%, 与瑞氏红鲂差异较远。对比结果没有出现较高比例的物种, 比对近源物种的DNA, 可以判断此次测序样品未被污染, 并做进一步分析。

2.1.3 K-mer分析

使用K-mer分析预测了瑞氏红鲂的基因组特征及杂合率和重复比例。选取K=17, 预测瑞氏红鲂基因组大小为827 Mb, 修正后的基因组大小为813 Mb; 基因组杂合率为0.92%, 重复序列比例为45.97% (表 3)。其K-mer深度在48时出现一个期望深度, 且没有出现其他峰值(图 1), 说明瑞氏红鲂基因组杂合度较低。

2.1.4 瑞氏红鲂基因组组装结果

通过SOAPdenovo初步组装得到Contigs的结果见表 4。N50和N90的值可以说明survey结果组装的质量, S. rieffeli contig N50和N90分别为712 bp和134 bp, Contigs大于100 bp的占总数的98.42%; A、T、G、C和N的占比分别为29.64%、28.81%、20.52%、21.02%和0, GC含量为41.55%。

2.2 线粒体基因组注释 2.2.1 线粒体基因组组成及其特征

从survey结果里面提取并组装线粒体基因组, 结果显示瑞氏红鲂的线粒体全序列长16 527 bp, 其中有38个基因获得注释, 分别由22个tRNA、13个蛋白质编码基因(PCGs: APT6、ATP8、Cyt-b、COⅪ~COXⅢ、ND1~ND6和ND4L)、2个rRNA (12S rRNA和16S rRNA)和1个D-loop区组成(图 2, 表 5)。

除8个tRNA基因(tRNA-Gln、Ala、Asn、Cys、Tyr、Ser、Glu、Pro)和1个PCGs基因(ND6)在线粒体基因组的L链上, 其他29个基因和D-loop区均在H链上, 基因间都未发生重排。其中11个基因发生了间隔, 共99 bp, tRNA-Cys基因间隔最长, 共39 bp, 其次是基因ND6, 共32 bp; 有4个基因发生了重叠, 共8 bp, 重叠的基因是tRNA-Gln、tRNA-Met、ND4和tRNA-Pro, 其中基因ND4重叠最多, 有5 bp。瑞氏红鲂线粒体全基因碱基组成: A (27.4%)、T (26.9%)、G (16.8%)、C (28.9%) (表 6), 各基因的GC含量在44.4%~51.4%之间, 其中A+T的含量(54.3%)大于G+C的含量(45.7%)。

2.2.2 蛋白质编码基因(PCGs)

瑞氏红鲂的蛋白质编码基因(PCGs)由ATP6、ATP8、Cyt-b、COⅪ-Ⅲ、ND1-6和ND4L组成, 其大小为11 400 bp, 占线粒体基因组的68.98%。12个PCGs在H链上编码, 只有ND6在线粒体基因组的L链编码。蛋白质编码基因的起始密码子除COI是GTG外, 其余均是ATG; 终止密码子除ND1和ND6是TAG, 其他都是TAA, 其中有不完整终止密码子TA-或T--; 有6个完整的终止密码子(ND1、COⅪ、ATP8、ND4L、ND5、ND6), 7个不完整的终止密码子(Cyt b、ND4、ND3、COXⅢ、ATP6、COⅫ、ND2)。当蛋白质编码基因(如ND2、COⅫ、ATP6、COXⅢ、ND3、ND4、Cyt b)的3′端后面是编码一个tRNA基因在同一链上时, 主要使用不完全终止密码子TA-、T-和AG-。通过比较瑞氏红鲂的13个蛋白质编码基因的AT-skew和GC-skew值(图 3), 可以看出除AT-skew的COI与ATP8和GC-skew的ND6为正值以外, 其余均为负值。

2.2.3 RNA基因

瑞氏红鲂线粒体基因组中包含22个tRNA, 各tRNA的序列长度分别为66~74 bp, 其中tRNA-Leu (TAA、TAG)和tRNA-Ser (GCT、TGA)由两种反密码子编码, 其他的都是一种反密码子编码。此外, 21个tRNA呈典型的三叶草二级结构, 只有tRNA-Ser (GCT)缺失了二氢尿苷臂(DHU臂)的简单环(图 4)。

瑞氏红鲂线粒体基因组中发现2个rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA), 其长度分别为946 bp和1 699 bp, rRNA的碱基含量为分别为A (31.9%)、T (21.9%)、C (25.3%)、G (20.9%) (表 6), 没有表现出明显的反G偏倚。

2.2.4 线粒体基因组密码子使用情况

瑞氏红鲂线粒体基因组中密码子使用最常见的氨基酸为异亮氨酸(Leu)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser-TGA), 使用最少的是半胱氨酸(Cys), 仅由两个密码子编码(图 5), 氨基酸脯氨酸(Pro)的使用量最高, 可以被4种不同密码子编码, 异亮氨酸(Leu)可以被6种不同的密码子编码。而相对同义密码子使用频率(relative synonymous codon usage, RSCU)也被用于评估线粒体基因密码子的使用情况(图 6)。瑞氏红鲂的同义密码子使用中NNC和NNT (N代表A、T、C、G)的使用频率更高。

2.2.5 非编码区

非编码区又称之为D-环区(displacement-loop region), 位于tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之间, 是整个线粒体基因组序列和长度变异最大的区域, 但其中也包含保守片段。瑞氏红鲂的非编码区各碱基含量分别为T (30.0%)、C (21.4%)、A (32.3%)、G (16.3%), 表现出明显的AT偏好性, A+T的含量达到了62.3%, G+C的含量仅为37.7%。

2.3 系统发育关系

为了分析瑞氏红鲂的系统发育关系, 从NCBI数据库里面下载18个鲉形目(7科18种)鱼类的线粒体基因组, 选择在H链上的蛋白质编码基因(除ND6以外的所有蛋白质编码基因)使用最大似然法和贝叶斯法构建ML树和BI树(图 7, 图 8)。以豹鲂为外群, 构建的系统发育树显示, BI树中鲉科鱼类首先与豹鲂科鱼类先分离出来, 鲂科和黄鲂科的亲缘关系更近, 作为姐妹类群分为一支; 而狮子鱼科、六线鱼科和杜父鱼科鱼类作为一支分离出来。ML树与之不同的是鲉科与其他5科鱼类形成姐妹类群分开, 与BI树相同的是黄鲂科与鲂科鱼类亲缘关系较近, 互为姐妹类群, 瑞氏红鲂与须叉吻鲂亲缘关系最近, 同属黄鲂科鱼类。

3 讨论

近年来, 高通量测序技术的迅速发展为解决非模式海洋鱼类的基因组问题提供了有效的技术手段。利用K-mer方法可以估计非模型物种的基因组大小, 无须任何先验知识(Li et al, 2019b), 其方法已被应用于绒杜父鱼(Hemitripterus villosus) (赵蕊蕊等, 2022)、褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus) (Xu et al, 2020)、菖鲉属(Sebastiscus) (Jia et al, 2021)等鲉形目鱼类的研究。目前瑞氏红鲂的分子信息还不完善, 本研究survey结果显示GC含量在41%左右出现峰值(双端测序结果都出现在41%左右), 且没有出现明显的偏差, 表明测序结果没有偏向性; 并获得49.13 Gb的clean reads, Q₂₀大于90%, 基因组大小为827 Mb, 修正后的基因组大小为813 Mb, 其杂合率为0.92%, 重复率为45.97%。瑞氏红鲂与大多数的海洋鱼类相似, 其基因组大小稍大于绒杜父鱼713.18 Mb (赵蕊蕊等, 2022)、褐菖鲉812.86 Mb (Xu et al, 2020)、艾氏蛇鳗(Ophichthus lithinus) 755.24 Mb (宁子君等, 2022), 稍小于许氏平鲉(Sebastes schlegelii) 846.36 Mb、朝鲜平鲉(Sebastes koreanus) 832.53 Mb、金斑平鲉(Sebastes nudus) 813.12 Mb (Xu et al, 2019)、双带缟虎(Tridentiger bifasciatus) 887.60 Mb (Zhao et al, 2022), 导致物种间基因组大小的差异可能是由于重复序列含量差异所导致。瑞氏红鲂的重复率为45.97%, 较绒杜父鱼38.61%、褐菖鲉39.65%、艾氏蛇鳗43.30%、许氏平鲉44.10%、朝鲜平鲉43.65%、金斑平鲉41.40%、双带缟虎32.60%均较大。此外, 瑞氏红鲂的杂合率为0.92%, 较绒杜父鱼0.26%、褐菖鲉0.17%、艾氏蛇鳗0.70%、许氏平鲉0.22%、朝鲜平鲉0.20%、金斑平鲉0.31%、双带缟虎0.47%均较大, 一般来说, 杂合率大于0.8%, 重复率大于60%就称为复杂基因组(高胜寒等, 2018), 由于瑞氏红鲂的杂合率高于0.8%, 重复率低于60%, 其基因组不属于复杂基因组类型。在本研究中, 组装的初步结果显示Contigs的N50为712 bp, N50数量为254 317, 其结果满足基因组组装要求。通过过滤后的clean reads组装瑞氏红鲂的基因组, 这是目前第一个基于二代测序技术组装瑞氏红鲂的基因组, 该基因组为瑞氏红鲂的进化生物学研究提供了基础数据, 也为进一步探索该物种的基因组特征提供了参考。由于二代测序技术存在读长短、组装结果的连续性无法保证以及由于基因组的杂合导致过度组装或组装不彻底等问题, 因此本研究缺少对GC-depth和含量的相关分析, 后续开展三代测序以获得瑞氏黄鲂高质量的基因组。

本研究组装出来的线粒体基因组大小为16 527 bp, 线粒体结构未出现基因重排现象, GC含量为45.7%, 出现明显的AT偏倚, 其结果符合硬骨鱼类线粒体碱基组成偏好于碱基A和T的特点(Broughton et al, 2001; 蒙子宁等, 2004; Consuegra et al, 2015), 碱基G的含量为16.8%, 表现出明显的反G偏倚(孟刚等, 2021), 与大多数鱼类研究结果一致(丁少雄等, 2006)。13个PCGs中, COI是以GTG作为起始密码子, 其余均为ATG起始密码子, 其中密码子ATG是翻译效率最高的一个(Consuegra et al, 2015)。PCGs终止密码子中出现T--和TA-这类不完整的终止密码子, 是因为这些基因之后是一个编码在同一条链上的基因, 允许转录在没有完整密码子的情况下终止(Hecht et al, 2017)。不完全终止密码子的存在在鱼类的线粒体基因组中很常见, 可以通过在mRNA加工过程中添加一个poly A尾巴来完成(Ojala et al, 1981; Liu et al, 2009)。PCGs的AT-skew和GC-skew为负值(表 6), 一般来说, AT倾斜的幅度小于GC倾斜, 而且在许多情况下, 没有统计学意义, 在这里, AT-skew低于GC-skews (绝对值), 这符合传统的偏好(Yu et al, 2019)。AT-skew的最大值和GC-skew的最小值均出现在ND6中, 且该基因的AT/GC-skew值波动较大, 核苷酸偏斜可能是由于在复制和转录过程中突变压力和选择压力之间的平衡, 为基因复制提供了一个潜在的方向(McLean et al, 1998; Touchon et al, 2008)。tRNA基因结构中仅tRNA-Ser (TCG)基因缺失DHU臂的结构, 这是鱼类线粒体基因组的共同特征, DHU臂的缺失改变了tRNA-Ser (TCG)在线粒体基因中的识别潜力, 使其更容易被识别(Hardt et al, 1993)。瑞氏红鲂线粒体基因组的12S rRNA和16S rRNA基因定位于H链tRNA-Phe和tRNA-Leu (UUR)基因之间, 中间以tRNA-Val基因为间隔, 12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守(Satoh et al, 2016)。当RSCU值=1时, 表示密码子的使用频率与其他简并密码子没有差异; 当氨基酸的RSCU值均不等于1, 说明每个氨基酸的使用都有不同程度的偏倚(周丹等, 2013; 孟乾等, 2020)。D-loop区在tRNA-Pro和tRNA-Phe之间, 与其他大多数脊椎动物的排列一样(Wei et al, 2010; Li et al, 2019a)。

目前通过线粒体基因组构建系统发育树来确定物种的进化关系已经成为系统发育分析的常用方法, 比如周志雄等(2020)通过线粒体基因组构建系统发育树得出东方鲀属内系统发育关系较为复杂, 且存在野生环境下种间自然杂交现象; Miya等(2015)通过过去15年线粒体基因组发展应用做出的总结, 认为线粒体基因组分析和高通量测序技术会成为物种分类重要方法。本研究基于12个PCGs构建系统发育树, 以豹鲂作为外群, 分析瑞氏红鲂的系统发育关系。ML树和BI树结果表明鲉科在ML树中与外群遗传距离较近, 聚在一起, 与在BI树中结果不一致, 但是两个树结果都显示鲉科与其他科遗传距离都较远。瑞氏红鲂与须叉吻鲂聚为一支, 作为黄鲂科鱼类, 与形态学研究结果一致(Kawai, 2008)。

4 结论

瑞氏红鲂隶属于鲉形目黄鲂科, 目前仅见瑞氏红鲂形态分类描述, 尚未见遗传学相关研究报道。本研究基于基因组survey结果分析得到瑞氏红鲂的基因组大小827 Mb、杂合率0.92%和重复序列比列45.97%; 线粒体基因组大小为16 527 bp, 由38个基因组构成, 未出现基因重排现象。结合GenBank中18种鲉形目鱼类线粒体基因组, 构建两种系统发育树比较分析, 结果显示瑞氏红鲂为黄鲂科鱼类, 支持形态学分类结果, 为开展黄鲂科鱼类系统发育深入研究奠定了基础。

致谢 感谢赵宸枫在采集样品和鉴定方面的帮助及杨天燕老师的修改意见, 谨致谢忱。