文章信息
- 梁艳, 白丽雯, 李霞, 秦艳杰, 吴迪, 周诗珈. 2018.
- LIANG Yan, BAI Li-wen, LI Xia, QIN Yan-jie, WU Di, Zhou Shi-jia. 2018.
- 氯化锌对松江鲈肾细胞系的毒性效应
- Study on the cytotoxicity of zinc chloride to Trachidermus fasciatus kidney cell lines in vitro
- 海洋科学, 42(4): 64-70
- Marine Sciences, 42(4): 64-70.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20160617001
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文章历史
- 收稿日期:2017-12-08
- 修回日期:2018-02-12
2. 大连海洋大学 农业部北方海水增养殖重点实验室, 辽宁 大连 116023
2. Key Laboratory of Mariculture, Agriculture Ministry, PRC, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China
Zn2+在低浓度下是有机体正常生理活动的必需元素, 是酶的辅基成分或酶的激活剂。然而当它在有机体内积累超过某一阈值时, 则可以导致生物直接或间接中毒[1-3]。Zn作为化学工业的原材料被广泛应用。工业生产过程中排放含Zn的废水和废渣的渗出液能够直接进入水体, 加之Zn是农业生产中常用的杀虫剂, 农业生产中各类含Zn化学制品被大量使用, 致使水体中Zn含量增加。近年来, 随着沿海经济的飞速发展, 工业和生活污水的排放量增大, 近岸海域重金属污染日趋严重[4]。Zn易通过食物链富集而逐级放大, 鱼类处于海洋食物链的高层, 会蓄积更多的Zn, 因此研究Zn2+对鱼类的毒性损伤有重要意义[5]。关于Zn2+对水生动物致毒的研究报道较多, 如李丽娜[6]等报道了Zn2+对泥螺(Bullacta exarata)的毒性实验, 结果表明Zn2+对泥螺的24 h半致死量为0.133 g/L。但利用细胞系所做的研究较少, Rachlin等[7]初步尝试利用黑头呆鱼肌细胞系(fathead minnow muscle cell line, FHM)研究Zn2+的细胞毒性。Taju等[8]比较了印度鲤(Catla catla)成体与鳃细胞系(Catla gill cell line, ICG)对ZnCl2敏感性, 结果两者反应一致, 认为细胞系可以替代成体进行Zn2+的毒理学研究。Tan等[9]报道了草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾细胞系(Ctenopharyngodon idellus kidney, CIK)、斑点叉尾
松江鲈(Trahidermus fasciatus)属于鲉形目(Scor paeniformes)、杜父鱼科(Cottidae)、松江鲈鱼属(Trahidermus), 为小型降海洄游性鱼类[10-11], 本文以松江鲈肾细胞系为实验材料, 研究了氯化锌对细胞主要氧化酶活性的影响以及引起的DNA损伤, 目的是探讨氯化锌对细胞的毒性效应, 为利用细胞系作为一种模型来评估水环境中Zn2+污染打下基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用的细胞系为大连海洋大学细胞工程实验室2013年建立的55~65代松江鲈肾细胞系。细胞系用含有20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养(25℃、5%二氧化碳培养箱)。
实验所用DMEM/F12培养基、胎牛血清(FBS)、胰酶为Hyclone公司产品; 超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶和GSH-Px酶检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.2 方法 1.2.1 染毒实验取处于对数生长期、状态良好的55~65代松江鲈肾细胞系, 以2×105个/mL的密度接种到96孔板上, 接种量为200 μL或同密度接种到细胞培养瓶中, 接种量为5 mL。培养24 h后, 弃去培养基, 再加入5 mL、浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、800 μmol/L的氯化锌(浓度梯度根据预实验结果设置), 每个浓度设3个重复, 在CO2培养箱(5%, 25℃)中培养24 h。
1.2.2 MTT法测定氯化锌对松江鲈肾细胞系成活率的影响染毒24 h后, 向孔中加入40 μL MTT, 继续培养4 h。弃去培养液, 用PBS缓冲液快速冲洗2次, 然后每孔加入150 μL DMSO, 室温震荡15min后, 在酶标仪570 nm波长下测定吸光度值(A)。将处理过的样本中氯化锌浓度为0的一组设为阴性对照组, 没有细胞的孔只加入相同体积的新鲜培养液作为阳性对照组。
细胞存活率=(A试验组–A阳性对照)/(A阴性对照–A阳性对照)
1.2.3 细胞内SOD、GST、GSH-Px酶含量的测定根据1.2.2中计算的细胞存活率及半致死浓度, 重新设置氯化锌浓度为0(对照组), 125, 250, 375, 500 μmol/L, 对细胞染毒24 h后, 用胰酶消化并收集各个实验组细胞, 1500 r/min离心10 min, 将沉淀用PBS重悬后, 在冰浴中用超声波破碎仪破碎细胞(工作3 s, 间隙3 s, 处理10 min), 再将破碎后的细胞悬液于3 000 r/min, 4℃离心10 min, 分别离心取上清液进行酶活性测定。利用南京建成生物工程研究所生产的检测试剂盒得到松江鲈肾细胞SOD酶、GST酶以及GSH-Px酶活性变化情况。
1.2.4 细胞微核率的测定根据1.2.2中计算的细胞存活率及半致死浓度, 重新设置氯化锌浓度为0(对照组), 125, 250, 375, 500 μmol/L, 收集各个实验组染毒后的细胞, 离心, 去除上清, 加入0.5 mL PBS重悬细胞, 滴于干净的载玻片上, 用干净的玻璃棒迅速从一端刮向另一端, 空气干燥, 甲醇固定10 min, 用磷酸缓冲液稀释Giemsa染液(9︰1)染色5 min, 蒸馏水冲洗, 晾干, 置于显微摄影仪下观察拍照。每个玻片计数1 000个细胞。
彗星实验方法参考梁亚芳等[12]报道的方法并做了细微调整。取预热的磨砂载玻片浸入0.7%的正常熔点琼脂糖(NMPA)1 min, 4℃固化过夜, 制成第一层胶。将对照组、氯化锌半致死浓度组的细胞悬液分别以1︰7的体积比与37℃低熔点琼脂糖(LMPA)混合, 取100 μL加到第一层胶上, 盖上盖玻片, 再置4℃固化10 min。取下盖玻片后, 将载玻片浸于新鲜配制的冰冷裂解液中, 避光低温裂解1 h。载玻片蒸馏水充分清洗后, 置于电泳液中低温避光解旋30 min。22 V, 200 mA条件下低温避光电泳30 min。之后取出载玻片, 用蒸馏水漂洗3次, 观察时滴加25μL 20 μg/mL的溴化乙啶, 盖上盖玻片, 在荧光显微镜下观察拍照, 计算细胞的拖尾率和平均尾长。
应用SPSS Statitics V17.0软件对数据进行统计分析。结果用平均值±标准差表示, 差异显著性用t检验分析(P < 0.05)。
2 结果 2.1 氯化锌对松江鲈肾细胞系存活率的影响以不同浓度的氯化锌处理松江鲈肾细胞系24 h后, 其存活率如图 1所示。随着氯化锌浓度的增加, 其存活率逐渐降低, 且存在着明显的浓度依赖性。存活率与浓度的自然对数之间为良好的线性关系, 其回归方程为:y =–0.4163lnx + 2.886 r2 = 0.9701。根据剂量-效应回归方程可知细胞的半致死浓度为308.41 μmol/L。
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图 1 氯化锌对松江鲈肾细胞系存活率的影响 Fig. 1 Effects of zinc chloride on Trachidermus fasciatus cell viability |
不同浓度的氯化锌处理松江鲈肾细胞系的SOD酶活性的变化如图 2所示。氯化锌处理24 h后, 细胞系SOD酶的活性在氯化锌浓度为0~250 μmol/L时, 随浓度的升高逐渐升高, 250 μmol/L氯化锌浓度组SOD活性最高, 和对照组比较差异显著(P < 0.05), 随后则逐渐降低。
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图 2 不同浓度氯化锌对松江鲈肾细胞系SOD活力的影响 Fig. 2 Effects of different concentrations of zinc chloride on the SOD activity of renal cells |
不同浓度氯化锌处理松江鲈肾细胞系的GST酶活性的变化如图 3所示。氯化锌处理24 h后, 细胞系GST酶的活性在氯化锌浓度为0~250 μmol/L范围內, 随浓度的升高逐渐升高, 在250 μmol/L浓度时GST活性显著增加(P < 0.05), 达到最大值, 随后则逐渐降低。
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图 3 不同浓度氯化锌对松江鲈肾细胞系GST活力的影响 Fig. 3 Effects of different concentrations of zinc chloride on the GST activity of renal cells |
不同浓度氯化锌处理松江鲈肾细胞系的GST-Px活性的变化如图 4所示。氯化锌处理24 h后, 细胞系GST-Px酶的活力在氯化锌125 μmol/L浓度组时达到最高, 在氯化锌浓度到达250 μmol/L时有明显的下降, 当到达375 μmol/L时显著下降(P < 0.05)之后一直维持在一个较低水平。
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图 4 不同浓度氯化锌对松江鲈肾细胞系GSH-Px活力的影响 Fig. 4 Effects of different concentrations of zinc chloride on the GSH-Px activity of renal cells |
试验中发现, 经不同浓度的氯化锌处理后, 细胞系内均发现微核。微核位于细胞质中, 呈圆形, 边缘光滑, 与细胞核染色一致(图 5)。由表 1可见, 在所设定的浓度范围内, 微核率随氯化锌的浓度的增加而增加。
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图 5 正常细胞(A)和氯化锌(B)处理后松江鲈肾细胞核的形态 Fig. 5 The nuclear morphology of T.fasciatus treated with PBS (A) and zinc chloride (B). 箭头所示为微核 arrow shows the micronucleus |
浓度/(μmol/L) | 微核率/‰ |
0 | 6.33 |
125 | 7.33 |
250 | 9.67 |
375 | 10.33 |
500 | 12.33 |
用308.41 μmol/L(24 h-半致死浓度)的氯化锌处理24 h后得到的细胞即为实验组细胞。由彗星实验结果分析发现, 对照组的细胞核多数为圆形, 拖尾的极少(图 6-A), 细胞拖尾率为10.00%, DNA迁移长度为5.36 μm±1.78 μm; 实验组(图 6-B)的细胞核出现拖尾现象, 氯化锌组细胞拖尾率为48.00%, DNA迁移长度为15.03 μm±2.51 μm。与对照组比较, 有显著差异(P < 0.05)。
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图 6 ZnCl2处理细胞24 h后DNA损伤观察 Fig. 6 Effect of zinc chloride on DNA damage A.对照; B.ZnCl2 A.control; B.ZnCl2 treated for 24 h |
利用不同浓度的氯化锌处理松江鲈肾细胞24 h后, MTT法分析ZnCl2对细胞系的毒性效应, 结果显示100 μmol/L ZnCl2即对松江鲈肾细胞系表现出细胞毒性和生长抑制作用, 对细胞的24 h半致死浓度为308.41 μmol/L。谭凤霞[11]研究了ZnCl2对EPC的毒性作用, 发现细胞死亡率随着ZnCl2浓度的增加而增加, 24 h的LC50为35 μmol/L, 其变化规律与本研究结果一致, 但半致死量要低于松江鲈细胞, 这可能与不同细胞系间的差异有关。
3.2 氯化锌对细胞酶活力的影响氯化锌作用于松江鲈肾细胞后, 产生了一定的毒性作用, 并引起了细胞内SOD、GST和GSH-Px酶活性的显著变化。SOD是一种重要的抗氧化酶, 目前, 抗氧化防御系统的变化作为污染物胁迫的生物标志物已成为环境科学领域的研究热点[13]。实验结果表明, SOD酶活性均随着ZnCl2浓度的升高而出现先上升后下降的趋势, 表明适量的补充ZnCl2可以使SOD活力增加。这与锌对黄颡鱼[1]及锦鲤组织[14]SOD的结论相似。GSH-PX是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶, 通过保护细胞膜的结构与功能使得细胞不受氧化物的损害, Zn2+对EPC的GSH-Px活性的影响[15]与本实验结果相似。实验结果中, 细胞系GSH-Px在氯化锌浓度为100 μmol/L时达到最大值, 说明低浓度的Zn2+可以刺激细胞产生GSH-Px进行自我保护; GST可以催化谷胱甘肽(GSH)与脂溶性物质的甲基结合, 谷胱甘肽与其结合后, 可防止外源性的化合物损伤细胞[16-18]。刘慧等[19]研究了Zn2+对鲫鱼(Carassius auratus)肝脏GST活性的影响, 发现鲫鱼肝脏GST活性随着Zn2+浓度的升高而呈现先上升后下降的趋势。三种抗氧化酶在低浓度氯化锌刺激下呈现活力上升的现象, 说明氯化锌导致细胞产生了较多的氧自由基, 并激活了松江鲈细胞的免疫保护系统用以清除这些自由基; 而高浓度的氯化锌刺激下, 过多的氧自由基可能破坏了细胞内各种膜结构, 从而三种酶类活性明显下降, 细胞失去免疫保护能力。同时, 这种双相剂量效应关系符合毒物兴奋效应模型, 可以看做一种能在预防、修复、信号转导等广泛的范围内介导细胞应激的适应性反应[20]。
3.3 ZnCl2对细胞DNA损伤的影响本实验从微核实验和彗星实验两个方面研究了ZnCl2对松江鲈肾细胞系的DNA损伤。微核试验是遗传毒理学常用的试验方法之一, 可以检测染色体断裂和染色体丢失等方面细胞受到DNA损伤的程度[21-22]。由表 1可以看出, 松江鲈肾细胞微核率随ZnCl2浓度的增加而增加, 表明ZnCl2对松江鲈肾细胞具有遗传毒性。
彗星试验(Comet assay), 又称单细胞凝胶电泳SCGE (Single cell gel electrophoresis), 是一种在单细胞水平上通过测定细胞的拖尾率和迁移长度来检测DNA微损伤的方法[23]。细胞在308.41 μmol/L(24 h-半致死浓度)的氯化锌处理24 h后的拖尾率为48.00%, 表明ZnCl2能够引起细胞的DNA断裂, 这与张迎梅等研究的Zn2+对泥鳅DNA具有损伤作用的结论相似。
4 结论本研究采用松江鲈肾细胞系, 检测了氯化锌对松江鲈细胞的生物学毒性和遗传毒性, 发现氯化锌可导致细胞中一系列抗氧化酶活力呈现规律的剂量-效应关系, 符合毒物兴奋效应模型[23, 24]; 同时, 氯化锌可以引起细胞出现微核和DNA断裂现象, 呈现出一定程度的遗传损伤。
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