2018, Vol. 42
文章信息
- 张毅然, 高伟, 张佳林, 徐广飞, 林法祥, 徐希媛, 何昌飞, 韩彬, 郑立. 2018.
- ZHANG Yi-ran, GAO Wei, ZHANG Jia-lin, XU Guang-fei, LIN Fa-xiang, XU Xi-yuan, HE Chang-fei, HAN Bin, ZHENG Li. 2018.
- 北戴河滨海湿地根际石油降解菌的筛选及功能分析
- Isolation and functional evaluation of oil degrading bacteria in the rhizosphere of Beidaihe coastal wetlands
- 海洋科学, 42(7): 105-113
- Marina Sciences, 42(7): 105-113.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20171130001
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文章历史
- 收稿日期：2018-01-11
- 修回日期：2018-03-06
2. 中国海洋大学 海洋生命学院, 山东 青岛 266003;
3. 秦皇岛市海洋和渔业局, 河北 秦皇岛 066000;
4. 金正大生态工程集团股份有限公司, 山东 临沭 276700;
5. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266071
2. College of Marine life, Ocean University of China, Qingdao 266003, China;
3. Qinhuangdao Municipal Ocean and Fisheries Administration, Qinghuangdao 066000, China;
4. Kingenta Ecological Engineering Group Co. Ltd, Linshu 276700, China;
5. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China
湿地生态系统被称为“地球之肾”和“物种的基因库”, 是地球上生产力最高的生态系统之一[1]。滨海湿地由于环境资源优越, 人类开发利用的程度较高, 导致了滨海湿地的生态退化[2]。而且滨海湿地处于海洋与陆地的交汇地带, 其生态特征不仅受到陆地环境的制约, 还受到海洋环境的影响, 既受到自然因素的控制, 又受到人类活动的干扰, 这使得滨海湿地非常脆弱, 受到破环的恢复难度较大[3]。近年来, 石油工业飞速发展, 石油污染引起的湿地生态破坏日益严重[4]。蓬莱19-3油田溢油事故, 对整个渤海湾的海洋环境和海岸带环境都造成了极大的破坏[5]。传统的物理法和化学法虽然可去除湿地土壤中大部分的有机污染物, 但同时也破坏了土壤结构组分, 造成二次污染, 而且成本高昂实施困难[6]。而生物处理方法具有环保、高效、低成本等众多优点[7]。生物修复对生态环境的破坏作用小, 这对脆弱的滨海湿地生态系统的污染修复来说是尤为重要[8]。
位于河北秦皇岛地区的北戴河新河口滨海湿地, 是北方典型的碱蓬-芦苇湿地, 但随着人类开发活动影响区域的日益扩大, 尤其是沿岸海域内的海洋溢油, 河口区排放污染增加等, 区域内各类湿地受到不同程度的干扰和破坏。有研究证明, 植物根际微生物对石油污染的降解起到重要作用, 且根际微生物的数量明显高于植被未覆盖区[9]。有报道表明, 许多根际微生物可以产生表面活性剂, 能够促进难溶有机化合物(HOCs)的增溶, 提高其生物有效性[10], 从而促进环境中石油降解菌对石油污染物的利用率。目前对于滨海湿地根际石油降解菌的研究多来自于南方红树林滨海湿地, 缺乏对北方滨海湿地, 尤其是典型的碱蓬-芦苇湿地根际石油降解菌的群落结构及功能分析的研究。笔者从受到蓬莱19-3油田溢油事故影响的北戴河新河口滨海湿地采得了5份根际土壤样品, 从中筛选出以原油作为唯一碳源和能源的石油降解菌, 研究此湿地类型的石油降解菌的群落结构, 分析其石油降解功能, 并筛选出具有一定应用价值的土著菌株。该工作对于利用根际微生物进行石油污染生物修复工作具有科学指导意义和实际应用价值。
1 试验材料与方法 1.1 植物根际土壤样品本次实验所用的根际土壤(沉积物)样品, 采自秦皇岛北戴河滨海湿地。北戴河区位于河北省的东北部, 渤海湾北岸的中部[11]。该湿地在新河河口区, 为碱蓬-芦苇湿地, 候鸟的栖息地。采集位点与现场环境如图 1所示。根际土壤样品盐度的测定方法参照此研究[12], 石油烃浓度测定方法参照标准GB 17378.5-2007海洋监测规范[13]。
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| 图 1 样品采集位点与湿地航拍图 Fig. 1 Sample collection site and wetland aerial photograph |
ONR7a培养基[14]:一种模拟天然海水的培养基, 主要用于石油培养基配制。主要成分如下:每L含22.79 g NaCl、11.18 g MgCl2·6H2O、3.98 g Na2SO4、1.46 g CaCl2·2H2O、1.30 g TAPSO、0.72 g KCl, 灭菌前添加2 mL溶液Ⅰ, 使用时按浓度比例添加经过相应处理的溶液Ⅱ和溶液Ⅲ。溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ为海水中微量元素浓缩液, 具体成分参照此研究[14]。
海水石油培养基[15]: 100mL ONR7a培养基中添加1g原油(1%)。研究中所使用原油为渤海重质原油, 其饱和烃含量为20.6%, 芳香烃含量为32.4%, 胶质和沥青含量为47.0%, SARA组分测定方法参照此研究[16]。
M8培养基[17]:研究中主要用于石油降解菌株活化及扩大培养, 主要成分如下:在ONR7a培养基基础上, 每L添加2 g乙酸钠, 0.5 g蛋白胨, 0.5 g酵母提取物, 0.5 g马铃薯浸出粉, 0.2g葡萄糖, 0.2g蔗糖, 0.05g苹果酸钠, 0.05 g柠檬酸三钠, 0.05 g酒石酸钾钠。
参考于研究[18], 产表面活性剂培养基:在M8液体培养基的基础上, 对碳源和氮源进行一定改变:提高葡萄糖的含量, 以提供充足的碳源, 加入少量尿素提供更充足的氮源。并添加10%水不溶性长链烷烃液体石蜡作为产表面活性剂刺激物。
1.3 根际石油降解菌的富集与分离参考研究中处理方法[19], 首先制备根际土壤悬液:从植物根2cm的范围内各取土壤1g放入100mL灭菌锥形瓶中加入50mL的无菌海水, 震荡20min。将上层悬液接种于100mL石油培养基中。培养2周后, 于石油培养基中转接两次, 将有明显石油降解现象的富集培养物梯度稀释后涂布于M8平板, 待菌落长出后, 挑取不同形态的单菌落, 并划线纯化, 分离单菌并保存。
1.4 分子生物学鉴定与系统发育树的建立使用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取石油降解菌的基因组DNA, 使用16S rRNA基因通用引物[20]PCR扩增其16S rRNA基因序列。将获得的纯化产物送至擎科青岛公司测序, 并使用NCBI中的Nucleotide-BLAST工具进行序列比对。选取与所筛菌株亲缘关系较近菌株与菌株16S rRNA基因测序数据经MEGA7.0软件进行多重序列比对和系统发育树构建。序列使用Clustal w算法进行多重序列比对, 后用软件中的邻接法(Neighbour-joining Method, NJ)建树, 并通过自举分析进行置信度检测, 自举数为1000。
1.5 石油降解菌的石油降解特性分析将分离纯化的单菌挑入M8液体培养基中, 培养至对数生长后期, 按3%的接种量转入100 mL石油培养基, 以不接种细菌的石油培养基为阴性对照(NC), 在25℃、150 r/min的培养条件下培养21d, 上述每种处理均设3个平行。
将降解后的石油培养液及阴性对照在10000r/min的条件下离心10 min去除细菌细胞, 准确量取50mL二氯甲烷萃取其中的残余油污。从二氯甲烷相吸取20mL萃取液转移到尖底烧瓶中, 40℃减压浓缩并称重, 按公式(1)测定其石油降解率。
| $ 111 = \frac{{{m_0} - 2.5m}}{{{m_0}}} \times 100\% $ | (1) |
式中, m为烧瓶中残余油污量, m0为最初加入培养基中的石油质量(g)。
此外, 另从CH2Cl2相准确量取2mL溶液, 用无水Na2SO4脱水, 过0.22μm耐有机溶剂滤膜。氮气吹干, 以1mL二氯甲烷重新溶解, 加入内标氘代三联苯和氘代正二十四烷, 用GC-MS对石油降解后残留的烷烃、芳香烃组分进行分析测定[21]
1.6 表面活性剂菌株的鉴定采用排油圈法[22]测定菌株产表面活性剂能力:取1mL液体石蜡于2mL离心管中, 加入0.1g苏丹Ⅲ染料, 彻底溶解至无颗粒状染料。在直径90mm的玻璃培养皿中加入20mL蒸馏水, 然后在液面中心滴加100μL已加入染料的液体石蜡, 室温静置20min, 待液体石蜡均匀分布于水面中央, 形成直径大于30mm的油膜后, 在石蜡中心缓缓滴加50μL发酵液, 观察发酵液能否把油膜挤向培养皿壁, 在油膜中心形成排油圈。若产生排油圈, 测量发酵液中排油圈的大小。以不接菌的发酵培养基作为阴性对照。
2 结果 2.1 采集样品信息采集样品信息如表 1所示, qhd1、qhd2、qhdN、qhdB3为碱蓬根际样品, qhd3为芦苇根际的样品。样品的盐度较高, 因此在研究中使用了盐度较高的海水石油培养基富集培养石油降解菌。5份样品均属于植被覆盖区, 样品的的石油烃含量均低于湿地平均水平。
| 样品号 | 样品类别 | 盐度/ (g/kg) |
石油烃含量/ (mg/kg) |
| qhd1 | 碱蓬根际土壤 | 20 | 9.61 |
| qhd2 | 碱蓬根际土壤 | 19 | 9.80 |
| qhd3 | 芦苇根际土壤 | 14 | 9.90 |
| qhdB3 | 碱蓬根际土壤 | 30 | 9.74 |
| qhdN | 碱蓬根际土壤 | 16 | 10.91 |
| CK | 无植被区平均值 | 22 | 100.52 |
将富集分离的22株石油降解菌的16S rRNA基因序列经过Nucleotide-BLAST工具比对后, 并与GenBank数据库中相似菌株16S rRNA基因序列绘制系统发育树。鉴定与分析结果如图 2所示, 经筛选所获得22株石油降解菌, 其中, 19株与GenBank中已知的16S rRNA基因序列有较高的同源性, 相似性在99%以上。菌株qhd1B和qhdB3B与相似菌株Luteibacter yeojuensis strain R2A16-10的相似度仅为96%, 菌株qhdNC与相似菌株Defluviimonas indica strain 20V17的相似度为98%, 可能为新种。所分离获得的22株菌中, 8株菌(qhd1A、qhd2A、qhd2B、qhd3D、qhdB3A、qhdB3E、qhdNA), 属于放线菌门(Actinobacteria); 13株菌(qhd1B、qhd2C、qhd2D、qhd3A、qhd3B、qhd3C、qhdB3B、qhdB3C、qhdB3D、qhdNC、qhdND、qhdNE、qhdNF)属于变形菌门(Proteobacteria); 有一株(qhdB3H)拟杆菌门(Bacteroidetes)丽水菌属(Yeosuana)。此次分离到的22株菌分属于细菌域的3个门, 18个属, 菌株多样性丰富。
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| 图 2 基于16S rRNA基因序列的菌株系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic analysis based on the 16S rRNA gene sequences n%表示与Genebank中模式菌株相似度的百分数 n% represents the percentage of similarity to the model strain in Genebank |
初筛共获得22株以原油为唯一碳源的石油降解菌。其中有5株菌(编号为qhd2B、qhdB3C、qhdNA、qhd2D、qhd1A)有相对较强的石油乳化能力和降解能力, 能使石油-水形成均一的乳浊液。如图 3, 降解21d后, 5株菌石油降解率为31%~38%, 其中菌株qhd2B对石油的降解效率最高, 达到了38%, 而且对油污的乳化能力很强。其余17株石油降解菌的石油降解率为17%~30%。
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| 图 3 重量法测定石油降解菌的石油降解率 Fig. 3 The degradation rates of oil by weighting method |
利用排油圈法, 测定了表面活性剂产生效率。如表 2所示, 而共有8株石油降解菌, qhd1A、qhd2B、qhd2D、qhd3D、qhdB3C、qhdB3E、qhdNA、qhdNC产生了较大的排油圈, 直径为25~75mm, 显示了其具有较好的表面活性剂产生能力。其中qhdNA菌株的排油圈最大, 直径为75mm。这8株菌包含了在石油降解实验中产生明显乳化现象的菌株, 具有较好的相关性。
| 菌株 | 排油圈直径/mm | 发生乳化现象(是/否) |
| qhd1A | 73 | 是 |
| qhd1B | 5 | 否 |
| qhd2A | 5 | 否 |
| qhd2B | 43 | 是 |
| qhd2C | 5 | 否 |
| qhd2D | 33 | 是 |
| qhd2E | 8 | 否 |
| qhd3A | 13 | 否 |
| qhd3B | 8 | 否 |
| qhd3C | 5 | 否 |
| qhd3D | 33 | 是 |
| qhdB3A | 5 | 否 |
| qhdB3B | 5 | 否 |
| qhdB3C | 18 | 是 |
| qhdB3D | 5 | 否 |
| qhdB3E | 65 | 否 |
| qhdB3H | 8 | 否 |
| qhdNA | 75 | 是 |
| qhdNC | 25 | 否 |
| qhdND | 5 | 否 |
| qhdNE | 5 | 否 |
| qhdNF | 5 | 否 |
| 阴性对照 | 5 | - |
如图 4, 通过比较对照组和5株降解菌对正构烷烃的降解效率, 这5株菌都有较高的烷烃降解能力, 对总烷烃的降解率均高于40%。其中, 菌株qhd2B对总烷烃的降解率最大, 达到了79%。如图 5所示, 5株降解菌能降解大部分的烷烃, 对C21~C29的中链烷烃的降解效果最好, 对C30以上的长链烷烃降解能力较差。菌株qhd2B对中链烷烃C15~C29的正构烷烃具有较高的降解能力, 降解率大于60%。qhdB3C降解短链烷烃(C15~C19)能力小于qhd2B, 但对中长链烷烃(C20~C31)要优于qhd2B, 是一株优良的烷烃降解菌。菌株qhdB3C和qhd1A对中链烷烃C21~C29也有很好的降解能力, 对短链和长链烷烃降解效果较差。
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| 图 4 石油降解菌的总烷烃降解率 Fig. 4 The total degradation rate of alkanes by the screened strains |
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| 图 5 降解后石油中的烷烃含量 Fig. 5 The concentrations of alkanes after biodegradation by the 6 strains n-Cm: m碳正构烷烃, 如n-C16为十六碳正构烷烃; Pr为姥鲛烷, Ph为植烷 n-Cm: alkane with m carbon atom, for instance, n-C16 is alkane with 16 carbon atom; "PR" is pristine, "pH" is phytane |
如图 6, 通过比较对照组和实验组中残余多环芳烃的含量, qhd2B和qhd1A的多环芳烃降解率较高, 分别为75.7%和56.4%; qhdB3C、qhd2D和qhdNA的多环芳烃降解率为35.1%~47.6%;如图 7, 菌株qhd2B对所检测所有多环芳烃均有较高的降解效果, 降解率在45%以上, 尤其是对䓛和二苯并噻吩降解效果最好, 并且对高分子量的多环芳烃仍保持着较高的降解效果。菌株qhd1A除对含量较低的芴和C4-菲的降解效率一般, 对其余多环芳烃也有较高的降解作用, 而且对部分高分子量的多环芳烃也保持着较好的降解效果。菌株qhdNA对总多环芳烃的降解效率较高, 但其降解作用主要为对低分子量的萘系物的降解, 对其它多环芳烃降解能力一般。
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| 图 6 石油降解菌的总PAHs降解率 Fig. 6 The total degradation rates of the PAHs by the screened strains |
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| 图 7 降解后石油中多环芳烃的含量 Fig. 7 The concentrations of PAHs after the biodegradation by the 5 strains C0-NAP、C0-FLU、C0-DBT、C0-PHE分别为萘、芴、二苯并噻吩、菲; C1(C2, C3, C4)-萘表示在相应碳原子上(1~4)修饰有烷基; C1(C2, C3)-芴表示在相应碳原子上(1~3)修饰有烷基; C1(C2, C3)-二苯并噻吩表示在相应碳原子上(1~3)修饰有烷基; C1(C2, C3, C4)-菲表示在相应碳原子上(1~4)修饰有烷基 C0-NAP, C0-FLU, C0-DBT and C0-PHE represent for naphthalene, fluorene, dibenzothiophene, phenanthrene, respectively. C1(C2, C3, C4)-N, alkylated naphthalene with straight-chain of 1-4 carbon atoms; C1(C2, C3)-F, alkylated fluorene with straight-chain of 1~3 carbon atoms; C1(C2, C3)-D, alkylated dibenantherene with straight- chain of 1~3 carbon atoms; C1(C2, C3, C4)-P, alkylated phenanthrene with straight-chain of 1~4 carbon atoms |
近年来, 滨海湿地由于无序开发和排污, 遭到很大破坏, 其中石油污染问题尤为严重, 近些年, 有大量研究充分证明了用植物-微生物联合修复技术能有效降解土壤中的有机污染物[23-24]。本研究也在北方典型的碱蓬-芦苇滨海湿地根际土壤中筛选出22株石油降解菌, 该结果相比于Victor Lamin[25]对南方红树林滨海湿地石油降解菌的筛选分离, 所筛选的石油降解菌种类更加丰富, 而且菌群差异化明显。
这22株石油降解菌属于3个门, 18个属, 多样性较为丰富。所分离的石油降解菌, 主要属于放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)。其中, qhdB3H是一株拟杆菌门(Bacteroidetes)丽水菌属(Yeosuana), 丽水菌属已被被报道有石油降解特性[26]。分离自碱蓬根际的菌株qhd1B和qhdB3B与Luteibacter yeojuensis strain R2A16-10的相似度仅为96%, 研究表明, 分离自大麦根际中Luteibacter属的菌株对大麦的生长起到了促进作用[27~28], 有的Luteibacter属的菌株具有分泌脂肪酶的功能[29], 可以对石油进行生物降解, 作者认为qhd1B和qhdB3B对碱蓬的生长和石油降解可能具有重要作用。菌株qhdNC与相似菌株Defluviimonas indica strain 20V17的相似度为98%, 相似菌株是在西南印度洋的深海热液喷口环境分离出的[30], 与qhdNC的生境差异显著, 可能为一株新种, 需要作进一步的鉴定。而在新疆油田分离出的Defluviimonas属的两株菌, 可以产生脂肪酶和胞外多糖[31-32], 本实验中, 作者也发现qhdNC可以产生表面活性剂, 说明这个属产生胞外多糖类表面活性剂功能的现象可能具有普遍性。与菌株qhdB3D同种的一株Citreicella thiooxidans菌具有将硫代硫酸盐和硫化物氧化成硫酸盐的能力[33], 可能参与了湿地中硫元素的循环。石油降解效果最好的菌株qhd2B可以产生表面活性剂, 研究中[34]发现同种的一株Dietzia maris菌产生的表面活性剂为蜡酯类化合物, 可能与正构烷烃的降解有关, 而且Dietzia属在研究中被广泛验证为对石油具有较好的降解能力[35-36]。qhdB3C为一株食烷菌, 该属能够以直链和支链的烷烃为唯一的碳源和能源, 该属是海洋专性烷烃降解菌[37], 对烷烃的降解效果较好, GC-MS分析验证了其具有较高的烷烃降解率。
研究中, 共发现8株可以产生表面活性剂的菌株, 其中有6株在石油降解实验中表现出了明显的乳化现象。这些生物表面活性剂具有增进脂溶性污染物的生物可利用性的优点[38], 在湿地自我修复中起到了重要作用。研究中, 所筛选的石油降解菌中, 放线菌种类的比例约为36%。其中, 8株可以产生表面活性剂的菌株, 有5株为放线菌。这可能与放线菌可以产生多种胞外分泌物, 并促进自身参与有机物质的分解和异养营养素循环相关。本研究对碱蓬-芦苇滨海湿地采集的根际土壤样品, 进行石油降解菌的筛选与功能分析, 以期了解我国北方典型滨海湿地的根际石油降解菌的种类、分布及功能, 并获取了土著石油降解菌种资源, 为今后进一步的生物修复工程提供科学依据和基础材料。
4 结论(1) 以滨海湿地石油污修复区根际污染土壤为石油降解菌菌源, 经过富集、驯化及纯化, 筛选以石油作为唯一碳源和能源进行生长繁殖的22株石油降解菌, 其中高效率石油降解菌5株(qhd2B、qhdB3C、qhdNA、qhd2D、qhd1A), 具备产生表面活性剂能力的有8株(qhd1A、qhd2B、qhd2D、qhd3D、qhdB3C、qhdB3E、qhdNA、qhdNC)。
(2) 所分离获得的22株菌中, 分别属于3个门, 18个属。其中, 8株菌(qhd1A、qhd2A、qhd2B、qhd2E、qhd3D、qhdB3A、qhdB3E、qhdNA), 属于放线菌门(Actinobacteria); 13株菌(qhd1B、qhd2C、qhd2D、qhd3A、qhd3B、qhd3C、qhdB3B、qhdB3C、qhdB3D、qhdNC、qhdND、qhdNE、qhdNF)属于变形菌门(Proteobacteria); 有1株(qhdB3H)为拟杆菌门(Bacteroidetes)丽水菌属(Yeosuana)。
(3) 通过GC-MS分析石油降解特性, 这5株高效石油降解菌菌对大部分烷烃和芳香烃都有较好的降解效果。菌株qhd2B对烷烃和芳烃的总降解率分别为79.9%和76.7%, 是一株优良的石油降解菌, 这为实际应用提供了基础生物资源。
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