砗磲是现已知的海洋中最大的双壳纲动物, 目前世界范围内共发现有2属13种^[1-4]。砗磲主要分布在印度洋和太平洋的热带和亚热带海区, 在我国分布的砗磲有6种, 其中番红砗磲(Tridacna crocea)是在南海地区发现的数量较多的种类之一, 因其体型较小、较为易于养殖和外套膜颜色鲜艳而成为海水水族观赏动物^{[5, 6]}。

在双壳贝类中, 砗磲以颜色艳丽的外套膜和与虫黄藻共生的特点成为了区别于其他贝类的独特物种, 它的颜色多态性为其与环境融合提供了可能, 这与砗磲的隐态保护密切相关^[7]。有研究发现, 当砗磲外套膜颜色与栖息环境相近时, 其被捕食的几率会明显减小^[8]。砗磲的外套膜颜色除了受自身基因决定外, 还与周边底质颜色、光照等许多环境因素有关^[9]。砗磲外套膜内共生的虫黄藻不仅可为砗磲提供营养, 更对其外套膜颜色产生了一定影响^{[10, 11]}。水生动物表皮色素提取相关研究在鱼类中已有诸多报道(例如金鱼、锦鲤和罗非鱼等)^[12-15]; 然而对于番红砗磲的研究多集中在资源保护、繁殖及与环境相互作用等领域, 尚未见外套膜色素组成的相关报道^[16-18]。

基于此, 本研究拟通过单因素实验优化番红砗磲外套膜色素提取条件, 建立其外套膜色素提取方法, 并利用薄层色谱法对蓝色和红棕色番红砗磲外套膜色素进行分离, 以期探究不同外套膜颜色的番红砗磲色素组成差异, 为砗磲颜色多态性及环境适应机制研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验材料

番红砗磲野生个体采自南海西沙海域。在前期工作基础上, 本实验选取数量较多, 且颜色对比明显的红棕色和蓝色外套膜番红砗磲(壳长79.69 mm± 10.43 mm)进行相关研究。两种颜色的番红砗磲各取5个个体。

1.2 方法 1.2.1 番红砗磲外套膜色素的提取

将番红砗磲外套膜剪碎后, 置于盛有液氮的研钵中匀浆, 再置于真空冷冻干燥机(SCIENTZ-10N型, 宁波新芝生物科技股份有限公司)中冷冻干燥6 h, 温度为–50℃, 密封避光保存于–20℃待用。称取0.0125 g样品粉末, 按一定的料液比加入提取剂, 在恒温水浴锅中孵育一定时间, 提取期间注意避光。8000 r/min离心3 min, 取上清液过滤, 得到色素提取液, 稀释后在分光光度计(752N型, 上海佑科仪器仪表有限公司)上测出最大吸收波长处的吸光度A, 以A值的大小代表砗磲外套膜色素的含量。

1.2.2 番红砗磲外套膜色素提取剂筛选

称取7份0.025 g样品粉末于离心管, 分别加入1 mL丙酮、乙醇、石油醚、乙酸、甲醛、甲酸及纯水作为提取剂(所用化学试剂均为分析纯), 25℃, 24 h浸提, 使用多功能微孔板检测仪(Synergy H1型, BioTek Instruments, Inc.)进行全波长扫描, 对上述溶剂进行初筛。

1.2.3 番红砗磲外套膜色素提取条件优化

采用单因素对比实验, 经前期预实验并参考相关文献^{[14, 19]}设定提取时间、温度、料液比等条件梯度。

1.2.3.1 不同提取时间对番红砗磲色素提取效果的影响

称取0.0125 g样品粉末于离心管, 加入10 mL丙酮或乙醇, 25℃, 浸提8 h, 期间每小时取上清液于462 nm波长测定吸光度, 每组3个平行。

1.2.3.2 不同提取温度对番红砗磲色素提取效果的影响

称取0.0125g样品粉末于离心管, 加入10 mL丙酮或乙醇, 分别于15、20、25、30、35、40℃条件下浸提4 h, 取2 mL上清液稀释至4 mL于462 nm波长测定吸光度, 每组3个平行。

1.2.3.3 不同料液比对番红砗磲色素提取效果的影响

称取适量样品粉末于离心管, 加入适量丙酮使料液比分别为1：5、1：10、1：20、1：40、1：80、1：100、1：200或加入适量乙醇使料液比分别为1：100、1：150、1：200、1：400、1：600、1：800, 25℃, 浸提, 4 h, 取全部浸提液过滤后稀释至10 mL, 波长为462 nm测定吸光度, 每组3个平行。

1.2.4 不同颜色番红砗磲外套膜色素组成分析

称取1个蓝色和1个红棕色系砗磲的外套膜粉末各0.0250 g, 分别加入0.5 mL丙酮在25℃避光条件下浸提4 h, 25℃、4000 r/min离心5 min, 吸取上清液进行色素分离。用毛细玻璃管(吸取色素溶液约200 μL)在硅胶薄层板上点样, 每次1板, 以上点样操作重复3次。然后分别将点好样的薄层板放入盛有25 mL展层剂(氯仿：甲醇：石油醚=3：1：6)的封闭层析缸中层析15 min。用佳能扫描仪(CanoScan 9000F MarkⅡ)记录层析结果, 计算各色素组分Rf值。每个颜色组重复3次, 每次样品来源于1个不同砗磲个体。

1.3 数据处理与分析

各实验数据均表示为平均值±标准差(Mean±SD), 所有数据采用Microsoft Excel 2016和SPSS 17.0软件进行处理。

2 结果与分析 2.1 番红砗磲外套膜总色素提取溶剂筛选

从图 1中可以看出, 经24 h溶解后, 溶剂为丙酮、乙醇组砗磲外套膜粉末沉淀变为无色, 色素几乎全部溶于溶剂; 在石油醚、乙酸、甲醛和水作为溶剂组中, 仅部分色素溶于溶剂; 当甲酸作为溶剂时, 样品全部发生溶解, 无法作为色素提取剂。综上, 通过观察提取剂和底部杂质颜色深浅初步判断丙酮和乙醇为适宜的番红砗磲外套膜色素提取剂。

取上述提取液使用Synergy H1型多功能微孔板检测仪在波长300~1000 nm进行扫描, 得到的最大吸收峰处波长(nm)和其吸光值(图 2, 表 1)。由表 1可知, 石油醚、甲醛、纯水提取物没有明显吸收峰, 乙酸提取物的最高峰值显著小于丙酮和乙醇。

2.2 番红砗磲外套膜色素提取最优条件

丙酮作为提取剂时, 提取剂提取色素的效果均随时间的增加而提高, 但均呈现先快速提高后缓慢提高的规律。为了加快色素提取的效率和防止色素氧化降解, 选择4 h作为色素的最佳提取时间(图 3A); 提取剂中色素浓度随温度的升高呈先升高后下降趋势, 最佳提取温度为25℃(图 3C); 随着料液比中提取剂的比重的增加, 吸光度先升高, 后在一定范围内保持相对平稳, 所以1：40为最佳料液比(图 3E)。

乙醇作为提取剂时, 色素提取规律与丙酮作为提取剂时类似, 4 h是色素的最佳提取时间(图 3B); 最佳提取温度为30℃(图 3D); 最佳料液比为1：200 (图 3E)。

2.3 不同颜色番红砗磲外套膜色素薄层层析分析

番红砗磲外套膜色素薄层层析色谱结果显示(图 4), 蓝色个体有9个条带, 红棕色番红砗磲有10个条带, 即蓝色系番红砗磲外套膜由9种色素组分构成, 红棕色番红砗磲外套膜由10种色素组分构成。进一步比较发现, 蓝色番红砗磲比棕红色个体缺少第五条带(Rf 0.30)。此外, 蓝色个体的第2条带亮度明显高于红棕色个体, 第3条带亮度稍低于红棕色个体。

3 讨论 3.1 提取条件对番红砗磲外套膜色素提取效果的影响

提取剂提取色素的原理是渗透细胞内部溶解色素, 但细胞基质中存在各种物理和化学特性阻碍了色素提取过程中色素转移, 因此不同物种色素的最佳提取剂有所不同^[20-22]。醇类溶剂甲醇和乙醇对藻类叶绿素a的提取效果要优于丙酮和丙酮与二甲基亚砜的混合溶剂^[23]。在本研究中, 乙醇对番红砗磲外套膜色素的提取效果略优于丙酮, 可能原因是砗磲外套膜共生虫黄藻体色素是其外套膜色素的重要组成部分, 而叶绿素a是虫黄藻的主要色素种类。

有机溶剂提取色素的能力与色素的化学结构有关, 化学结构对应的极性大小决定了其在不同极性的有机溶剂中的溶解度。虾夷扇贝闭壳肌中的类胡萝卜素在极性较小的有机溶剂中溶剂效果较好, 且最佳提取剂为丙酮^[19]。本研究表明丙酮是番红砗磲外套膜色素提取的优良提取剂, 说明番红砗磲可能含有与虾夷扇贝结构相同或相似的类胡萝卜素。

有很多色素如类胡萝卜素中的一些色素稳定性较差, 高温、光照和空气中长时间暴露均有可能导致其吸光度降低^[17]。高温可造成类胡萝卜素结构改变而形成顺式异构体, 而光照和氧气共同作用会促使其中C-C双键的断裂使色素分解^[24-25]。类胡萝卜素对酸也体现了不稳定性^[26]。本研究中, 提取条件也遵循了时间尽量短、温度尽量低的原则, 以避免外界因素对色素的破坏。

3.2 番红砗磲外套膜色素组分

砗磲外套膜颜色是由外套膜管状系统中共生虫黄藻及外套膜自身组织中的颜色共同决定, 因此番红砗磲外套膜总色素应包括共生虫黄藻所含色素种类和外套膜内自身的色素两部分。从化学结构分类, 藻类中存在的光合色素主要有三大类:叶绿素类、类胡萝卜素类和藻胆色素类^[27], 据报道, 以上的三大类藻类光合色素在虫黄藻属的叶绿体中均有发现^[28]。已报道的存在于水产动物表皮和肌肉组织的色素包括类胡萝卜素、黑色素、胆汁色素、α-萘醌系色素、蝶啶系色素等^[15]。番红砗磲外套膜色素在312~690 nm之间均有吸光值, 并且在333、452、582、630和665 nm处有明显吸收峰, 这种吸光范围较广、吸收峰数量较多的现象表明番红砗磲外套膜色素组分复杂, 应包含多种类型的色素^[29]。

薄层层析色谱的结果显示蓝色和红棕色番红砗磲外套膜第二条带(蓝色)亮度有差异, 说明该种色素与外套膜是否呈现蓝色有密切关系。此外, 与红棕色番红砗磲相比, 蓝色个体在第六条(Rf值为0.30)黄色条带明显缺失, 这亦是导致两种颜色砗磲差异的原因。

4 结论

本研究筛选出丙酮和乙醇两种适宜的番红砗磲外套膜色素提取剂, 优化了两种提取剂的提取条件。选用丙酮作为提取剂时, 浸提时间为4 h, 提取温度为25℃, 料液比为1：40;选用乙醇作为提取剂时, 浸提时间为4 h, 提取温度为30℃, 料液比为1：200;利用薄层色谱法对蓝色和红棕色番红砗磲外套膜色素比较分析发现, 蓝色番红砗磲外套膜色素由9种色素组分构成, 红棕色个体番红砗磲外套膜色素由10种色素组分构成。