2019, Vol. 43
文章信息
- 于士翔, 纪元, 李新, 刘峰, 刘芳华. 2019.
- YU Shi-xiang, JI Yuan, LI Xin, LIU Feng, LIU Fang-hua. 2019.
- 一株单环刺螠致病弧菌的分离鉴定、生长特性研究及药敏分析
- Isolation, identification, characterization, and sensitivity analysis of gut pathogenic Vibrio of Urechis unicinctus
- 海洋科学, 43(7): 112-121
- Marine Sciences, 43(7): 112-121.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190123001
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文章历史
- 收稿日期：2019-01-23
- 修回日期：2019-03-28
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 中国农业大学烟台研究院, 山东 烟台 264670
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Yantai Research Institute, China Agricultural University, Yantai 264670, China
单环刺螠(Urechis unicinctus)俗称海肠、海肠子[1], 隶属于螠虫动物门(Echiuroidea), 是中国黄渤海沿岸潮间带[2]和潮下带常见的底栖生物[3]。单环刺螠具有很高的食用价值[4]及药用价值[5]。近几年来, 随着海洋环境的污染[6], 造成单环刺螠的捕捞量大幅度下降[7], 在烟台市的价格曾经增长至海参价格的三至四倍, 因而, 单环刺螠急需大规模人工养殖[8], 但目前未见对单环刺螠幼体疾病的研究[9]。随着对肠道微生物的探索不断地深入[10], 肠道微生物对宿主健康有着至关重要的影响[11], 甚至可以延长宿主的寿命[12], 而一旦由于外界环境的刺激, 造成肠道内菌群失调[13], 失去原有的平衡, 将会对宿主产生致病性[14], 造成宿主的死亡, 所以, 单环刺螠的人工养殖过程中急需加强对其肠道微生物的探索[15]。本文从患病的幼螠肠道中, 经过平板划线分离得到一株致病菌。对该菌的生长特性研究及药敏试验分析, 旨在为幼螠疾病研究提供病原学理论依据, 同时, 对单环刺螠人工健康养殖具有实际指导意义。
1 材料与方法 1.1 试验材料患病及健康幼螠均采自山东省烟台市东方海洋云溪养殖基地, 规格为3 000~4 000只/kg。其中, 患病幼螠症状为行动迟缓, 从沙底洞穴浮至沙子表面, 全身暗红色。
LB培养基、弧菌生理生化鉴定盒购自广东环凯微生物科技有限公司, 氯霉素、羧苄西林、氧氟沙星、头孢曲松、对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、头孢唑林、四环素、对阿奇霉素、新霉素、万古霉素、利福平、红霉素、克林霉素、阿莫西林16种抗生素药敏纸片购自北京博尔优生物技术有限公司。
1.2 患病幼螠解剖与致病菌分离将患病的幼体单环刺螠体表用无菌水冲洗3遍后, 放置在超净工作台中已经过高温灭菌处理的托盘上, 无菌条件下对单环刺螠进行解剖[16], 分离肠道, 并将适量全长肠道放入1.5 mL离心管中, 加入灭菌的生理盐水并混匀, 后吸取混合液50 μL均匀涂布在LB固体培养基上, 将培养基放置在30℃的温室中恒温培养36 h后, 挑取优势单菌落接种至5 mL LB液体培养基中, 30℃恒温培养24 h, 再进行重复划线分离纯化培养三次后, 挑取单菌落到液体培养基, 制成新鲜菌液, 并将新鲜菌液(对数期)加入体积分数为30%的甘油, 置于–80℃冰箱中保存备用待鉴定[17]。
1.3 菌株的生理、生化鉴定用LB固体培养基培养该微生物, 挑取单菌落制成菌悬液进行革兰氏染色, 置于显微镜下观察; 另外, 将菌悬液制备成0.5McFarland并于标准浊度管比浊, 分别吸取60 μL菌悬液加入弧菌生理生化鉴定中, 并置于37℃恒温培养箱中培养24~48 h, 观察生理生化反应[18]。
1.4 优势菌16S rRNA基因序列分析及系统发育树的构建用灭菌的枪头挑取单个菌落并置于100 μL灭菌水(PCR管装)中, 100℃水浴锅中水浴10 min后, 在离心机中离心3 min, 转速为7200 r/min。取上清作为PCR模板, PCR扩增采用细菌16S rRNA基因通用引物(上海英潍捷基生物公司合成), 正向引物27F; 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′, 反向引物1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′, PCR反应体系(50 μL): 10×EX Taq buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、27F 2 μL、1492R 2 μL、ExTaq 0.25 μL、无菌水34.75 μL。PCR反应条件为: 95℃预变性5 min, 94℃ 1 min, 57℃ 1 min, 72℃ 2 min, 30个循环, 72℃ 10 min。经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后, 将PCR产物送至上海英潍捷基贸易有限公司单端测序, 检测结果为纯菌后补测另一端, 最后将结果进行拼接得到序列。将此序列与GenBank中的核酸序列进行Blast分析, 选取同源性较高的序列, 使用Clustal X 1.83软件进行多重序列比对分析, 并通过MAGA X软件采用邻接法构建系统发育树图。
1.5 人工回染试验分别挑取20只健康幼螠放入6个规格为1 L的烧杯中暂养3天, 随机选择3个烧杯中的幼螠为试验组, 另外3个烧杯中的幼螠为对照组, 并且控制相同的生长条件(温度23℃, 盐度25, pH6.3, 持续充氧)。三天内观察到无病变单环刺螠后, 向试验组的养殖水体中注入适量菌悬液, 将菌悬液浓度调至108 cfu/mL, 使用该养殖水体每天正常养殖并观察记录试验组与对照组发病与死亡情况。
1.6 生长特性分析 1.6.1 生长曲线的绘制取10 μL培养至指数期的新鲜菌液接种于5 mL灭菌的LB培养基中, 设置三个平行, 选用紫外分光光度计600 nm波长进行光电比浊测定, 用未接菌的LB培养基作为空白对照。调节pH为6, 盐度为35测, 量起始OD600平均值放于30℃恒温温室中进行培养。每隔6 h取样一次并测定光密度值, 采用SPSS 25软件包单因素方差分析法(one-way ANOVA)中的Duncan多重比较检验法进行数据分析, 再利用OriginPro 2017软件进行作图。
1.6.2 温度、盐度、pH对生长的影响该部分分为三个实验大组, 分别是温度实验组、盐度实验组、pH实验组, 以此探究温度、盐度、pH对微生物生长的影响。取10 μL培养至指数期的菌液接种于5 mL灭菌的不同处理的LB培养基中, 具体实验条件详见表 1, 每组实验条件设置三个平行。
| 取样量/μL | 温度T/℃ | 盐度S | pH |
| 10 | 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 |
35 | 6 |
| 10 | 30 | 35 | 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7 |
| 10 | 30 | 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 |
6 |
测量每组起始OD600平均值后, 培养24 h后测各个处理下菌液的OD值。数据分析与作图方法同1.6.1。
1.7 药敏试验采用K-B纸片扩散法测定该菌株对16种抗生素药物的敏感性。在超净工作台中, 取50 μL纯菌菌液均匀涂布在LB固体培养基上, 用无菌涂布棒进行涂布后, 将复方新诺明、利福平、氯霉素等16种药敏纸片轻轻贴于培养基上, 每个平板分四个区域贴四种药敏纸片, 并作3组平行, 放置于30℃恒温温室中培养24 h后, 观察抑菌圈的产生情况并测量抑菌圈直径, 根据美国临床实验室标准化研究所的抗菌药物敏感性试验执行标准[19], 判定该菌对16种抗生素的敏感程度。
1.8 抗生素安全性试验选取对该菌最为敏感的抗生素, 进行养殖模拟治疗。分别选取20条单环刺螠分为4组, 暂养3天均无死亡后进行试验, 第1组添加适量摇至指数期的菌液; 第2组添加相同量的菌液并采用泼洒法施加适量浓度的抗生素; 第3组添加相同剂量的菌液, 待单环刺螠死亡率达到30%时添加抗生素; 第四组为空白对照。观察一周内单环刺螠的死亡与生长情况。
2 结果与分析 2.1 病原菌的形态特征该纯菌在LB培养基上培养24 h后呈现的菌落为圆形, 表面光滑, 颜色为黄色的突起菌落。革兰氏染色结果表明, 菌体为杆状, 菌体呈红色, 是革兰氏阴性菌(图 1), 命名为菌株SX-1。
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| 图 1 菌株SX-1革兰氏染色显微照片 Fig. 1 Gram straining microphotograph of strain SX-1 |
该菌生理生化鉴定结果如表 2所示, 查找《伯杰氏细菌鉴定手册》等细菌分类书籍未发现与之一致细菌, 但该病原菌与弧菌属中的细菌极为相似, 初步鉴定该菌为弧菌属中的一种。
| 检测项目 | SX-1 |
| 葡萄糖产气 | + |
| V-P | — |
| 蛋白胨水 | — |
| 蔗糖 | + |
| 甘露糖 | + |
| 阿拉伯糖 | + |
| 肌醇 | — |
| 赖氨酸脱羧酶 | — |
| 精氨酸双水解酶 | + |
| 无盐胨水 | + |
| 3%NaCl胨水 | + |
| 6%NaCl胨水 | + |
| 8%NaCl胨水 | + |
| 10%NaCl胨水 | + |
| 注: “+”表示反应为阳性, “—”为阴性, “d”为结果未知 | |
将菌株SX-1所测得的基因序列通过BLAST进行序列比对分析, 结果显示该菌与新喀里多尼亚弧菌SCSIO 43737序列同源性最相近, 相似度达到99.93%;选择与该序列相近的15个弧菌菌株的16S rRNA基因序列构建系统发育树, 可以看出, 菌株SX-1与新喀里多尼亚弧菌SCSIO 43737聚为一支(图 2), 结合菌株的生理生化特征, 鉴定该菌株SX-1极有可能为新喀里多尼亚弧菌(V.n), 新喀里多尼亚弧菌属于原生动物门(Proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、弧菌目(Vibrionales)、弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio)。
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| 图 2 基于分离菌株SX-1的16S rRNA基因序列构建的系统发育图 Fig. 2 Phylogenesis graph based on the 16S rRNA gene sequence of the isolated SX-1 strain |
在人工回接感染后的第二天, 单环刺螠开始从沙底钻出, 活动能力减弱, 体表变红, 腹部鼓起, 隐约可见其中肠道卷曲为一团, 肠道内部变黑, 疑似肠道坏死的症状, 并且部分单环刺螠肠道破碎, 内容物流至体腔, 如图 3所示, 症状与第一次提取纯菌的患病幼体相同, 第三天死亡率达到40%, 第五天全部死亡, 对试验期间患病的单环刺螠肠道病原菌再次分离纯化, 并进行革兰氏染色, 生理生化鉴定及16S rRNA基因序列分析鉴定, 结果显示, 新分离的微生物各项特征均与原菌相符, 故鉴定该种疑似为新喀里多尼亚弧菌的肠道菌是单环刺螠的致病菌。
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| 图 3 患病单环刺螠幼体 Fig. 3 Diseased Urechis unicinctus larva |
SX-1的生长曲线如图 4a所示。起始OD600 (600nm波长处的吸光值)为0.115, 在培养6 h前, 菌液的OD值只有小幅度的上升, 表明SX-1此时生长较为缓慢, 该阶段是SX-1生长的延迟期。经过上一阶段的适应, 在6 h~18 h, OD值迅速增加, 说明此时SX-1在培养基里快速繁殖生长, 该阶段是SX-1的指数生长期。18 h之后OD增长缓慢, 生长速率常数基本为零, 说明此时SX-1进入稳定生长期。
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| 图 4 生长特性研究 Fig. 4 Growth characteristics studies 注: a.生长曲线图; b.不同温度下菌株生长情况; c.不同pH下菌株生长情况; d.不同盐度下菌株生长情况 |
菌液接种到LB培养基后, 在不同温度下培养24 h后, 测定不同温度下SX-1的OD值如图 4b所示。在15℃~50℃下均能生长, 但生长情况存在明显差异。相比于起始的OD600平均值(0.108), 可以看出, 在10℃下SX-1的OD值变化不大, 生长近乎停止; 在15℃~30℃之间, OD值随着温度的上升而升高, 说明SX-1随温度增加, 生长速率加快, 在30℃处出现最大OD值, 说明30℃为该菌株生长的最适温度; 而当温度继续上升时, 24 h后的OD值逐渐下降, 说明温度继续升高对SX-1的生长产生抑制作用。
2.5.3 最适pH的研究SX-1在不同pH下的生长情况如图 4c所示。起始OD600平均值为0.110, 相比于起始的OD600平均值(0.110), SX-1在4.0~7.0的pH范围内均能生长, 但存在明显差异, 在pH为6.0时, OD值最大即生长状况最佳, 所以SX-1最适合生长的pH在6.0左右, 但是与pH为5.5、6.5的两组OD值相差不大。在pH是7.5~8左右时, OD值相对于其它几组明显较低, 表明SX-1在偏碱性条件下难以生长[20], 综上, SX-1适合在偏酸性环境下生长。
2.5.4 最适盐度的研究SX-1在不同盐度下的生长情况如图 4d所示。起始OD600平均值为0.121, SX-1在盐度为20至45的范围内均能生长, 在盐度为15至25之间时, OD值逐渐增加, 在盐度为30时, 相对低盐度细菌生长状态下的OD值增加明显, 并在盐度为35处OD值达到最大值, 说明该菌株的最适盐度为35。
通过观察抑菌圈产生情况并测量抑菌圈直径, 得到新喀里多尼亚弧菌药敏结果如表 3所示。结果表明, 该菌株对氯霉素、羧苄西林、氧氟沙星、头孢曲松高度敏感, 对米诺环素、庆大霉素、卡那霉素、头孢唑林、四环素中度敏感, 对阿奇霉素、新霉素、万古霉素、利福平、红霉素、克林霉素、阿莫西林耐药。从抗生素分类情况看, 该菌株对氨酰醇类、喹诺酮类抗生素高度敏感, 对β-内酰胺类抗生素部分高度敏感, 对头孢素类抗生素敏感甚至高度敏感, 对四环素类敏感, 对氨基糖苷类部分抗生素敏感, 对大环内酯类、利福霉素类、多肽类、林可酰胺类耐药, 但该实验只对每类抗生素选取一种或两种抗生素进行实验, 该菌具体对何种类别抗生素的敏感程度有待进一步验证。
| 抗生素分类 | 抗生素名称 | 药物含量/(μg/片) | 抑菌圈直径/mm | 判定结果 |
| 氨基糖苷类 | 庆大霉素 | 10 | 11 | I |
| 卡那霉素 | 30 | 12 | I | |
| 新霉素 | 30 | 无抑菌圈 | R | |
| 大环内酯类 | 阿奇霉素 | 15 | 无抑菌圈 | R |
| 红霉素 | 15 | 无抑菌圈 | R | |
| 四环素类 | 米诺环素 | 30 | 16 | I |
| 四环素 | 30 | 12 | I | |
| β-内酰胺类 | 羧苄西林 | 100 | 21 | S |
| 阿莫西林 | 10 | 无抑菌圈 | R | |
| 头孢素类 | 头孢曲松 | 30 | 25 | S |
| 头孢唑林 | 30 | 12 | I | |
| 氨酰醇类 | 氯霉素 | 30 | 20 | S |
| 喹诺酮类 | 氧氟沙星 | 5 | 32 | S |
| 利福霉素类 | 利福平 | 5 | 无抑菌圈 | R |
| 多肽类 | 万古霉素 | 30 | 无抑菌圈 | R |
| 林可酰胺类 | 克林霉素 | 2 | 9 | R |
| 注: S为高度敏感, I为中度敏感, R为耐药 | ||||
据药敏试验结果, 我们选取氧氟沙星作为施用抗生素进行安全性试验。第一组单环刺螠第三天时全部死亡, 病状特征与回染试验一致。第二组单环刺螠四天内无死亡。第三组单环刺螠在24小时后死亡5条, 另有2条浮于沙面, 且行动能力大幅度下降, 此时加入氧氟沙星, 三天后, 浮于沙面的体表明显变红的单环刺螠死亡, 说明此条单环刺螠受SX-1感染严重, 无法救活; 而另一条在用药后正常存活, 钻入沙底, 说明该抗生素及时在单环刺螠的体内抑制了病菌的生长; 该组其余的13条单环刺螠无死亡现象。第四组单环刺螠无死亡, 对比第四组与第二组单环刺螠, 生长状态相似, 处于健康状态。
3 讨论本文从人工养殖的单环刺螠患病幼体中, 分离获得一株弧菌SX-1(图 2), 该菌可导致幼螠患病。患病单环刺螠主要症状为活动能力减弱, 体表变红(图 3)。弧菌一方面在海洋环境中占有极为重要的地位[7], 特别是海洋中的碳循环, 有着不可或缺的作用, 另一方面也是水产养殖行业中的常见致病菌[21], 如溶藻弧菌对皱纹盘鲍[22]、凡纳滨对虾[23], 哈维氏弧菌对大菱鲆[24]、石斑鱼[25]等。已有研究表明, 患有急性肝胰腺坏死综合征的凡纳滨对虾肠道内菌群丰富度降低, 菌落组成的均匀度遭到破坏, 其中弧菌属占据绝对优势[23]。该菌SX-1疑似的新喀里多尼亚弧菌(Vibrio neocaledonicus)(图 2)在缓解金属腐蚀方面有着重大的研究潜力[26]。然而其可作为单环刺螠的致病菌则为首次报道, 目前尚无幼螠疾病方面研究, 本实验为人工养殖幼螠过程中出现的疾病提供治疗依据。通过本文对该弧菌的致病性研究, 有助于增加人们对该菌的了解和重视, 在注意安全、积极防治的同时, 开发该菌的应用价值。
在水产养殖过程中, 根据目前已有的研究可知, 单环刺螠人工养殖最适温度为25℃左右, 最适生长pH为8[27], 盐度为25前后[28], 这与我们所测的SX-1的最佳生长条件(温度30℃, pH7.5~8, 盐度35)有所差异, 因而在高温期通过水质监测, 及时控制养殖环境尤其是pH, 一定程度上抑制单环刺螠养殖过程中该致病菌的生长, 使幼体单环刺螠健康生长。另外, 对该弧菌的生理生化研究可为《伯杰细菌鉴定手册》等细菌分类书籍的完善提供参考价值。
通过药敏试验结果可以得知, 该弧菌对多种抗生素拥有极强的耐药性, 能对该菌产生明显抑制效应的抗生素为氯霉素、羧苄西林、氧氟沙星、头孢曲松。而效果最好的氧氟沙星在一定用药范围内不具有危害性, 建议当幼螠出现出沙全身通红时可挑出患病幼螠在容器中用适宜浓度的氧氟沙星进行浸泡。目前, 在水产养殖过程中, 当单环刺螠出现疾病, 人们不可避免地要施用抗生素, 但如果滥用抗生素, 将导致致病菌的耐药性不断增加。所以在单环刺螠患病后, 可以结合本文的治疗模式, 结合药敏试验结果有针对性的添加合适的抗生素进行治疗, 减少耐药菌株出现, 提高治疗效率。在药敏试验部分存在不足之处:只选用了16种抗生素进行实验分析, 并且在药敏试验平板中, 部分抑菌圈内出现单菌落, 经分析可能的原因是该菌在短时间产生了具有耐药性的突变体[29], 但未对这些突变体进行进一步的详细分析及药敏试验处理。
通过安全性效果试验结果可知, 氧氟沙星在此范围内可以有效抑制海肠致病弧菌的生长。
目前, 抗生素被广泛用于水产养殖行业, 但是施加药物的同时, 会加剧水体污染, 改变海洋生物的生长环境, 进而影响其生长繁殖, 这也是单环刺螠捕捞量急剧下降的原因之一。抗生素的滥用使得耐药菌频繁出现[30], 所以以更加有效的方式取代抗生素添加是今后的热点问题。实验中发现, 施用微弱剂量的致病菌并不会导致单环刺螠发病, 暗示了在单环刺螠体内存在活性物质(如黏液[31]、血液等), 或者肠道中的有益菌群可以抑制此种致病菌的生长[32], 如果能够获得这种活性物质或者菌种, 作为生防菌[33], 采用生物制剂[34]的方法, 可以实现无污染绿色可持续的治疗目的。研究单环刺螠的肠道菌群结构显得尤为重要, 不仅可以为疾病治疗提供依据, 投喂益生菌也可在养殖中实现增产增量。这为今后提供了新的研究方向。
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