2020, Vol. 44
文章信息
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- WANG Rui, HUANG Yu-chen, XIONG De-dong, HUANG Ya, TIAN Tian, MENG Bin, LIANG Jian. 2020.
- Pb2+对青蛤的急性毒性及对其血淋巴液中免疫相关酶活性的影响
- Acute Pb2+ toxicity in Cyclina sinensis and its effect on immune-related enzyme activity in hemolymph
- 海洋科学, 44(3): 59-65
- Marine Sciences, 44(3): 59-65.
- http://dx.doi.org/10.11759/hykx20190714002
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文章历史
- 收稿日期：2019-07-14
- 修回日期：2019-11-20
2. 天津市海洋牧场技术工程中心, 天津 300457
2. Tianjin Marine Ranching Technical Engineering Center, Tianjin 300457, China
铅(Pb)是一种非常常见的有色重金属元素, 具有难降解、难代谢、可沿食物链堆积和蓄积的特性, 并且污染后难以发现。多数学者认为Pb并非动物生长的必需元素, 而是一种对动物有累积伤害的污染物, 是地球上分布最广, 最严重的环境污染物之一[1]。近年来随着经济的发展, 工厂含铅废水的排放以及废旧电池的丢弃, 使Pb2+等重金属离子随着江河的冲刷作用最终进入海洋。而沿海的海洋生物, 特别是滩涂贝类会通过生物富集效应将Pb2+等重金属离子累积在体内, 造成自身损害, 成为水产养殖健康发展的重要障碍。同时随着时间的推移以及食物链的传递作用, Pb2+会对的海洋生态系统以及人类的健康产生损害。研究Pb2+等重金属富集效应对贝类的影响越来越受科学家的关注, 已报道有近江洋牡蛎(Crassostrea rivularis)[2]、栉孔扇贝(Chlamys farreri)[3]、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)[4]、四角蛤蜊(Maoctra veneriformis)[5]、缢蛏(Sinonovacula constricta)[6]、泥蚶(Tegillarca granosa)[7]。同时全国各省市也在监测本地区海域贝类的重金属Pb2+污染状况, 以评估人群膳食暴露风险[8-10]。
青蛤(Cyclina sinensis)属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、帘蛤科, 民间通常称之为黑蛤、圆蛤、铁蛤等, 其生长速度快, 适应性强, 分布范围广, 种群密度大, 是重要的经济贝类[11]。由于沉降作用Pb2+在水体下层尤其是在底泥中含量会比较高, 而青蛤移动性差, 活动范围较小, 长期栖息于底泥中, 且为滤食性, 其Pb2+富集量会尤为严重。因此, 本研究通过确定Pb2+对青蛤的半致死浓度和安全浓度, 研究这两种浓度胁迫下青蛤血淋巴液中免疫相关酶活性的变化, 全面分析青蛤对Pb2+应激反应机制, 进而评估重金属Pb2+污染对青蛤的存活趋势以及养殖产业的影响程度。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用青蛤取自天津独流减河河口区, 于天津海升水产养殖公司暂养7 d, 期间使用沙滤海水, 盐度25, 每天投喂小球藻(Chlorella vulgaris)3次, 投喂量2×104 cell/L, 并连续充气。在实验开始前24 h停止投喂, 挑选身体健康, 壳面无破损, 闭壳反应迅速、大小相似(壳长15.979 mm±0.150 mm; 壳宽17.043 mm±0.176 mm; 壳高9.862 mm±0.180 mm)的青蛤进行实验。
1.2 急性毒性实验使用醋酸铅配置实验所需母液, 并根据预实验结果, 参照等对数间距法[11], 设置10.00、13.90、19.05、26.30、36.30和50.12 mg/L 6组浓度梯度, 每组3个重复, 并以正常海水组为对照组, 每组放入青蛤20枚(表 1)。试验期间不投饵不充气, 每4 h观察各组情况, 及时挑出死亡个体并做记录(以外套膜收缩、贝壳张开、用玻璃棒触碰无闭壳反应做为死亡的判断依据), 计算Pb2+的96 h半致死浓度(96 h LC50), 安全浓度为96 h LC50的1/100。每6 h测量并记录pH值及温度的变化。
| 醋酸铅浓度/(mg/L) | 浓度 对数 |
受试 个体数 |
累计死亡个数 | |||
| 8 h | 24 h | 48 h | 96 h | |||
| 0 | 0 | 60 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 10.00 | –1.00 | 60 | 0 | 0 | 1 | 9 |
| 13.90 | –1.14 | 60 | 0 | 2 | 4 | 16 |
| 19.05 | –1.28 | 60 | 0 | 4 | 10 | 33 |
| 26.30 | –1.42 | 60 | 0 | 7 | 18 | 39 |
| 36.30 | –1.56 | 60 | 0 | 8 | 22 | 50 |
| 50.12 | –1.70 | 60 | 0 | 19 | 27 | 57 |
对实验数据用SPSS 21.0软件进行线性回归分析, 继而计算半致死浓度、95%置信区间和相关系数R2。单因素方差分析用于方差分析, Duncan test检验数据的显著性, 结果表示为:平均数±标准差, 显著性水平为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 Pb2+对青蛤的急性毒性各实验组急性毒性实验过程中海水温度、pH值变化如图 1所示。各实验组在各时间点上的水温差异很小, 最高时相差1.3℃, 整个实验期间温度变化范围为28.0~31.5℃; 各实验组的pH值差异最大值出现在78 h, 为1.47;整个试验期间海水pH值的变化范围为6.60~8.20;海水盐度为人工调制, 稳定于25‰, 因此可认为本实验的外界环境因子相对稳定。
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| 图 1 急性毒性实验过程中海水温度、pH值变化情况 Fig. 1 Changes in seawater temperature and pH during acute toxicity experiments |
通过线性回归线分析, 得出死亡概率单位与醋酸铅溶度对数的相关方程为y=4.77419x+3.70986, 相关系数R2=0.988。醋酸铅(CH3COO)2Pb对青蛤的96 h LC50=19.360 mg/L, 95%的置信区间为17.554~21.230 mg/L, 安全浓度为0.194 mg/L, 通过换算得出Pb2+对青蛤的96 h LC50为7.938 mg/L, 安全浓度为0.0794 mg/L。
2.2 Pb2+对青蛤的胁迫胁迫实验期间各实验组海水温度、pH值变化如图 2所示。SC和TC实验组在各时间点上的温度基本一致, 与对照存在一定温差, 最大温差出现在第12 d, 差值为1.7℃, 整个实验期间温度变化范围为28.3~31.3℃; 实验组与对照组的pH值相差不大, 最大差值出现在11 d, 为0.28, 整个试验期间海水pH值的变化范围为7.67~8.27。海水盐度为人工调制, 稳定于25‰, 因此可认为本实验的外界环境因子相对稳定。
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| 图 2 胁迫实验期间温度、pH值变化情况 Fig. 2 Changes in temperature and pH during stress experiments |
由图 3可知, 与对照组相比, SC组ACP活性整体表现为先诱导后抑制趋势, 除4 d时在各时间点上与对照组差异显著(P < 0.05), 最低值出现在第10 d, 仅为(0.94±0.01)U/mg; TC组整体表现抑制趋势, 整个实验过程中均为三个实验组中的最低, 除4 d外与对照组差异显著(P < 0.05);最低值出现在第10 d, 为(0.74±0.01)U/mg。
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| 图 3 不同Pb2+浓度胁迫对青蛤血淋巴液ACP活性的影响 Fig. 3 Effect of stress by different Pb2+ concentrations on ACP in the blood lymphocytes of Cyclina sinensis 注:同一时间点上不同的字母表示组间差异显著(P < 0.05), 下同 |
如图 4所示, 胁迫的第2 d, 实验组SC组和TC组的AKP活性出现短暂的诱导作用, 随胁迫时间的推移在第4 d后就一直处于受抑制作用; SC组在受抑制期间除第8 d外均与对照组差异显著(P < 0.05), 最小值出现在第10 d仅为(0.55±0.05) U/mg; TC组在受抑制期间均与对照组差异显著(P < 0.05), 最小值出现在第10d仅为(0.23±0.03) U/mg。
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| 图 4 不同Pb2+浓度胁迫对青蛤血淋巴液AKP活性的影响 Fig. 4 Effect of stress by different Pb2+ concentrations on AKP in the blood lymphocytes of Cyclina sinensis |
如图 5所示, 实验组SC组和TC组的LSZ活性在实验前期表现为诱导趋势, 中后期表现为抑制趋势, 均在第4 d时产生最大诱导作用, 此时SC组活性最大值为3.73 U/mg, TC组为4.20 U/mg; 随后两实验组LSZ活性迅速被抑制, 期间两实验组均与对照组差异显著(P < 0.05), 且TC组活性始终低于SC组; SC组LSZ活性最低值(1.23±0.01) U/mg出现在第6 d, TC组在第12 d时出现最低值(1.05±0.07) U/mg。
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| 图 5 不同Pb2+浓度胁迫对青蛤血淋巴液LSZ活性的影响 Fig. 5 Effect of stress by different Pb2+ concentrations on LSZ in the blood lymphocytes of Cyclina sinensis |
急性毒性实验是指物质在高浓度、短时期(通常为24~96 h)引起受试生物群体出现一定数量的死亡或者产生其他效应的实验方法, 进而得出某种物质对生物的半致死浓度和安全浓度, 为找出该物质的作用途径、剂量-效应关系、作用机理等其他的动物实验提供依据支撑, 同时也可以为环境监测提供预警值, 因而沿用至今, 成为最常用的毒理学实验方法之一。水生动物对水环境的变化很敏感, 当水体中蓄积一定浓度有毒物质时, 会出现中毒现象, 具体表现为:索饵、生殖或者形态的改变; 迟钝迟发性症状、行为反常、运动痉挛失调或游动停滞、麻痹、甚至停止摄食而死; 种群数量和结构发生变化等[13]。本实验开始时, 各个浓度组的青蛤无异常表现, 不久后轻触青蛤的水管个别个体收缩缓慢, 表现出明显的应激现象。随着作用时间的延长, 更多的个体表现出类似的应激反应且更加迟钝, 严重者出现外套膜收缩、闭壳肌无力、贝壳张开等明显的中毒表现, 最终造成死亡。这也与海湾扇贝的铅中毒的症状相一致[14]。
符修正等人[15]研究得出Pb2+对波纹巴非蛤的96 h LC50为4.119 mg/L, 毒性级别为高毒级(LC50为1~100 mg/L)。刘琼玉等[16]进行重金属锌、铅对菲律宾蛤仔的急性毒性试验结果显示, Pb2+对菲律宾蛤仔的96 h LC50为14.28 mg/L。本试验研究得到Pb2+对青蛤的96 h LC50为7.938 mg/L, 安全浓度为0.0794 mg/L, 毒性级别属于高毒级。这表明即使是相同的物质, 其毒性仍然有所差异, 这可能和生物体自身的耐受性以及物质在机体内的代谢、作用方式有一定关系。
本试验中青蛤Pb2+安全浓度为0.0794 mg/L, 高于中华人民共和国农业部发布的《无公害食品海水养殖水质NY5052-2001》要求的≤0.05 mg/L。但贝类对重金属具有很强的富集作用, 当养殖海水水质达标时也多加关注, 应及时采取措施, 减少不必要的损失。
3.2 Pb2+胁迫对免疫相关酶活性的影响酸性磷酸酶(ACP)是动物代谢过程中重要的调节酶。在酸性内环境下催化磷酸单酯水解, 参与磷酯的代谢和其他重要的生物学功能, 通常认为酸性磷酸酶主要存在于溶酶体内, 是溶酶体的标志酶之一[17]。卢斌等[18]将白氏文昌鱼(Branchiostomabelcheri)分别暴露在Cd2+安全浓度的水体中7 d, 发现Cd2+随时间的推移, 酸性磷酸酶的活性在第1 d、7 d高于对照组, 呈先诱导后抑制的趋势; 白秀娟等[19]的实验表明, 在较高浓度的重金属暴露下文昌鱼的ACP表现为显著抑制; 本实验结果与上述研究一致, 本实验中低Pb2+浓度的SC组ACP活性整体表现为先诱导后抑制趋势, 而高Pb2+浓度的TC组整个试验期间均受到抑制。
碱性磷酸酶是一种含锌的糖蛋白[20], 广泛分布于动物的各个组织内, 在碱性环境中(最佳pH值约为10)可以催化各种醇和磷酸苯酚的水解[21], 对生物体的免疫作用具有重要意义。赖德荣等研究表明[22]镉污染对翡翠贻贝(Perna viridis)碱性磷酸酶的影响有明显的抑制作用, 在Cb2+浓度在1~500 µg/L范围内就会有明显的抑制作用, 并且与水体中的镉浓度增加而出现的抑制作用且作用随着镉浓度的增加越来越显著。本实验中, SC组和TC组AKP活性在实验前期出现短暂的诱导作用, 但随后便一直受抑制作用, 且高Pb2+浓度的TC组受抑制程度要大于安全浓度的SC组。
溶菌酶(lysozyme)又名N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶, 是一种小分子质量的碱性蛋白水解酶, 是体内最重要的非特异性免疫因子之一, 它不仅可以催化细菌细胞壁的水解, 还可以使细菌在体内免疫过程中溶解和死亡, 诱导其他免疫因子的合成和分化, 参与机体内多种免疫反应, 并在机体特异性免疫和非特异性免疫中发挥重要作用, 常作为评价机体免疫水平的重要指标之一[23]。贝类溶菌酶是由在研究美洲牡蛎(Crassostrea virginica)血淋巴液的过程中发现的[24]。丁鉴峰等[25]研究证实, 海洋污染物浓度对所在海区的菲律宾蛤仔血细胞的亮氨酸氨基肽酶和溶菌酶活性有显著的抑制作用, 污染物浓度越高抑制作用越大。李晓梅等[26]研究表明, 近江牡蛎长期处于低pH、铅胁迫或Pb2+胁迫共存的条件下, 会导致其组织溶菌酶含量降低和耐受性降低。本实验中实验组SC组和TC组的溶菌酶活性在实验前期表现为诱导-抑制的变化趋势, 在第4 d时产生最大诱导作用, 随后两实验组LSZ活性迅速被抑制, 期间两实验组均与对照组差异显著(P < 0.05)。
当外来物质进入体内或随着环境的变化, 贝类溶酶体含有的各种水解酶, 如酸性磷酸酶, 碱性磷酸酶和溶菌酶, 会参与杀害和消除异物[26]。本实验中对照组青蛤的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶或溶菌酶的活性随时间呈先降低再升高趋势, 可能由于青蛤体内被异物入侵, 它们参与了体内杀害和消除异物的过程。本实验中青蛤在两种Pb2+浓度(SC组和TC组)胁迫下血淋巴液中ACP、AKP和LSZ活性均出现先诱导后抑制的变化趋势, 而且高Pb2+浓度的TC实验组酶活性受到的抑制作用明显大于低Pb2+浓度的SC实验组; 这种促进酶活性在胁迫初期升高的现象可能是由于“毒性兴奋效应”造成的, Stebbing[27]认为低剂量毒物可以引起一系列修复和维持机制, 例如通过激活转录因子和激酶, 增加细胞保护和修复蛋白(例如, 抗氧化酶, 伴侣蛋白, 生长因子, 免疫因子等), 称为“毒物兴奋作用”。但随着胁迫时间的延长以及有毒物质浓度的增大, 毒物会改变血细胞内溶酶体膜的通透性、减少修复性蛋白表达量甚至引起血细胞溶解, 导致溶酶体失活及酶合成量减少, 造成酶活性受抑制。
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