红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是一种重要的海水养殖鱼类, 隶属于鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、东方鲀属(Takifugu), 是暖温性、广盐性底栖肉食性鱼类, 主要分布在日本沿海, 在朝鲜半岛、俄罗斯也有分布, 中国自然数量主要分布在黄海、渤海和东海, 是我国北方海水养殖和出口创汇的重要鱼类。其适宜生长温度为16~25 ℃, 过低的温度会造成生长性能的下降甚至死亡现象^[1], 然而在我国北方养殖红鳍东方鲀时, 陆海接力以及越冬过程必然会遇到温度降低的状况, 另外使用加热提高水温的方式也会遇到成本升高和环保压力等问题, 因此通过选育具有耐寒性状的品系可减少因温度降低而造成的经济损失。

水产动物耐温品种的选育工作已取得一定的进展, 在大菱鲆、暗纹东方鲀、中国明对虾、凡纳滨对虾、刺参以及大黄鱼都有相关的研究^[2-7], 针对耐温性状, 目前的选育方式多采用传统群体选育和家系选育等方式。分子标记辅助育种(molecular marker- assisted breeding, MAS)是借助与性状紧密相关的分子标记对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行直接选择育种, 是分子生物学和基因组学的研究结果应用到水产养殖品种选育的技术。分子标记技术作为一种常规辅助选育手段具有选择强度大、准确率高、遗传稳定的特点^[8], 在水产、畜牧、作物等很多领域得到广泛应用^[9-11]。在常见的分子标记技术中, 微卫星分子标记(simple sequence repeats, SSR)作为分析与重要经济性状的遗传连锁关系理想的分子标记, 已经被广泛应用于水产动物的育种^[12-14]。

目前关于红鳍东方鲀分子标记的研究多涉及遗传评估与系谱认证^[15], 有关红鳍东方鲀耐低温相关的微卫星分子标记的研究在国内尚未报道。本研究采用SSR结合混合群体分离分析法(bulked segregant analysis) 技术, 筛选与耐低温性状相关的分子标记, 以期为红鳍东方鲀经济性状的间接选择提供参考数据, 为培育红鳍东方鲀耐低温品种奠定基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验所用的红鳍东方鲀样品来自大连天正实业有限公司, 在室内养殖池中挑选300尾体格健壮、无损伤、活力好的幼鱼, 体长(15.1±0.5) cm, 体重(150±9) g, 于6个实验桶(2 000 L)中暂养, 暂养2周, 水温(23±0.5) ℃, 同暂养前保持一致, 使用加热棒维持温度。该群体已在本课题组进行过遗传多样性分析, 其期望杂合度(Excepted heterozygosity, H_e)大于0.7, 遗传多样性丰富。

1.2 实验设计

暂养结束后, 通过自然海水流水(水温5 ℃)降温的方式, 每天降温3 ℃, 持续降温6 d (23 ℃, 20 ℃, 17 ℃, 14 ℃, 11 ℃, 8 ℃, 5 ℃), 最终达到5 ℃后维持。在降温期间每隔20 min观察实验鱼的状态, 发现濒死鱼及时取出, 剪尾鳍置于无水乙醇后冻于−40 ℃冰箱中备用。在温度降至8 ℃后陆续有死鱼出现, 在温度维持5 ℃经2 d后, 死亡数量达到50% (150尾)时停止实验, 存活个体剪尾鳍置于无水乙醇后冻于−40 ℃冰箱中备用。在死亡个体中选取最早死亡的34尾幼鱼记为不耐低温组(D组), 在存活个体中选取34尾状态活跃的幼鱼记为耐低温组(S组)。

1.3 微卫星引物

根据Takagi等^[16]和古川聡史^[17]报道的红鳍东方鲀微卫星位点, 选取148个能够覆盖整个微卫星图谱的位点, 根据其侧翼保守序列设计引物, 由上海生工公司合成。

1.4 基因组DNA制备

利用天根生化科技(北京)有限公司生产的海洋动物DNA提取试剂盒, 提取红鳍东方鲀S组和D组的尾鳍DNA。采用1%琼脂糖凝胶电泳测定提取DNA的质量及完整性, 采用紫外分光光度计进行浓度测定, 最后用双蒸水稀释至质量浓度为5×10^–2 g/L左右, 保存于−40 ℃冰箱。

1.5 BSA基因池的建立

从D组选取最先开始死亡的15个个体和S组选取更具活力的15个个体, 每个个体取等量5 μL DNA溶液, 分别构成耐低温DNA池和不耐低温DNA池。

1.6 PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳

利用148对微卫星引物分别对耐低温DNA池和不耐低温DNA池进行PCR扩增, 寻找差异条带。PCR反应体系为20 μL: 1 μL DNA溶液, 1 μL上游引物, 1 μL下游引物, 10 μL 2 × Taq PCR Mix, 7 μL灭菌双蒸水。PCR扩增反应条件: 94 ℃预变性10min; 94 ℃变性5 s, 按每对引物实际退火温度反应50 s, 72 ℃延伸50 s, 共35个循环; 72 ℃延伸10 min。在扩增出来的20 μL产物中加入5 μL 6 × LoadingBuffer, 95 ℃ 5 min, 立即冰浴10 min。产物在5%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(30%丙烯酰胺预混液83.3 mL、尿素210.2 g、10 × TBE 50 mL, 加蒸馏水定容至500 mL), 上样量4 μL, 恒压100 V, 电泳6 h。电泳结束后, 采用银染法(4 g硝酸银, 2 000 mL蒸馏水)对PAGE胶进行摇床染色10 min, 用双蒸水冲洗1 min, 减少背景色, 用显影液(30 g氢氧化钠, 4 mL甲醛, 2 000 mL蒸馏水)进行摇床显影, 待出现浅色条带, 立即停止显色并用大量双蒸水冲洗1 min, 然后立即在白光下进行拍照保存电泳结果。

1.7 差异条带个体验证

通过2个混池DNA的PCR扩增情况, 初步筛选出能在2个池中能扩增出差异等位基因片段的微卫星位点, 按照上述PCR扩增反应条件对所有68个红鳍东方鲀DNA样本进行PCR扩增, 分析差异等位基因片段在个体上具体的扩增情况。

1.8 数据分析

通过Bandscan软件对电泳结果进行分析, 获取差异条带的分布情况、碱基数以及泳动位置。用SPSS 18.0软件对微卫星引物在S组、D组个体中所扩增出的差异条带频率进行卡方检验, 若卡方检验P < 0.05就认为这个条带在红鳍东方鲀耐、不耐低温个体中分布差异显著。

2 实验结果 2.1 BSA分池PCR扩增结果分析

用148对微卫星引物对所构建的耐低温和不耐低温DNA池进行PCR扩增, 扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 均能发现扩增产物。对扩增产物用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染, 有4个微卫星位点(fms45、fms82、fms100和fms182)在S组、D组基因池间扩增出差异条带(图 1)。使用Bandscan软件计算出了差异条带碱基数, 其中位点fms45的差异条带碱基数为125 bp和137 bp, 位点fms82差异条带碱基数为98 bp和102 bp, 位点fms100差异条带碱基数为116 bp和132 bp, 位点fms182差异条带碱基数为125 bp。

2.2 差异条带在个体中的扩增验证

针对上述4个微卫星位点, 在所有68个红鳍东方鲀DNA样本(包括混池样本)进行PCR扩增, 分析差异等位基因片段在个体上具体的扩增情况。4个微卫星位点在红鳍东方鲀验证的个体扩增情况如图 2—图 5, 经卡方检验, 只有引物fms100和fms182的扩增结果具有显著差异, fms100扩增的116 bp和132 bp的P值分别为0.001和0.003, fms182扩增的125 bp条带的P值为0.045(图 6)。

3 讨论

红鳍东方鲀是我国重要的经济鱼类, 由于其不耐低温的特点, 目前北方多采用室外池塘和网箱养殖结合室内池塘越冬的方式, 而越冬的成本偏高制约了红鳍东方鲀产业的发展, 因此红鳍东方鲀抗寒选育的需求愈发强烈。分子标记辅助育种是借助与性状紧密相关的分子标记对具有性状优势的等位基因或基因型的个体进行直接选择育种, 是分子生物学和基因组学的研究结果应用到水产养殖品种选育的技术^[8-11], 与传统的表现型选择相比, 不受等位基因间的显隐性关系、其他基因效应和环境因素的影响, 选择结果可靠, 能够提高选择效率缩短育种年限, 克服了很多常规育种方法中的困难。

SSR分子标记作为分析与重要经济性状的遗传连锁关系理想的分子标记, 在水产动物的育种方面也得到了广泛的应用^[18-19]。李彩娟等^[20]基于第二代测序技术对大鳞副泥鳅转录组数据进行分析获得了15 106个核心序列大于12 bp的SSR, 并随从中机选取400对SSR标记, 91%有扩增产物。于洋等^[21]使用微卫星和线粒体控制区标记用来对凡纳滨对虾新品种进行鉴定, 准确率达到了89%。关于红鳍东方鲀SSR的研究也有部分报道, 多集中在筛选性别差异标记和分析遗传多样性方面^[22-23]。本研究针对红鳍东方鲀耐低温性状, 筛选与之显著相关的SSR分子标记, 以期为后期的耐低温选育工作提供科学的依据。

为了更好地获得与红鳍东方鲀耐低温显著相关的SSR分子标记, 本研究根据Takagi等^[16]和古川聡史^[17]的报道, 选取了148个微卫星标记进行筛选, 这些标记能够完全覆盖红鳍东方鲀微卫星连锁图谱的23个连锁群, 目前已有的相关研究大多涉及的标记量较少或者缺少染色体的覆盖信息^[24-26], 而本研究中使用大量的覆盖所有连锁群的SSR标记进行筛选, 能够使标记的筛选工作更加细致全面, 更大概率获得显著性相关标记。另一方面, 这样的筛选方式也导致标记数量较多, 若按照普通的微卫星标记筛选方案逐一进行验证, 工作量会非常大, 耗时耗力。而分群分离分析法BSA的运用大大减少了聚丙烯酰胺凝胶电泳的重复过程, 有效减少了工作量, 提升了工作效率。BSA是Michelmore等针对SSR标记技术开发了分群分析法, 它首先利用具有表型差异的分离群体构建具有目标性状差异的DNA池, 然后选择合适的分子标记对两DNA池进行目标标记的筛选, 最后用该分子标记进行单个体验证^[27]。此方法具有效率高、耗费少等优点, 被广泛应用于相关标记的筛选^[27]。在作物培育领域, 陈艳萍^[28]等利用SSR-BSA技术筛选出2个可能与玉米粗缩病抗性相关的分子标记。高轶静^[29]等利用高抗和感病亲本杂交的后代群体为材料, 采用SSR-BSA技术筛选出一个与甘蔗抗黑穗病性基因连锁的SSR标记。在鱼类选育方面, 黄智慧等^[30]采用SSR-BSA技术分析大菱鲆(Scophthalmus maximus)耐高温相关特性, 发现了3个与大菱鲆耐高温性状存在负相关性微卫星位点, 并将获得的两个分子标记Sam-Usc27和saml-125INRA用于构建耐大菱鲆品系, 显著提高了大菱鲆整体的耐温性能。邹杰等^[31]采用SSR-BSA技术对暗纹东方鲀生长性状相关微卫星标记进行筛选, 经验证实验后获得与生长性状显著相关的fms15、fms75两个位点。

在我们的实验结果中发现, 通过对148个微卫星位点在耐低温和不耐低温DNA池中的差异分析, 只有4个SSR标记出现差异, 但进一步的个体验证后, 仅有2个标记出现统计学差异。这可能是由于我们选择的群体来自养殖群体, 并非家系群体, 个体遗传背景不同, 遗传差异较大。一般说来遗传背景单一的群体更容易获得性状相关的分子标记, 这一点在很多鱼类的家系内分子标记筛选中有所体现, 但筛选到的标记往往是家系内特异的, 并不具有广泛的适用性。本实验选用的群体来自养殖群体, 遗传多态性分析发现, 其H_e大于0.7, 遗传多样性丰富。从遗传差异较大的群体中筛选得到的分子标记具有更广泛的适用性, 也就意味着本实验筛选到的标记可能具有更大的育种潜力。

综上, 本研究采用SSR-BSA技术, 初步获得了两个与红鳍东方鲀耐低温相关的分子标记。这是国内第一次关于红鳍东方鲀耐低温分子标记的报道, 这为研究红鳍东方鲀耐低温的遗传基础以及相关分子机制提供了依据, 也为开展红鳍东方鲀耐低温分子标记辅助选育提供了良好的基础。