文蛤(Meretrix petechialis)广泛分布于我国沿海地区, 是一种重要的海水养殖贝类。文蛤为雌雄异体, 通常二年龄文蛤的性腺可发育成熟。自然条件下文蛤生殖周期为每年1次, 但在繁殖季节可多次排放配子^[1]。对双壳贝类的研究发现, 其软体部生化组成变化与繁殖周期有关。在能量需求较低的夏季, 贻贝(Mytilus edulis)体内的糖原含量较高, 同时蛋白质和脂质的储备量上升; 而在秋冬季节贻贝性腺中配子发育, 能量需求上升, 糖原含量降到最低值^[2]。在蛤仔(Ruditapes decussatus)繁殖期, 摄入的能量主要用于繁殖过程, 在食物匮乏的情况下会将储备的能量优先用于性腺发育, 但配子排放后, 性腺的恢复会受到限制^[3]。

生物繁殖过程需要大量的能量支持^[4-5]。繁殖期间生物体会对有限的资源进行重新分配, 在繁殖方面的投入增加势必会导致在代谢、免疫等方面功能的弱化^[6], 甚至会引起生理代谢过程的紊乱^[7]。一般来说, 双壳贝类繁殖能量占比较高, 牡蛎性成熟时性腺的占比可达软体部总体积的70%, 这意味着其配子发生过程需要消耗大量的ATP, 生殖后的个体往往处于较为虚弱的生理状态^[8]。加之夏季持续高温、环境病原微生物增殖等外源性因素叠加, 繁殖期贝类时有爆发性死亡发生^[9]。

研究发现, 生物体雌雄个体对繁殖事件的应对策略存在差异。蛤仔(R. decussatus)性腺发育和脂质含量密切相关, 当食物量不足以满足机体的能量需求时, 雄性会停止甚至降低脂类的积累, 而雌性则会继续积累脂质以促使性腺发育成熟^[10]。缢蛏(Sinonovacula constricta)繁殖期间, 雄性个体会在能量需求旺盛时利用蛋白质进行能量补给, 而雌性个体则不会^[11]。性成熟的绿唇鲍(Haliotis laevigata)中, 雌性性腺中有更高的蛋白质合成速率, 雄鲍性腺中具有更高的能量代谢活性^[12]。Wang等^[13]研究也发现, 文蛤繁殖后雄性中与补体相关的免疫功能下降, 而雌性中与细胞凋亡、抗菌肽等相关的免疫功能上升。

本实验旨在研究雌、雄文蛤繁殖过程中的能量代谢变化差异, 通过测定排放后雌、雄文蛤的耗氧率、排氨率、摄食率、排粪率、糖代谢途径关键酶活性与代谢产物含量等生理生化指标, 分析文蛤繁殖活动、性别差异及能量代谢的相关性, 以期为解析夏季繁殖期贝类死亡现象产生的原因并助力文蛤健康养殖提供科学参考。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验在浙江省温州市清江养殖基地开展, 实验动物来自浙江温州的文蛤养殖群体, 壳长(49.37±4.42) mm, 壳高(40.17±4.66) mm, 壳宽(25.79±2.46) mm。选择规格相近健康且性腺成熟的文蛤400粒用于催产。在刺激催产前, 随机取20个生殖前个体解剖获取足组织, 记作“0 d”, 通过镜检生殖细胞形态区分性别, 共获得8个雄蛤和12个雌蛤; 将足组织放入液氮速冻后在−80 ℃冰箱中储存, 用于后续酶活及代谢物指标检测。将剩余文蛤置于室外阴干过夜, 次日放入水池中进行流水刺激催产, 随后观察亲贝配子排放情况, 并根据配子形态, 对性别进行鉴定^[14]; 配子排放完成后将雌、雄个体进行分组暂养。在生殖后1 d、2 d、3 d、5 d四个时间点, 每个点分别取5只雌、雄个体解剖获取足组织, 液氮速冻后在−80 ℃冰箱中储存, 用于后续酶活及代谢物指标检测。

1.2 生理代谢指标测定

从排放后的雌、雄文蛤中各取15个个体, 并随机分成5组, 将每组3个文蛤标记后放入装满海水的2.2 L容器中进行生理代谢指标测定。每天上午测定文蛤的耗氧率、排氨率、摄食率和排粪率指标, 实验持续监测5 d。每次测定结束后将标记好的文蛤放回300 L的水箱中暂养, 按时换水并投喂等鞭金藻(日投喂量约2.0×10⁴个/mL)以维持文蛤正常生存状态^[15]。实验结束后立即测量文蛤的体尺性状和活体质量, 解剖后取软体部放入烘箱, 在65 ℃条件下烘干至恒重, 测干质量数据并记录。

1.2.1 耗氧率和排氨率

分别用静水法和次溴酸钠氧化法测定耗氧率和排氨率^[15-16]。实验时每个容器放入3只文蛤, 雌、雄组各设5个平行; 装满海水后用溶解氧探头(Multi3410 SET 2)测初始溶解氧质量浓度(简称溶氧值)后密封, 2 h后测溶氧值。实验前、后收集水样, 用于测定$\mathrm{NH}_4^{+}$-N含量。

耗氧率R_OR(mg·g⁻¹·h⁻¹)计算公式:

$ {R_{{\text{OR}}}} = \left[ {\left( {{\text{D}}{{\text{O}}_0} - {\text{D}}{{\text{O}}_t}} \right) \times V} \right]/\left( {W \times t} \right), $

(1)

式中, DO₀和DO_t分别代表初始溶氧值和2 h后的溶氧值, V代表实验水体的体积(L), W代表实验结束后文蛤的软体部干质量(g), t代表实验时间(h), 下同。

排氨率R_NR(mg·g⁻¹·h⁻¹), 计算公式:

$ R_{\mathrm{NR}}=\left[\left(N_0-N_t\right) \times V\right] /(W \times t), $

(2)

式中, N₀、N_t分别代表实验开始与结束时水体中的${\text{NH}}_4^ + $-N浓度(mg·L⁻¹)。

1.2.2 摄食率和排粪率

采用静水法检测文蛤的摄食率^[15-16], 实验前容器中加入2.0 L海水, 水体中添加金藻浓度为1.0×10⁵个/mL。2 h后将水样混匀后用300目滤网过滤, 收集水样与粪便。实验设置3组空白对照。采用GF/C玻璃纤维滤纸进行抽滤, 提前将其在450 ℃条件下处理6 h, 抽滤水样后将保留在滤纸上的样品放于65 ℃烘箱中烘干至恒重并称重, 记为W₆₅; 称重后将W₆₅样本在450 ℃条件下处理6 h并称重, 记为W₄₅₀。

文蛤的摄食率R_IR(mg·g⁻¹·h⁻¹)计算公式如下:

$ {R_{{\text{IR}}}} = \left[ {\left( {{C_0} - {C_0} \times {\text{Sd}} - {C_t}} \right) \times V} \right]/\left( {W \times t} \right), $

(3)

式中, C₀和C_t分别代表了实验开始与结束时实验水体中饵料的浓度, Sd代表空白对照组的饵料变化。

文蛤排粪率R_FER(μg·g⁻¹·h⁻¹)计算公式如下:

$ R_{FER} = R_{IR} × [1–(F–E)/ (1–E) × F]/ × 100, $

(4)

式中, F和E分别代表饵料和粪便中有机物的干质量比例, 即POM(水体中颗粒有机物浓度)与总颗粒物含量之比。

1.3 糖含量与酶活力测定

每个时间点各取3个雌、雄文蛤个体, 将冻存的足组织样本于冰上解冻, 分别按质量体积比加入提取液, 冰浴匀浆后以8 000 g/min离心10 min, 获取上清液。按照相关试剂盒(均购于北京索莱宝科技有限公司)说明书分别测定糖原含量、葡萄糖含量、己糖激酶(HK)活性和磷酸果糖激酶(PFK)活性。

1.4 数据处理

实验数据采用平均值±标准差(Mean ± SD)表示, 利用Excel 2021统计软件整理数据, SPSS 27.01版分析软件对数据进行独立样本T检验及单因素方差分析(ANOVA), 并结合Duncan法进行多重比较, 以P < 0.05作为差异显著水平。

2 结果 2.1 耗氧率、排氨率和氧氮比的变化

结果显示, 雌、雄文蛤的耗氧率、排氨率和氧氮比均受配子排放的影响, 且随产后时间呈现变化(图 1)。产后文蛤耗氧率随时间呈下降趋势, 从3 d开始雌、雄文蛤耗氧率出现差异, 且雌蛤的耗氧率显著高于雄蛤(P < 0.05)。文蛤排氨率在产后波动较大, 2 d时显著升高达到最高值, 随后随时间逐渐下降, 雌、雄个体间未检测到显著差异。雌、雄文蛤的氧氮比在产后表现出了不同的变化趋势, 雌蛤氧氮比从4 d开始迅速上升, 而雄蛤变化不大。整体来看雌蛤的耗氧率、排氨率和氧氮比高于雄蛤, 提示产后雌蛤生理活动强度高于雄蛤。

2.2 摄食率和排粪率的变化

从产后2 d开始, 文蛤摄食率大幅增加并稳定在较高水平, 且雌蛤摄食率显著高于雄蛤(P < 0.05)。而文蛤排粪率在产后保持稳定, 并且雌、雄间没有表现出性别差异。结果表明生殖对雌蛤影响较大, 大量的卵子排放刺激其摄食更多饵料进行能量补充。

2.3 糖原和葡萄糖含量的变化

如图 3所示, 配子排放前后雌、雄文蛤的糖原含量均保持稳定, 部分时间点雄蛤的糖原含量高于雌蛤(P < 0.05)。产后文蛤体内葡萄糖含量迅速升高, 而后逐渐恢复至产前水平, 提示了生殖过程中糖原和葡萄糖的转换, 以及产后文蛤生理状态逐渐恢复的过程。

2.4 糖分解代谢关键酶酶活变化

如图 4所示, 雌蛤的己糖激酶(HK)活性在配子排放前后保持稳定, 而雄蛤HK活性在产后2 d时上升, 显著高于雌蛤, 随后下降至与雌蛤活性相似水平。与HK活性变化不同, 雌蛤的磷酸果糖激酶(PFK)活性在产后大幅下降并保持在较低水平, 而雄蛤PFK活性在生产前后保持稳定, 产后雄蛤PFK活性显著高于雌蛤, 提示生殖会抑制雌蛤的糖酵解过程。

3 讨论

代谢指标能反映贝类的基础生理状况, 其中耗氧率和排氨率可以指示机体的代谢强度, 而摄食率和排粪率则是体现生物能量变化的重要指标^[17]。首先, 耗氧率代表单位体重的生物在单位时间内因生物氧化而消耗的氧气量^[18], 文蛤的生殖活动需要大量的能量支持, 因而耗氧率的高低可以体现生殖过程中其体内生化反应的强弱及生理活动的强度^[19]。本研究中, 雌、雄文蛤的耗氧率在产后均随时间下降, 雌蛤的耗氧率高于雄蛤, 提示产后雌、雄文蛤的代谢强度整体呈下降趋势, 与雄蛤相比, 雌蛤生殖的生理活动强度与能量消耗更高。研究显示, 在蛤类的氮代谢中, 氨氮占主要终产物的70%以上, 因此排氨率可体现出其蛋白质的代谢水平^[20]。与耗氧率不同, 雌、雄文蛤的排氨率在产后2 d时出现峰值, 代表着生产后文蛤的蛋白代谢水平有所提高, 可能是其应对生殖活动的生理反应。在本研究中, 氧氮比整体在24以上, 提示生殖后雌、雄文蛤仍以糖类和脂肪为主要供能物质^[21]。

同时, 生殖过程对文蛤摄食行为产生了影响。雌、雄文蛤的摄食率从产后2 d开始均大幅提高, 雌蛤摄食率显著高于雄蛤; 而排粪率在实验期间一直保持稳定, 且雌、雄之间未产生差异, 提示产后雌蛤需要摄入更多食物, 提供能量弥补生殖损耗。总体而言, 生产后雌蛤的耗氧率、排氨率与摄食率等指标均高于雄蛤。已有研究发现, 贝类雌性个体需要投入更高的能量成本用于卵细胞的生产^[22], 说明与雄性相比, 雌性需要个体付出更高的繁殖代价。

糖类最主要的生理功能是为机体提供生命活动所需要的能量, 糖分解代谢是生物体取得能量的主要方式, 其中糖原是重要的葡萄糖储备物质, 而葡萄糖是直接的供能物质, 糖原与葡萄糖的相互转化能够维持生物体内能量的动态平衡^[23]。动物配子的成熟与排放均需能量支持, 在双壳贝类中糖原代谢受到组织器官、生长发育和外部环境的多重影响^[24]; 对长牡蛎(Crassostrea gigas)配子发生研究发现, 外源营养不足的情况下, 长牡蛎会消耗闭壳肌及外套膜中的糖原为生命活动提供能量^[25]。本研究中雌、雄文蛤的糖原含量在生产过程中较稳定, 但与产前相比, 产后表现出了先降低后上升的变化; 而文蛤生产前后葡萄糖含量变化与糖原不同, 在产后大幅增长, 随后逐渐下降, 提示糖原分解生成了葡萄糖, 表明文蛤排放过程需要直接而快速的供能。在产后5 d, 雌雄文蛤机体中葡萄糖含量下降并接近产前水平, 表明文蛤体内糖水平趋于恢复正常。

糖代谢作为机体主要的供能过程, 受到多个关键酶的调控。本实验中我们检测了糖代谢途径关键酶类的变化。结果显示, 生产前后雌雄文蛤的HK活性变化不大, 而PFK活性在雌、雄文蛤中呈现截然不同的变化趋势。雌蛤PFK活性在产后显著降低, 其数值不足产前一半并稳定保持在这一较低水平, 而雄蛤的PFK活性在生产前后变化不大。HK作为糖酵解过程的第一个限速酶, 在细胞葡萄糖代谢中起重要作用, 其活性变化与外源葡萄糖的利用有关^[26], HK活性检测结果暗示将葡萄糖转化为己糖的过程没有受到生殖的影响。而PFK在糖酵解过程中是重要的调节位点, 能够决定其代谢速度^[27], 雌蛤产后PFK活性显著降低, 提示生殖可能会对雌蛤的糖酵解的过程产生抑制作用, 但对雄蛤的影响不大。

4 结论

研究发现生殖活动会对文蛤的生理代谢和糖代谢产生影响。生殖后文蛤的代谢底物以碳水化合物和脂肪为主; 雌蛤的生理活动强度高于雄蛤, 同时雌蛤需要摄入更多的能量补偿繁殖代价与恢复其生理状态。文蛤生殖过程不会动用足组织中储存的糖原, 同时雌蛤的糖酵解途径受到了抑制, 而雄蛤受到的影响相对较小。