海洋与湖沼  2018, Vol. 49 Issue (4): 815-820   PDF    
http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20171200304
中国海洋湖沼学会主办。
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董训赞, 车绕琼, 赵永腾, 赵鹏, 徐军伟, 李涛, 余旭亚. 2018.
DONG Xun-Zan, CHE Rao-Qiong, ZHAO Yong-Teng, ZHAO Peng, XU Jun-Wei, LI Tao, YU Xu-Ya. 2018.
黄腐酸对Monoraphidium sp.FXY-10油脂合成的影响
EFFECTS OF FULVIC ACID ON LIPID ACCUMULATION OF MONORAPHIDIUM SP. FXY-10
海洋与湖沼, 49(4): 815-820
Oceanologia et Limnologia Sinica, 49(4): 815-820.
http://dx.doi.org/10.11693/hyhz20171200304

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收稿日期:2017-12-02
收修改稿日期:2018-03-23
黄腐酸对Monoraphidium sp.FXY-10油脂合成的影响
董训赞 , 车绕琼 , 赵永腾 , 赵鹏 , 徐军伟 , 李涛 , 余旭亚     
昆明理工大学生命科学与技术学院 昆明 650500
摘要:以单针藻Monoraphidium sp.FXY-10为研究对象,研究了黄腐酸对单针藻FXY-10生长、油脂及相关理化指标的影响,同时分析了黄腐酸对油脂生物合成相关的关键酶活性的影响。结果表明,添加25mg/L黄腐酸时,藻细胞总油脂含量比对照组提高了1.12倍,且最高油脂含量可达54.3%。藻细胞生物量、叶绿素含量无显著变化,蛋白质含量有所提升。此外,油脂生物合成相关的酶活性与油脂积累存在相关性,添加25mg/L黄腐酸诱导微藻细胞,乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)和苹果酸酶(ME)的活性上调,而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的活性下调。研究表明,黄腐酸作为一种外源诱导剂可促进微藻中油脂的合成,为提高微藻油脂积累提供了一种新的方法。
关键词黄腐酸    油脂含量    蛋白质    叶绿素    酶活    
EFFECTS OF FULVIC ACID ON LIPID ACCUMULATION OF MONORAPHIDIUM SP. FXY-10
DONG Xun-Zan, CHE Rao-Qiong, ZHAO Yong-Teng, ZHAO Peng, XU Jun-Wei, LI Tao, YU Xu-Ya     
Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
Abstract: The effects of fulvic acid on growth and lipid production of alga Monoraphidium sp. FXY-10 were investigated, and the relevant biochemical indexes and activities of key fatty acid biosynthetic enzyme were analyzed. Results show that the lipid content of FXY-10 was increased by 1.12-fold by 25mg/L fulvic acid treatment; the maximum lipid content achieved was 54.3%. No significant changes were observed in the biomass and chlorophyll content, but protein content was slightly increased. Furthermore, lipid biosynthesis-related enzyme activities were correlated with the increase of lipid accumulation. Acetyl coenzyme A carboxylase (ACCase) and malate enzyme (ME) activities were considerably up-regulated with phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) activity were significantly down-regulated by 25mg/L fulvic acid induction. Therefore, as an exogenous elicitor, fulvic acid can promote the lipid production of microalgae. This study offers a novel method of biodiesel production.
Key words: fulvic acid     lipid content     proteins     chlorophyll     enzyme activity    

我国是世界上重要的能源生产大国, 也是能源消费大国(Pienkos et al, 2009)。然而, 化石燃料的过度开发和使用, 造成了严重的能源危机和环境问题。因此, 寻找一种清洁、可再生的能源十分重要(Chen et al, 2011)。生物柴油是化石能源的良好的替代品, 是一种清洁环保的可再生能源。

微藻具备固碳和产油的功能(康永锋等, 2013; 姜加伟等, 2014)。利用微藻制备生物柴油具有诸多优势: (1)生产效率高, 通常是其他油料作物的10—100倍; (2)光合效率高; (3)脂质与淀粉的含量高; (4)不与粮食作物争地; (5)可利用废水, 净化环境; (6)生产周期短, 全年不间断生产等(Chisti, 2008; Carioca et al, 2009; Stephenson et al, 2011)。从微藻中提取的油脂成分, 可作为生物柴油直接应用于工业上, 具有广泛的应用价值(赵婷等, 2016)。因此, 利用微藻制备生物柴油受到越来越多国内外学者的关注(张冀翔等, 2016)。

不同浓度的植物生长调节剂可以影响微藻的生长和油脂含量的积累。研究表明, 外源添加5mmol/L的甜菜碱可以显著提高微藻中油脂含量(Zhao et al, 2016)。胺鲜酯(0.001μmol/L)结合氮缺陷(12.5%)可抑制微藻的生长, 但油脂含量高达57.1% (Babu et al, 2017)。黄腐酸是一种植物生长调节剂, 能够改变细胞的通透性, 提高植物细胞对氮、磷等营养物质的吸收, 促进植物的生长和代谢产物的积累(Piccolo et al, 1992), 影响植物的发育, 提高产量等(Heil, 2005; 袁瑞江等, 2009; Shahid et al, 2012)。研究表明, 外源添加黄腐酸(5mmol/L)可以促进雨生红球藻中虾青素的积累(Zhao et al, 2015)。

本实验以Monoraphidium sp. FXY-10为对象, 研究了黄腐酸诱导作用下, 单针藻的生物量、油脂含量、叶绿素、蛋白质及油脂合成相关酶[磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase, ACCase)、苹果酸酶(malic enzyme, ME)]活性的变化, 为提高微藻油脂产量提供了理论参考。

1 材料与方法 1.1 微藻的培养

以单针藻Monoraphidium sp. FXY-10(本实验室筛选、保存)为研究对象, Kuh1培养基作为基础培养基, 并以10g/L葡萄糖为碳源, 培养温度: (25±1)℃, 摇床转速150r/min, 异养培养单针藻至第8天, 然后将异养藻液分别接种到含有黄腐酸0和25mg/L的自养培养基中。接种量为7×107cells/mL, 光照强度: 3.5×103lx, 培养温度: (25±1)℃, 摇床转速150r/min。每组设置三个平行。

1.2 细胞干重和油脂的测定

根据藻细胞与吸光度A750值在一定的范围内成线性关系, 得出单针藻的生物量与750nm处的吸光度的关系(Che et al, 2016):

    (1)

式中, R2=0.9997, Y为生物量(g/L), X为吸光度值。

新鲜藻液12000g离心5min, -80℃冷冻过夜, 冻干。干藻粉(0.3—0.5g)与石英砂1:2 (w/w)混合研磨, 用3mL的氯仿-甲醇溶液(2:1, v/v)清洗, 转移至50mL的离心管中, 150r/min震荡20min后, 20℃、8000g离心5min, 上清液收集于另一个离心管中。重复上述步骤两次, 合并三次上清液, 并转移至已称重的干燥离心管中, 40 ℃烘干至恒重。

1.3 叶绿素和蛋白质的测定

2mL新鲜的培养液用于叶绿素含量的测定, 12000g离心5min, 弃上清。用蒸馏水重悬两次, 加入1mL的DMSO重悬, 20℃、150r/min震荡30min, 离心, 留上清。分别测量上清液在665.1和649.1nm的吸光度。叶绿素计算公式(Wellburn, 1994)如公式(2):

    (2)

蛋白质测定时, 称取10mg干藻粉, 加入200μL氢氧化钠溶液(1mol/L), 80℃静置10min, 蒸馏水定容至1mL, 12000g离心30min, 留上清。重复上述提取过程两次, 合并三次上清液。以牛血清蛋白建立标准曲线, 用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度(Berges et al, 1993)。

1.4 酶活性的测定

20mL新鲜藻液, 4℃, 12000g离心5min, 弃上清, 蒸馏水重悬, 重复离心两次。液氮速冻, 加入提取液, 用研钵磨成粉。收集在1.5mL的离心管中, 4℃, 10000g离心10min, 上清转移至新的离心管中, 使用比色定量试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)测定ME、ACCase、PEPC的活性。一个酶活单位定义为在特定条件下, 1min内能转化1μmol底物的酶量(Ma et al, 2016)。

1.5 统计分析

本文全部试验均设置三组平行, 利用ANOVA (SPSS19.0)一步法分析实验数据。最小显著性差异进行多重比较检验调查不同试验的组间差异, *P<0.05表示差异显著。

2 结果与讨论 2.1 黄腐酸诱导对微藻中油脂含量的影响

黄腐酸诱导对Monoraphidium sp. FXY-10油脂含量的影响见图 1。第6天, 对照组中油脂含量从44.3%增加到48.4%, 黄腐酸诱导作用下, 油脂含量达到54.3%, 是对照组的1.1倍。蛋白质、叶绿素、脂类等是藻细胞的主要成分。在异样培养的Chlorella vulgaris中, 碳水化合物的含量从55.3%下降到32.8%, 而脂质从9.10%增加到28.9%, 蛋白质从32.2%增加到34.8%, 叶绿素从1.22 %增加至2.26% (Han et al, 2012)。研究表明, 外源添加甜菜碱能使微藻油脂含量显著增加, 而生物量保持基本不变(Zhao et al, 2016)。诱导后期, 油脂含量呈下降趋势, 但与对照组相比增加显著(P<0.05)。本实验结果表明, 黄腐酸可以显著促进微藻油脂的积累。

图 1 黄腐酸诱导微藻中油脂含量的变化 Fig. 1 Changes in oil content in microalgae induced by fulvic acid
2.2 黄腐酸对微藻生长的影响

图 2显示了黄腐酸诱导作用下微藻生物量的变化趋势。诱导过程中, 对照组与诱导组的生物量无明显差异。诱导前6天生长缓慢, 第10天时, 诱导组和对照组细胞浓度从1.83g/L分别增加到2.29和2.28g/L。Zhao等(2016)Monoraphidium sp. QLY-1的研究表明, 外源添加甜菜碱诱导培养, 微藻的生物量基本保持不变。本实验中诱导培养至第10天时, 实验组和对照组的生物量分别增加了25.14%和24.60%。实验结果表明, 外源添加黄腐酸诱导培养, 不能增加单针藻Monoraphidium sp. FXY-10的生物量。

图 2 黄腐酸诱导对微藻生物量的影响 Fig. 2 Effect of fulvic acid on the biomass of microalgae
2.3 黄腐酸诱导培养对单针藻蛋白质和叶绿素的影响

光合作用固定的CO2可用来合成碳水化合物、脂质、蛋白质等生物大分子。研究表明, 在受到环境胁迫时, 细胞可能会合成逆境蛋白用以抵抗环境(王赛君等, 2017)。黄腐酸诱导作用下, 单针藻中蛋白质含量从31.4%增加到39.7%, 第2、4、6、8天时的蛋白质含量分别是31.4%、32.7%、33.7%, 和38.8%;对照组中的蛋白质含量从28.8%增加到38.9%。(图 3)。有研究表明, 异养种子自养培养, 在最初的几个小时内, 蛋白质迅速积累, 然后缓慢增加, 最终达到55% (Fan et al, 2012)。添加植物生长调节物质, 可以提高饵料微藻中蛋白质的含量(周辉等, 2003)。小球藻在光自养培养的条件下, 迅速启用光合作用, 合成蛋白质和叶绿素, 从而快速提高了小球藻蛋白质和叶绿素的含量(魏东等, 2017)。外源添加黄腐酸, 可显著(P<0.05)提高单针藻中的蛋白质含量。

图 3 黄腐酸诱导单针藻蛋白质的变化趋势 Fig. 3 Changes in algae protein that induced by fulvic acid

图 4表明, 黄腐酸诱导培养第6天, 叶绿素含量迅速增加至21.46μg/mL, 然后缓慢增长, 最终达到23.06μg/mL; 对照组中, 叶绿素含量从5.25μg/mL增加到23.88μg/mL。由于细胞浓度不断增加, 阻碍了光进入培养基内部, 微藻光合作用降低, 叶绿素的积累变缓。减少氮、磷两种元素含量, 会抑制微藻中叶绿素的积累(王昭玉等, 2013)。在氮缺陷的条件下, 微藻细胞内叶绿素不能正常合成(Fan et al, 2014b)。本实验结果表明, 黄腐酸诱导培养不会影响单针藻细胞内叶绿素的合成。

图 4 微藻中叶绿素含量的变化趋势 Fig. 4 The trend of change in chlorophyll content in microalgae
2.4 黄腐酸对单针藻Monoraphidium sp. FXY-10细胞内酶活的影响

ACCase、ME、PEPC的活性影响油脂的合成与积累, 是油脂合成过程中的关键性酶(Sugimoto et al, 1989; Shintani et al, 1995; Courchesne et al, 2009; 丁柯等, 2016)。将胞质溶胶ACCase导入油菜叶绿体中, 提高了成熟种子中ACCase的活性, 含油量增加5% (Roesler et al, 1997)。图 5显示了ACCase活性的变化趋势。黄腐酸诱导培养显著(P<0.01)提高了ACCase的活性。诱导培养第4天, ACCase的活性最高(152μmol/h/g), 第6天下降至131μmol/h/g, 然后逐渐上升。ACCase处于活跃的还原状态时, 催化脂肪酸的合成, 处于不活跃的氧化状态, 催化效率较低(王伏林等, 2006)。藻中ACCase的活性受到反馈抑制时, 脂肪酸合成速率下降(Shintani et al, 1995)。黄腐酸上调ACCase的活性, 有利于微藻油脂的积累。

图 5 黄腐酸诱导作用下ACC酶活性的变化 Fig. 5 Activity of ACC enzyme under the induction of fulvic acid

图 6显示了黄腐酸诱导培养过程中ME活性的变化趋势。诱导培养第2天, ME的活性(3.66mmol/min/g)比对照组(1.73mmol/min/g)提高了1.12倍, 第4天是对照组(0.24mmol/min/g)的3.4倍。焦进安(1987)指出, PEPC、ME和苹果酸脱氢酶组成的羧化-脱羧化系统称为植物细胞的生物化学pH稳定器, 有利于TCA循环不断地将苹果酸释放出的CO2转化为光合产物。研究发现, 在产油微生物油脂合成代谢调控中, ME为脂肪酸合成提供NADPH (还原型辅酶Ⅱ)(Song et al, 2001)。ME活性的增强可以促进油脂的快速积累(Courchesne et al, 2009)。而第6天ME活性降低, 但依然高于对照组, 这与ACCase活性及藻细胞油脂的变化保持一致(图 5, 图 1)。诱导后期, 微藻的快速生长导致培养基中CO2浓度下降, 藻细胞光合作用降低, ME活性下降, 使得微藻利用储备的油脂供给自身生长需求, 从而导致油脂含量下降(Davis et al, 2017; Xue et al, 2015)。本实验结果表明, 黄腐酸诱导培养下, ME的活性显著(P<0.05)增强。

图 6 黄腐酸诱导对ME活性的影响 Fig. 6 Effect of fulvic acid on ME activity

PEPC是植物光合作用、呼吸作用中的关键性酶, 催化磷酸烯醇式丙酮酸在体内转化为苹果酸或天冬氨酸(焦进安, 1987)。即便是在CO2浓度很低的情况下, PEPC也有很强的固定CO2的能力(Davies, 1980)。PEPC活性变化如图 7所示, 诱导组中PEPC活性变化趋势与对照组一致。与对照组相比, 诱导培养第2天, PEPC的活性降低最少(29%), 第6天活性最低(139 nmol/min/g), 下调44%。诱导培养前期, PEPC活性较高, 有利于微藻固定CO2, 进行光合作用。第6天, PEPC活性下调, 研究表明, pepc表达量降低可以促进植物、微生物等物种中甘油三酯的生物合成(Sugimoto et al, 1989; Fan et al, 2012)。随着油脂的积累, pepc的表达量逐渐降低, 特别是在油脂积累后期尤为明显(Fan et al, 2014a)。外源添加黄腐酸诱导培养, PEPC的活性下调, 有利于微藻油脂的积累。

图 7 黄腐酸诱导作用下PEPC活性的变化 Fig. 7 Changes in the activity of PEPC under the induction of fulvic acid
3 结论

Monoraphidium sp. FXY-10是一种生产生物柴油的良好原料。外源添加黄腐酸(25mg/L)诱导培养, 微藻生物量和叶绿素无显著变化, 藻细胞内蛋白质含量出现不同程度的上调。培养至第6天, 油脂含量高达54.3%, 是对照组的1.12倍。此外, 诱导过程中, ME、ACCase活性上调, PEPC活性下调, 这些变化都和藻细胞中油脂积累有关。在黄腐酸的诱导下, 与油脂合成相关的分子机制值得进一步的研究。

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