青蛤(Cyclina sinensis)是我国的一种常见的海滨底栖双壳类软体动物(庄启谦, 2001)。其可食用部位味道鲜美, 兼有一定的药用功能。然而, 最近几年青蛤养殖在我国面临诸多困境。随着国内青蛤养殖规模的逐年扩大、种群密度的增加, 以及由于环境污染导致的养殖环境的不断恶化, 导致青蛤出现了种质衰退的现象, 甚至有些养殖体已显现出由鳗弧菌等海洋病原微生物引起的疾病等症状, 这些因素都已在我国沿海地区造成青蛤的大面积死亡现象(王斌等, 2002)。

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)隶属于弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌属(Vibrio), 其为有鞭毛的革兰氏阴性细菌。鳗弧菌是一种引起水产养殖动物病害的重要病原微生物(吴后波等, 2003)。它普遍在近岸及河口海水中生存, 还有一些存在海洋生物的体表及肠道中, 当水产养殖动物在一定环境条件下遭遇不利刺激或是受伤时, 就会导致各种疾病的产生。青蛤是一种典型的无脊椎动物, 当遭受到病原体的侵害时它只能行使先天的非特异性免疫功能, 这也是大部分无脊椎动物抵御病原体的方式之一, 它们通过启动非特异性免疫机制来抵御外界的伤害, 从而使种群得到长久的生存和发展。

本实验从分子生物学角度对鳗弧菌侵染青蛤展开的各项研究也进一步为阐明青蛤的致病机理提供相应的理论依据。IKK (inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase)即IκB激酶, 位于NF-κB信号通路, 参与了由细胞因子引起的细胞内免疫反应, 是一种典型的免疫相关基因。IKK的激活使IκB被磷酸化, IκB从NF-κB上脱落并被泛素化, 使得NF-κB由抑制状态变为激活状态, 然后NF-κB转位入核并激发一系列的反应(闫晓霞等, 2016)。

青蛤的健康养殖抗病害机制及其免疫调控的研究迫在眉睫, 本研究不仅可以为解决青蛤在养殖过程中出现的死亡现象提供初步的理论研究结果, 也可以为进一步研究青蛤及其他软体动物的免疫抗病机制积累重要的实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

活体青蛤(Cyclina sinensis)暂养于密度1.02— 1.04g/cm³的中性海水中, 持续供氧, 水温22℃左右(杨莹等, 2015)。投喂5‰小球藻。饲喂大约7d, 选取体表完好, 个体形态差别较小的青蛤(平均壳宽19.12mm±0.56mm, 平均壳长29.13mm±1.22mm, 平均壳高29.51mm±1.46mm)进行分组实验。

1.2 方法 1.2.1 实验菌液的制备

将实验室中保存的鳗弧菌(Vibrio anguillarum)于2216E培养基中在28℃条件下培养24h (魏星等, 2015), 用以无菌海水洗脱三次, 重悬菌体, 将以上菌液浓度调至OD₆₀₀=0.4。

1.2.2 青蛤转录组文库的构建与基因克隆

将提取的青蛤的六个组织于液氮中研磨充分后, 置于1mL Trizol中提取组织的总RNA。按照QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits法分离纯化总RNA(高晶等, 2015)。用随机引物逆转录法将纯化后的RNA反转录成cDNA。将得到的cDNA末端修饰、加尾等, 用以制备整个文库。采用Unigene编码蛋白框ORF预测分析去冗余后的数据(吴婷等, 2010), 再经BLAST分析后, 从中筛选得到青蛤IKK基因类似序列。再利用筛选得到的青蛤IKK基因类似序列进行克隆, 设计克隆时所用引物CsIKK-F、CsIKK-R, 见表 1。

1.2.3 青蛤IKK基因生物信息学分析

将克隆得到的青蛤IKK基因类似序列与GenBank核酸数据库进行BLASTX比对分析; 采用ORF Finder预测软件对CsIKK基因的开放阅读框进行预测; 利用ExPASy软件分析以上两个基因指导合成的蛋白质的性质; 使用ProtParam工具在线分析它们的分子式、分子量以及等电点(宋林生, 2005);用SMART软件查找两个蛋白质的结构域并预测信号肽(阎斌伦等, 2009);用ClustalX1.83软件对这个氨基酸序列分别与其他物种中的氨基酸序列进行比对(李姣, 2015), 并使用MEGA 5.0构建IKK基因的分子系统树(孟学平等, 2011), 分析基因进化的亲缘关系。

1.2.4 IKK基因在青蛤各组织内的表达

随机选取表面无损伤且生理状态良好的10只青蛤, 解剖找到青蛤的肝脏、性腺、血淋巴、闭壳肌、腮、外套膜六个组织, 每个组织分别称取50mg后放入液氮中冷冻备用(潘宝平等, 2010)。利用Trizol法提取青蛤血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌、性腺和鳃的总RNA, 后反转成cDNA, 放入–20℃保存备用。以合成的样品为模板, 利用PCR技术在体外大量扩增青蛤的β-actin基因来检测逆转录结果。PCR程序为:预变性94℃ 5min→94℃ 30s (高温变性), 60℃ 30s (低温复性), 72℃ 30s (中温延伸), 进行30次循环→延伸72℃ 10min。

1.2.5 鳗弧菌刺激下CsIKK基因在血淋巴内的时序性表达

选取两组实验青蛤, 分别作为实验组和对照组。在对照组的青蛤体内注射灭菌的0.9%的氯化钠溶液50μL, 在实验组的青蛤闭壳肌内注射鳗弧菌菌液50μL, 在注射后的0h、3h、6h、9h、12h、24h、48h和96h分别对其血淋巴进行提取(宋欣等, 2010), 放置备用。利用Trizol法提取青蛤被鳗弧菌侵染后各时间点血淋巴的总RNA, 反转录成cDNA。荧光定量PCR引物为RT-CsIKK-F, RT-CsIKK-R (表 1)。采用2^–ΔΔCT法进行数据处理, 并使用SPSS软件对数据进行分析(王孟强, 2010)。

2 结果 2.1 青蛤IKK基因的结构

青蛤IKK基因cDNA的ORF为2298bp, 编码765个氨基酸(如图 1), 预测其理论分子量为87.38kDa, 理论等电点pI=7.18, 分子式为C₃₈₆₇H₆₁₈₂N₁₀₆₂O₁₁₅₇S₄₁, 氨基酸组成中亮氨酸含量最高, 占10.7%。氨基酸序列中无信号肽和跨膜区结构。通过SMART在线分析蛋白结构中存在一个典型的S_TKc结构域(10— 265aa)。本研究的基因在GenBank登陆注册, CsERK注册号KX840341。

2.2 青蛤IKK基因的同源性分析

将青蛤IKK基因的氨基酸序列与其他14个物种进行同源性比对, 并通过MEGA构建的系统树结果(如图 2)显示青蛤IKK基因的氨基酸序列与软体动物中贝类的亲缘关系较近, 如霸王莲花青螺(XP_ 009045496)等, 而鱼类的IKK基因独立成一支, 如滇池金线鲃(XP_016098582)和文昌鱼(AFS65343)等, 与节肢动物中的昆虫, 如黑腹果蝇(AAF55267)亲缘关系较远。由此表明青蛤IKK基因的分子生物学特性与软体动物在分类学上的进化地位保持一致性(王琳楠等, 2013)。

2.3 青蛤IKK基因的表达分析

以β-actin基因为对照, 采用实时荧光定量PCR的方法, 以各组织提取的RNA反转录得DNA为模板, 对青蛤的外套膜, 闭壳肌、鳃、肝脏、性腺和血淋巴六种组织进行基因的表达量测定, 结果如图 3所示。根据数据我们得到, CsIKK基因在青蛤的取出的六个代表组织中均可表达, 但表达水平差异显著。其中CsIKK基因表达量最高的组织为血淋巴, 剩下依次为闭壳肌、外套膜、肝脏、鳃; CsIKK基因在性腺中的表达量最低。

2.4 鳗弧菌胁迫时CsIKK的时序性表达情况

以β-actin基因作为内参, 注射等量的灭菌海水组作为对照。青蛤在不同时间点鳗弧菌侵染后, 通过利用实时荧光定量PCR检测0h, 3h, 6h, 12h, 24h, 48h, 96h几个不同时间点血淋巴中CsIKK表达量变化。使用SPSS软件对荧光定量PCR所得数据进行分析, 采用2^–ΔΔCT法进行处理作图, 结果如图 4所示。对照组内参基因表达量基本稳定, 实验组CsIKK表达量在3h时开始呈升高趋势, 在6h时表达量达到顶峰, 12h后开始回落并逐渐趋于稳定, 在96h基本恢复至原始水平, 与β-actin基因在对应时间点的表达量相比有较大波动, 且有显著差异。

3 讨论 3.1 CsIKK基因的分子生物学研究及表达分析

近年来, 利用分子免疫学方法探索软体动物先天免疫相关报道日渐增加。本研究通过构建的青蛤转录组文库筛选出青蛤IKK基因的类似序列, 利用分子克隆、基因表达等方法同时结合生物信息学分析的方法对青蛤的免疫机制进行了初步探索。分析了青蛤IKK基因在青蛤各个组织中的表达情况。结果发现, 该基因在青蛤血淋巴、性腺、鳃、闭壳肌、外套膜和肝脏这六个组织中都有表达。数据显示IKK基因在血淋巴中的表达量与其他组织有显著性差异, 在血淋巴中的表达量最高, 表明CsIKK在抵御病原物入侵的过程中发挥着重要作用(Wang et al, 2011)。在青蛤的其他免疫通路相关基因的研究中发现, 在血淋巴中的表达量也均明显高于闭壳肌性腺等其他组织, 例如青蛤的IRAKs家族中的白介素-1受体相关激酶-4 (Interleukin-1 receptor-associated kinases-4)基因和MAPKS家族中的丝裂原活化蛋白激酶(MAP kinase)基因。软体动物属于开放的血液循环系统, 该系统在无脊椎动物的防御机制中发挥着至关重要的作用(Stefano et al, 1999)。贝类免疫主要为非特异性免疫, 在青蛤体内, 血细胞能产生体液因子, 例如凝集素, 非特异性水解酶、抗菌肽等调控因子。因此, 血液在青蛤的免疫系统中起到重要作用, 众多贝类免疫相关基因在血淋巴的表达量显著高于其他组织。

3.2 CsIKK基因的免疫分析

Toll样受体信号通路上的各种免疫因子的最重要的功能就是区分和识别各种病原物的入侵同时发挥各因子自身的调控作用(Qiu et al, 2007; Montagnani et al, 2008; Ge et al, 2011; Zhang et al, 2011)。鳗弧菌是一种引起水产养殖动物病害的重要病原微生物。它普遍在近岸及河口海水中生存, 还有一些存在海洋生物的体表及肠道中, 当水产养殖动物在一定环境条件下遭遇不利刺激或是受伤时, 就会导致各种疾病的产生。鳗弧菌的宿主范围极广, 致病条件及环境并不苛刻, 所以鳗弧菌致病后常常会造成大面积的疾病暴发情况, 引起大规模死亡现象, 给水产养殖业带来巨大的经济损失。本实验选用革兰氏阴性菌的鳗弧菌作为致病菌代表刺激青蛤, 在体外鳗弧菌模拟刺激后检测CsIKK在青蛤血淋巴中表达量的变化。结果显示, 在鳗弧菌刺激后CsIKK的表达量在3h时开始升高, 6h达到顶峰, 12h后开始回落, 最终在96h基本恢复至原始水平。鳗弧菌刺激后CsIKK基因与β-actin对比有大范围波动, 鳗弧菌入侵一段时间后该基因有明显升高现象, 证明CsIKK基因与青蛤的先天性免疫防御有关, 参与了青蛤的免疫应答反应, 并且对于革兰氏阴性细菌的侵入有一定的识别作用。在鳗弧菌侵入青蛤机体时, Toll样受体通路上的一系列免疫相关因子如TLR2、IRAK-4、MyD88等基因在一定时间内均发现发生了上调表达(任毅鹏等, 2014)。在青蛤受到鳗弧菌侵染后会引起先天免疫通路的应答, 通路上的相关因子相继开始运作抵御病原体入侵。IKK基因是NF-κB免疫通路中的重要基因, CsIKK对于鳗弧菌刺激的反应也说明青蛤体内存在NF-κB所介导的信号通路。

4 结论

本研究获得了CsIKK基因的cDNA序列, 采用生物信息学方法对该基因进行整合分析, 得到了CsIKK基因的分子式, 分子量、等电点、编码氨基酸等相关数据; 并通过NJ法利用CsIKK基因编码的氨基酸序列构建系统发育树, 完成同源性分析。利用实时定量PCR技术获得该基因在青蛤6个不同组织内的表达情况, 以及在病原菌胁迫下的时序性表达分析, 初步得出结论, 该基因参与青蛤免疫应答系统的调控, 对其抵御病原菌侵染有重要作用。

近年来, 青蛤病害在我国多地连年暴发, 相关产业亟待探索其抗病害机制和防治措施。本文通过研究青蛤NF-κB信号通路上的相关免疫因子IKK基因, 结合生物信息学, 分子系统学及分子免疫学手段, 为探索青蛤先天免疫通路调控机制的研究提供了有价值的实验数据, 也为青蛤养殖的病害防治提供了一定的理论基础。